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蛋白质印迹缓冲液和母液

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蛋白质印迹缓冲液和母液
RIPA 缓冲液
RIPA 缓冲液含有离子去垢剂脱氧胆酸钠作为活性成分，特别适用于破坏核膜提取细胞核内物质。

RIPA 缓冲液产生的背景低，但可使激酶变性。

它还能破坏蛋白质与蛋白质的相互作用，因此可能会给免疫沉淀分析和pull-down实验带来一些问题。

50 mM Tris HCl，pH 8.0
150 mM NaCl
1% NP-40
0.5% 脱氧胆酸钠
0.1% SDS
10% 脱氧胆酸钠母液（5 g 脱氧胆酸钠溶于50 mL 溶液中）避光保存。

NP-40 缓冲液
20 mM Tris HCl，pH 8.0
137 mM NaCl
10% 甘油
1% NP-40
2 mM EDTA
细胞骨架结合蛋白提取缓冲液
10 mM Tris，pH 7.4
100 mM NaCl
1 mM EDTA
1 mM EGTA
1 mM NaF
20 mM Na4P2O7
2 mM Na3VO4
1% Triton X-100
10% 甘油
0.1% SDS
0.5% 脱氧胆酸盐
可溶蛋白缓冲液
20 mM Tris-HCl，pH 7.5
1 mM EGTA（Ca2+螯合剂）
制备原钒酸钠
所有流程必须在通风橱中进行。

1. 用双蒸水制备100 mM 原钒酸钠溶液
2. 用HCl 将pH 调节至9.0
3. 煮沸至无色
4. 冷却至室温
5. 再次将pH 调节至9.0
6. 再次煮沸至无色
7. 重复以上循环，直到煮沸并冷却溶液之后的pH 保持9.0
8. 用水补至初始体积
9. 分装之后保存于-20 ℃
10. 如果样品变黄，丢弃样品
避免煮沸期间体积变化过大，可用盖子稍微盖住容器上方，减少蒸发。

TBS 10×（浓缩Tris 缓冲盐溶液）
1 L 溶液：
24 g Tris 碱（式量：121.1 g）
88 g NaCl（式量：58.4 g）
溶于900 mL 蒸馏水中
用12 N HCl 将pH 调节至7.6
加入蒸馏水至终体积为1 L
要制备1×溶液，将1 份10×溶液与9 份蒸馏水混合，并再次将pH 调节至7.6。

1×溶液的最终摩尔浓度为20 mM Tris 和150 mM NaCl。

Tris 缓冲液的替代配方同时含有Tris 碱和Tris-HCl。

这可避免大量使用具有潜在危险性的盐酸来中和单独的Tris 碱。

TBS 10×替代配方（浓缩Tris 缓冲盐溶液）
1 L 溶液：
24 g Tris-HCl（式量：157.6 g）
5.6 g Tris 碱（式量：121.1 g）
88 g NaCl（式量：58.4 g）
溶于900 mL 蒸馏水中
1. 在室温下将溶液pH 调节至约7.6。

如果溶液过碱，用浓HCl 将pH 调节至7.6；如果溶液过酸，用浓NaOH 将pH 调节至7.6。

2. 加入蒸馏水至终体积为1 L。

3. 要制备1×溶液，将1 份10×溶液与9 份蒸馏水混合，并再次将pH 调节至7.6。

4. 1×溶液的最终摩尔浓度为20 mM Tris 和150 mM NaCl。

TBST（Tris 缓冲盐溶液，0.1% Tween 20）
1 L 溶液：
100 mL TBS 10×
900 mL 蒸馏水
1 mL Tween 20
中强膜再生液
15 g 甘氨酸
1 g SDS
10 mL Tween 20
1. 用超纯水将体积调节至800 mL。

2. 将pH 调节至2.2。

3. 加蒸馏水至1 L。

高强膜再生液
需要在通风橱中进行。

100 mL 溶液：
20 mL SDS 10%
12.5 mL Tris HCl，pH 6.8，0.5 M
67.5 mL 蒸馏水
在通风橱中加入0.8 mL β-巯基乙醇
细胞核分离实验方案试剂缓冲液 A
10 mM HEPES
1.5 mM MgCl2
10 mM KCl
0.5 DTT
0.05% NP-40（或0.05% Igepal 或Tergitol），pH 7.9
要制备250 mL 缓冲液A 的母液：
HEPES：1 M = 238.3 g/L，因此10 mM = 0.59 g/250 mL MgCl2：1 M = 203.3 g/L，因此1.5 mM = 0.076 g/250 mL KCl：1 M = 74.5 g/L，因此10 mM = 0.187 g/250 mL DTT：1 M = 154.2 g/L，因此0.5 mM = 0.019 g/250 mL NP-40：0.05%
细胞核分离实验方案试剂缓冲液 B
5 mM HEPES
1.5 mM MgCl2
0.2 mM EDTA
0.5 mM DTT
26% 甘油(v/v)，pH 7.9
要制备250 mL 缓冲液B 的母液：
HEPES：1 M = 238.3 g/L，因此5 mM = 0.295 g/250 mL MgCl2：1 M = 203.3 g/L，因此1.5 mM = 0.076 g/250 mL EDTA：1 M = 372.2 g/L，因此0.2 mM = 0.0186 g/250 mL DTT：1 M = 154.2 g/L，因此0.5 mM = 0.019 g/250 mL 26% 甘油(v/v) = 65 mL
TBS 0.025% Triton X-100
1 L 溶液：
250 µL Triton X-100
1 L TBS，pH 7.6–7.8
1.6% H2O2（过氧化氢）的TBS 溶液400 mL 溶液：
6.4 mL H2O2 (GPR = 30% w/w)
393.6 mL TBS，pH 7.6–7.8
一抗的TBS 溶液（含1% BSA）
以使用稀释度为1:10 的一抗为例。

1 mL 溶液：
100 µL 一抗
10 mg BSA
900 µL TBS，pH 7.6–7.8
生物素化二抗的TBS 溶液（含1% BSA）
以使用稀释度为1:200 的生物素化二抗为例。

1 mL 溶液：
5 µL 生物素化二抗
995 µL TBS，pH 7.6–7.8
ABC（抗生物素-生物素复合物）的TBS 溶液
以每种组分的使用稀释度为1:100 的ABC 为例。

1 mL 溶液：
10 µL 链霉亲和素
10 µL HRP（或AP）-生物素
980 µL TBS，pH 7.6–7.8
碳酸氢盐/碳酸盐包被缓冲液(100 mM)
3.03 g Na2CO3
6.0 g NaHCO3（1 L 蒸馏水），pH 9.6
PBS：1.16 g Na2HPO4
0.1 g KCl
0.1 g K3PO4
4 g NaCl（500 mL 蒸馏水），pH 7.4。

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蛋白质印迹(Western blot)样品制备

蛋白质印迹(Western blot)样品制备

蛋白质印迹（Western blot）样品制备蛋白质印迹样品制备，包括裂解缓冲液、细胞培养物裂解物、组织裂解物的制备以及蛋白质浓度的测定。

目录∙裂解缓冲液∙蛋白酶和磷酸酶抑制剂∙制备细胞培养物裂解物∙制备组织裂解物∙测定蛋白质浓度∙制备用于凝胶上样的样品：变性样品和天然样品，还原样品和非还原样品裂解缓冲液不同裂解缓冲液溶解蛋白质的能力各不相同，其中含有十二烷基硫酸钠(SDS) 和其它离子去污剂的裂解缓冲液被认为具有最强的溶解能力，因此最有可能获得最高得率。

选择裂解缓冲液的主要考虑因素是确保所选抗体能够识别变性样品。

如果抗体无法识别变性样品，抗体数据表会加以说明，这种情况下应使用不含去污剂或含有相对温和的非离子去垢剂(NP-40、Triton X-100) 的裂解缓冲液。

裂解缓冲液配方：NP-40 缓冲液∙150 mM 氯化钠∙ 1.0% NP-40（可用Triton X-100 替代NP-40）∙50 mM Tris，pH 8.0这是研究细胞质蛋白、膜结合蛋白或全细胞提取物的常用一种缓冲液。

如果担心目标蛋白不能从不溶材料或聚集体中完全提取出来，那么利用RIPA 缓冲液更适合，因为其中所含的离子去垢剂更容易使蛋白质溶解。

RIPA 缓冲液（放射免疫沉淀分析缓冲液）∙ 150 mM 氯化钠∙ 1.0% NP-40 或Triton X-100∙0.5% 脱氧胆酸钠*∙0.1% SDS（十二烷基硫酸钠）∙50 mM Tris，pH 8.0*可制备成10% 的母液，避光保存。

RIPA 缓冲液适用于全细胞提取物和膜结合蛋白，而且其提取细胞核蛋白的效果比仅含NP-40 或Triton X-100 的缓冲液的效果更好。

但它会破坏蛋白质与蛋白质的相互作用，因此可能会给免疫沉淀分析和pull-down实验带来一些问题。

如需保护蛋白质与蛋白质的相互作用，或需最大限度避免蛋白质变性，应使用不含离子去垢剂（例如SDS）的缓冲液，理想的缓冲液中还不应含有非离子去垢剂（例如Triton X-100）。

蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项

蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项

蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。

收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。

根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。

因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。

BCA法。

2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。

100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。

煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。

煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。

蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。

(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。

然后垂直卡在架子上准备灌胶。

（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。

）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。

免疫印迹实验步骤及问题解决

免疫印迹实验步骤及问题解决

免疫印迹实验步骤及问题解决一、实验步骤试剂和缓冲液1x RIPA 缓冲液: 50 mM Tris，150 mM NaCl，0.1% SDS，0.5% SDS，1% Triton X-100 或NP40. 1x PBS 缓冲液: 137 mM NaCl，2.7 mM KCl，2.7 mM Na2HPO4，2.7 mM KH2PO4，pH 7.4 BCA或Bradford蛋白分析试剂盒1.5 M Tris缓冲液（pH 8.8）: 90.68 g Tris-HCl to ddH2O，500 ml溶液pH调节到8.81.0 M Tris缓冲液（pH 6.8）: 60.58 g Tris-HCl to ddH2O，500 ml溶液pH调节到6.810% APS: 100 mg AP 溶于1 ml ddH2O。

用前准备10% SDS: 10 g SDS溶于100 ml ddH2O。

1x Tris-甘氨酸电泳缓冲液: 25 mM Tris，230 mM 甘氨酸（pH 8.3），0.1% SDS。

3x SDS蛋白加样缓冲液: 150 mM Tris （pH 6.8），6% SDS，30% 甘油，30 mM EDTA和0.2% 溴酚蓝1x TTBS: 25 mM Tris（pH 7.5）: 0.15 M NaCl，0.05% Tween-20，0.001% 硫柳汞1x 转移缓冲液: 3 g Tris，14.4 g甘氨酸和200 ml甲醇，加ddH2O 到1L样品准备细胞培养样品贴壁细胞去除培养基，用1X PBS冲洗去掉残留培养基加入预冷的400 ul-1 ml 1X RIPA缓冲液/100 mm平皿。

在冰上孵育5-10 min。

完全刮下细胞并转移到在冰上预冷的1.5 ml离心管中。

（可选）充分混匀或超声处理。

4°C下12,000 rpm离心10-15 min并收集上清总蛋白用前需储存在-20°C。

蛋白印记操作流程

蛋白印记操作流程

蛋白印记操作流程样品准备是蛋白印记的第一步。

研究人员需从细胞或组织中提取蛋白质，常用的提取方法包括裂解缓冲液处理。

裂解缓冲液通常含有去污剂和蛋白酶抑制剂，以确保蛋白质的完整性。

样品处理后，应通过离心去除细胞碎片，收集上清液，并测定蛋白质浓度，确保后续实验所需的浓度一致。

转移完成后，需对膜进行封闭处理。

膜表面会有非特异性结合位点，封闭步骤是为了减少背景信号，增强信号的特异性。

通常使用含有牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉的封闭缓冲液，封闭时间一般为1小时至过夜，具体可根据实验要求进行调整。

封闭后，膜被处理以添加一抗，即针对目标蛋白的特异性抗体。

该步骤通常在4℃下进行过夜，或在室温下进行1至2小时。

膜上的抗体与目标蛋白结合后，需进行洗涤，以去除未结合的抗体。

洗涤步骤通常使用含有Tween20的PBS或TBST缓冲液进行多次清洗，以降低背景信号。

随后，添加二抗，该抗体与一抗结合，通常为与一抗相对应的抗体，标记有酶或荧光染料。

二抗的结合时间和条件应根据抗体的特性进行优化。

结合后，同样需要进行多次洗涤，以确保特异性。

在完成洗涤后，进行信号检测。

若二抗标记有酶，需添加相应底物，底物与酶反应产生可检测的信号。

信号的强度与目标蛋白的表达量成正比。

检测方式可根据具体实验需求选择，包括化学发光、荧光或比色法等。

结果分析是蛋白印记流程的关键环节。

通过成像系统获取膜上的信号图像，分析软件可用于量化信号强度。

研究人员需对信号进行归一化处理，以消除实验间的变异，通常选择内参蛋白作为对照。

样品准备的环节中，选择合适的裂解缓冲液至关重要。

不同类型的细胞或组织可能需要不同的裂解条件。

例如，某些蛋白质可能对特定的去污剂敏感，因此需要根据具体情况调整裂解液成分。

添加适量的蛋白酶抑制剂可以有效防止在提取过程中的蛋白质降解，这一点在处理易降解的蛋白质时尤为重要。

在凝胶电泳的步骤中，凝胶的浓度选择会直接影响蛋白质的分离效果。

通常情况下，较高浓度的凝胶适用于小分子量蛋白质的分离，而较低浓度的凝胶则更适合大分子量蛋白质。