冰冻切片免疫荧光方法1

免疫荧光－冰冻切片间接法
免疫荧光法实验——冰冻切片
间接法
【标本】正常肝、肝癌标本冰冻切片
【抗体和试剂】
（1）荧光标记抗体：兔抗人LAPTM-4B-N端（胞浆内）一抗；羊抗兔IgG-TRITC二抗；小鼠抗人integrin α6 McAb；小鼠抗人EGFR多抗
（小鼠抗人EGFR单抗）；羊抗鼠IgG-FITC二抗（工作浓度为1:30）；
（2）0.01mol/L pH7.4 PBS
（3）2%BSA：用于配制一抗及封闭非特异性结合位点（可用正常羊血清封闭非特异性结合位点）
（4）缓冲甘油封片：1份0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液与9份甘油混合
0.2mol/L PB：X ml 0.2mol/L Na2HPO4 + Y ml 0.2mol/L NaH2PO4
pH8.0 X=94.7ml; Y=5.3ml
【染色步骤】
1．冰冻切片室温丙酮（冷丙酮）固定10min，PBS洗5min×3；
2．2％BSA37︒C封闭60min或4︒C过夜；
3．置切片于湿盒内，分别滴加一抗37︒C 30min；
4．PBS洗5min×3；
5．分别滴加二抗37︒C 30min；
6．PBS洗5min×3；
7．若染核；用1μg/ml Hoechst33342染色10min；PBS洗5min×3；
8．缓冲甘油封片；
9．荧光显微镜下观察或-20℃避光保存；。

冰冻切片免疫荧光直接一抗操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor.I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!冰冻切片免疫荧光直接一抗操作流程详解在生物医学研究中，冰冻切片免疫荧光技术是一种常用的方法，它能帮助我们观察和分析细胞或组织中的特定蛋白质。

冰冻切片免疫荧光染色流程(表面分子，以CD4为例)（1）冰冻切片室温晾干15分钟；（2）用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT；（3）用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）；（4）加入CD4单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA)，4℃孵育过夜；（5）PBS洗3次，每次10分钟；（6）加入罗丹明标记的羊抗小鼠的IgG二抗(1:50; Sigma公司)，37℃孵育1小时；（7）PBS洗3次，每次15分钟；（8）封片后，荧光显微镜观察结果并拍照；（9）在每切片中随机选择5个视野计数阳性细胞数。

`注意事项：（1）整个实验过程中勿使表面干燥（2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光附注1：如目的分子为胞内分子，各种液体中需要加透膜剂0.3%TrixtonX100。

附注2：所用液体（表面分子染色不用0.3%TrixtonX100）：（1）pH7.4 0.01MPBS：配方为：0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl 7.65g0.1MPBS配方为：Na2HPO4 23g+NaH2PO4﹒2H2O5.9g+NaCl 17g定容至2000ml,高压，pH7.2-7.4（2）洗涤液：0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装15ml/支－20℃保存（3）封闭液：10％NGS－0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1.2ml/支－20℃保存（4）抗体稀释液：1％BSA－0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1ml/支－20℃保存一、操作方法及步骤：①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。

②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。

冰冻切片免疫荧光直接染色操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!冰冻切片免疫荧光直接染色操作流程一、准备工作阶段在进行冰冻切片免疫荧光直接染色之前，需要做好以下准备工作：1. 准备标本：首先，需要准备好需要进行染色的标本组织切片，并确保切片的完整性和干燥度。

实验报告3.因为相同种属的一抗具有相同的同种型抗原表位，因此一种与一抗不同种属的二抗可以结合多种一抗。

间接法荧光标记一方面节省标记成本，提高通用性；另一方面提高灵敏性，使信号更强。

但容易出现非特异染色，所以要用用与二抗同种的正常血清或白蛋白与组织孵育，封闭非特异位点。

4.注意：1）一抗和二抗是不同种属来源的抗体。

2）标记二抗与一抗必须是同一类（通常用的是抗人IgG）分、均匀，同时降低非特异结合或吸附）。

3）反应后用PBS洗3次，每次5分钟。

4）在冰浴中预先用0.1MPBS 配制荧光标记二抗。

5）切片甩干，擦去多余PBS。

滴加适量的二抗，盖好湿盒。

于37℃恒温培养箱孵育2小时。

注意加二抗过程及孵育过程中避光。

6）为更好显示细胞结构，一般用蓝色DAPI衬染，以确定所检测抗原的位置。

DAPI分装后，一般用锡纸包裹避光，-20℃保存，用时提前取出解冻。

7）在二抗孵育结束前8分钟，取出湿盒，滴加荧光染料DAPI，吹吸混匀，盖好湿盒。

于37℃继续孵育8分钟。

注意实验过程中避光。

8）二抗孵育结束后取出切片置于染缸中，0.01M pH7.4PBS浸泡。

9）置于37℃摇床中摇洗三次，每次15分钟。

摇床转速一般每分钟100转，摇洗过程注意避光。

4.封片1）免疫荧光技术常用封片剂：缓冲甘油封片剂。

2）将浸洗好的切片甩干，擦去多余水分。

滴加甘油封片剂，轻轻盖上盖玻片，防止出现气泡。

待干燥后在盖玻片周围涂指甲油封边5.镜下观察立即用荧光显微镜观察。

注意：一般标本在高压汞灯下照射超过3分钟，就有荧光减弱现象。

经荧光染色的标本最好在当天观察，随时间延长，荧光强度会逐渐下降。

冰冻切片免疫荧光实验步骤1. 前言嘿，朋友们！今天我们来聊聊一个科学实验的酷炫玩法——冰冻切片免疫荧光实验。

你可能会想，这听起来有点高深，其实没那么复杂，咱们用轻松的方式来搞定它！这个实验就像是给细胞穿上五光十色的衣服，让它们在显微镜下闪闪发光。

是不是听起来有点像魔法？不过，魔法背后可是需要一系列精细的步骤哦，接下来就让我们一起踏上这趟科学之旅吧！2. 材料准备2.1 器材首先，咱们得准备好一些“武器”。

你需要的工具有：冷冻切片机、显微镜、抗体、荧光染料、冰块、以及小瓶子。

别担心，这些东西在实验室里一般都能找到。

好比去超市购物，准备齐全才能大干一场嘛！2.2 样本收集然后，咱们得搞定样本。

可以用小动物的组织，比如小鼠的肝脏或脑组织，当然也可以是细胞培养。

像选菜一样，找个健康的样本，才能做出美味的实验结果。

记得小心翼翼哦，样本可是你实验的“主角”！3. 冰冻切片3.1 制作切片接下来就是最重要的环节了！将收集到的样本放进冷冻机，设置好温度，通常是在20°C到80°C之间，具体要看你使用的试剂。

等样本冰冻得像冰棍一样，取出来，用冷冻切片机将它切成薄薄的片，厚度大约在510微米之间。

要知道，切片越薄，观察的时候越清晰，就像看电影的时候画面越高清，效果自然越棒！3.2 贴片固定切好的薄片就像鲜花一样，需要“小心翼翼”地处理。

将切片放到载玻片上，记得用一些固定液，比如丙酮或者甲醇，给它们来个“定妆”！这样能让你的切片在后续步骤中更加稳固。

让我们给这些切片点个赞，做得不错哦！4. 免疫染色4.1 抗体孵育好了，接下来的步骤就像给细胞化妆一样。

把固定好的切片放进抗体溶液里，让它们充分“泡澡”。

通常来说，先用一抗（即特异性抗体）孵育，时间可以在1小时到过夜之间，视情况而定。

这个时候，你可以想象细胞们正开心地吸收着抗体，准备好接下来的“盛宴”！4.2 荧光染料待一抗充分结合后，咱们再来一剂“荧光染料”！同样把切片浸泡在二抗（荧光标记抗体）里，接着再静置一会儿。

冰冻切片免疫荧光染色流程(表面分子，以CD4为例)（1）冰冻切片室温晾干15分钟；（2）用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10分钟，以清除OCT；（3）用含10％正常山羊血清旳PBS室温封闭切片1 小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）；（4）加入CD4单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA)，4℃孵育过夜；（5） PBS洗3次，每次10分钟；（6）加入罗丹明标记旳羊抗小鼠旳IgG二抗(1:50; Sigma 公司)，37℃孵育1小时；（7） PBS洗3次，每次15分钟；（8）封片后，荧光显微镜观测成果并拍照；（9）在每切片中随机选择5个视野计数阳性细胞数。

`注意事项：（1）整个实验过程中勿使表面干燥（2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后旳洗涤过程中注意避光附注1：如目旳分子为胞内分子，多种液体中需要加透膜剂0.3%TrixtonX100。

附注2：所用液体（表面分子染色不用0.3%TrixtonX100）：（1）pH7.4 0.01MPBS：配方为：0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl 7.65g0.1MPBS 配方为：Na2HPO4 23g+NaH2PO4﹒2H2O5.9g+NaCl 17g 定容至ml, 高压，pH7.2-7.4（2）洗涤液：0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装15ml/支－20℃保存（3）封闭液：10％NGS－0.3% TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1.2ml/支－20℃保存（4）抗体稀释液：1％BSA－0.3% TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1ml/支－20℃保存一、操作措施及环节：①取材，未能固定旳组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最佳为24×24×2mm。

②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。

免疫荧光通用操作规程冰冻切片的免疫荧光1, 动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4C过夜后，OCT包埋。

-20C保存3月，-80C长期保存。

请勿保存于液氮。

2, 冰冻切片机切片至少10um,空气干燥2分钟后，-20C储存3, 切片从-20取出后，在通风橱放10-30分钟以去除水汽，4%PFA固定15分钟，或-20 C丙酮固定15分钟置通风橱2小时4, 1XPBS清洗玻片，3X5min从此请保持玻片湿润5, 有时，抗原修复3小时会得到更好的结果。

为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压•微波修复•高压修复•隔水加热•电炉加热）… 关注修复的温度，时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间），抗原修复液必须遵循自然降温规律，使用足量的抗原修复液… 选择不同PH值的修复液（A液枸盐酸缓冲液PH6.0, B液EDTA-Na缓冲液PH8.0, C液枸盐酸缓冲液PH4.5）6, 室温圭寸闭1小时封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS （细胞因子，无需圭封闭的蛋白7, 一抗4C过夜请用圭寸闭液稀释一抗8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min9, 二抗，1:1000 （alexa 系列）1:300 （dyelight ）in 封闭液，避光室温1小时10, Wash,1XPBS, 3x5mi n11, DAPI 染核5min ,12, DDW Rinse13, 抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜14, 干片后4C保存石蜡切片的免疫荧光1, 动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤），制成石蜡包块2, 组织学染色切片厚度2um,免疫荧光染色切片厚度至少6um,切片复水：58 °C 20mi n-xyle ne 2x10mi n-100%EtoH2x10mi n95%EtoH2x10mi n-70%EtoH10mi n-, DDW5mi n4, Rinse玻片IxPBS,从此请保持玻片湿润5, 抗原修复过夜。

免疫荧光通用操作规程冰冻切片的免疫荧光1, 动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4C过夜后，OCT 包埋。

-20C保存3月，-80C长期保存。

请勿保存于液氮。

2, 冰冻切片机切片至少10um,空气干燥2分钟后，-20C储存3，切片从-20 取出后，在通风橱放10-30 分钟以去除水汽，4%PFA 固定15分钟，或-20 C 丙酮固定15分钟置通风橱2小时4, 1XPBS 清洗玻片, 3X5min 从此请保持玻片湿润5, 有时,抗原修复3 小时会得到更好的结果。

为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压•微波修复•高压修复•隔水加热•电炉加热）… 关注修复的温度 ,时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间）,抗原修复液必须遵循自然降温规律, 使用足量的抗原修复液… 选择不同PH 值的修复液（A 液枸盐酸缓冲液PH6.0, B 液EDTA-Na缓冲液PH8.0, C液枸盐酸缓冲液PH4.5）6, 室温封闭1 小时封闭液：5%BSA+1 0%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in IxPBS （细胞因子,无需封闭的蛋白7, 一抗4C过夜请用封闭液稀释一抗8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min9, 二抗，1:1000 （alexa 系列）1:300 （dyelight ）in 封闭液，避光室温1 小时10, Wash,1XPBS, 3x5min11, DAPI 染核5min，12，DDW Rinse13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜14,干片后4C保存石蜡切片的免疫荧光1 ，动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤），制成石蜡包块2,组织学染色切片厚度2um,免疫荧光染色切片厚度至少6um,切片复水：58 °C 20mi n-xylene 2x10min-100%EtoH2x10min95%EtoH2x10min-70%EtoH10min-, DDW5min4, Rinse 玻片1xPBS, 从此请保持玻片湿润5，抗原修复过夜。

冰冻切片免疫荧光
1.处死实验动物，打开脑壳，避免损伤脑组织，
2.把把脑组织小心取出，放置于平皿中，取出目标部位；
3.用室温下的PBS或生理盐水漂洗目标部位1-3遍，把血液漂洗干净（血液导
致背景较高）；
4.小心把目标部位转移至滤纸上，小心把组织表面的溶液用滤纸吸干；
5.再把目标部位转移干燥平皿中，在-20℃或-80℃冻结（绝对避免用液氮冻结）
后，再把目标部位转移至管子中（绝对避免挤压组织，应使用硬性管子），做好相应标记，存储于-20℃或-80℃（绝对避免复融，如需进行其他实验，组织应在冻结前分切好）；
6.利用Leica CM 1850 UV切片机进行冰冻切片；
7.冰冻切片丙酮固定10分钟。

8.PBS洗2次，每次5分钟。

9.10%正常山羊血清封闭30分钟。

10.一抗（通过预实验筛选抗体的最优浓度，利用免疫一抗稀释液稀释抗体）4℃
孵育过夜。

11.PBS洗3次，每次5分钟。

12.荧光标记二抗（通过预实验筛选的抗体最优浓度，利用免疫二抗稀释液稀释
抗体）室温湿盒避光孵育1小时。

13.PBS洗3次，每次5分钟，避光操作。

14.DAPI室温湿盒避光孵育5分钟。

15.PBS洗一次，5分钟，避光操作。

16.抗荧光淬灭剂封片。

17.镜检，拍照。

18．备注：如果进行双标，相应一抗应来源于不同的种属（例如一个是属抗，另一个是兔抗）；如果背景较高，应使用背景荧光淬灭剂处理；通过预实验确定一抗、二抗的最优浓度，以及是否需要使用背景荧光淬灭剂处理；。