DCFHDA活性氧检测方法

dcfh-da活性氧检测原理活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）是指一类具有高度活跃的氧原子或氧化剂，主要包括超氧阴离子（O2•-）、氢过氧化物（HO2•）、过氧化氢（H2O2）、单线态氧（1O2）、羟基自由基（•OH）等物质。

在正常生理状态下，适量的活性氧能够参与细胞信号传导、炎症应答、免疫调节等重要生物学过程。

然而，当活性氧的生成和清除失衡时，会导致细胞内的氧化应激，引发细胞内氧化性损伤，从而诱发多种疾病，如心血管疾病、神经系统疾病和肿瘤等。

活性氧的检测技术主要分为直接检测法和间接检测法。

直接检测法主要通过对活性氧的特定物理或化学性质进行测定，如电子顺磁共振（EPR）、荧光探针和化学发光等。

间接检测法则是通过测定活性氧对其他物质的氧化反应来间接评价活性氧的水平，如酶活性测定法和抗氧化剂测定法等。

本文将主要介绍直接检测法中常用的电子顺磁共振法（EPR）和荧光探针法。

一、电子顺磁共振法（EPR）：电子顺磁共振法利用电子磁共振技术来直接检测自由基和活性氧。

其原理是利用带有未成对电子的物质（即自由基）对外加磁场的电子自旋产生磁共振现象。

在EPR仪器中，样品通过微波辐射，引发由磁共振演变而形成的微弱信号。

通过测量这些信号的幅度、形状和宽度等参数，可以判断活性氧的种类和数量。

EPR法的优点在于其高灵敏度和高特异性，可以实现对各种活性氧物质的定量分析。

然而，EPR仪器操作相对复杂，且仪器成本较高，因此在实际应用中受到一定的限制。

二、荧光探针法：荧光探针法是一种通过测定荧光探针与活性氧的反应生成的荧光信号来间接检测活性氧水平的方法。

荧光探针是一类能够与活性氧发生反应的化合物，一般可分为特异性探针和非特异性探针。

特异性探针是指能够选择性地与活性氧发生化学反应，生成具有荧光特性的产物。

例如，二氟苯基三氟甲烷（DCFH-DA）作为一种常用的特异性探针，它通过氧自由基致氧化反应生成2',7'-二羟基荧光素（DCF），DCF会发出绿色荧光，并与活性氧的浓度呈正相关。

活性氧检测试剂盒（Reactive oxygen species assay kit）是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。

DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。

而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。

细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。

检测DCF 的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。

本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup以便于活性氧的检测。

Rosup是一种混合物（compound mixture），浓度为50mg/ml。

一、注意事项1、探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

2、探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。

3、尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。

4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

二、使用说明1、装载探针对于刺激时间较短（通常为2小时以内）的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞。

对于细胞刺激时间较长（通常为6小时以上）的细胞，先用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。

原位装载探针：本方法仅适用于贴壁培养细胞。

按照1：1000用无血清培养液稀释DCFH- DA，使终浓度为10微摩尔/升。

去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。

加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA的体积为1毫升。

37℃细胞培养箱内孵育20分钟。

用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。

通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。

收集细胞后装载探针：按照1：1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。

活性氧检测试验方案活性氧检测是一种用于评估物质或生物体中产生的活性氧（ROS）水平的方法。

ROS是一类极具活性的氧化物质，可在正常细胞代谢中产生，并参与多种生理过程。

然而，当ROS的产生超过细胞的抗氧化能力时，就会导致氧化应激，对细胞和组织造成损害，并与一系列疾病的发生和发展相关。

为了测量活性氧的水平，可以使用一系列的试剂和方法。

以下是一个可能的活性氧检测实验方案：实验材料：1.活体组织样本（例如细胞培养物、小鼠肝脏组织等）2.PBS缓冲液3.DCFDA（二氟荧光二乙酸盐）染料溶液4.活性氧产生剂（例如H2O2）5.抗氧化剂（例如维生素C）6.血红素（免疫染色用）实验步骤：1.准备工作：a.将DCFDA溶液按照说明书的要求稀释到适当的浓度。

b.用PBS缓冲液洗涤和预处理样本，去除可能影响实验结果的其他物质。

2.观察基础水平：a.取一小部分样本，不加任何试剂，放入显微镜观察台下。

b.使用适当的增强型荧光显微镜观察样本的荧光强度和分布。

3.活性氧产生实验：a.取适量的样本放入显微镜观察台下。

b.添加一定浓度的活性氧产生剂（例如H2O2），混匀。

c.立即在显微镜观察荧光信号的变化。

d.记录荧光信号的强度和分布。

4.抗氧化剂实验：a.取适量的样本放入显微镜观察台下。

b.添加一定浓度的抗氧化剂（例如维生素C），混匀。

c.立即在显微镜观察荧光信号的变化。

d.记录荧光信号的强度和分布。

5.数据分析：a.使用图像分析软件测量荧光信号的平均强度和荧光染色的面积。

b.对每个样本的数据进行统计分析，如平均值、标准误差等。

c.使用统计学方法（如t检验或方差分析）比较不同处理组之间的差异。

总结：通过以上步骤，可以获得活性氧的水平，评估其在不同条件（如活性氧产生剂和抗氧化剂的存在与否）下的变化。

这个实验方案可以用于研究活性氧在细胞和组织中的作用，以及评估抗氧化剂的功效。

dcfh-da荧光探针分子式全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：DCFH-DA荧光探针是一种常用于细胞活性氧（ROS）检测的荧光探针。

ROS是细胞内的一类活性氧化物质，在细胞内参与了氧化还原反应，同时也是一种细胞内信号分子，与细胞的生理功能和疾病发生密切相关。

DCFH-DA（2',7'-二氯二羟荧光素acethoxymethyl 酯）是一种无色、无味的脂溶性荧光探针，在细胞内可以被酯酶水解释放出荧光素荧光团。

DCFH-DA与ROS的检测原理基于氧自由基可在酶的催化下将非荧光物质氧化为荧光物质，因此该荧光探针能够在细胞内检测活性氧的水平。

DCFH-DA荧光探针的合成方法比较简单，通常是通过将2',7'-二氯荧光素（DCFH）与乙酰氧甲基化试剂（acethoxymethyl）在碳酸氢钠缓冲溶液中反应合成，再通过减压蒸馏或硅胶柱层析纯化得到目标产物。

DCFH-DA的荧光特性主要是在考察细胞内氧气活性时的上，其最大吸收波长在485 nm，最大发射波长为529 nm，发射光比较稳定，可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。

DCFH-DA荧光探针已经广泛应用于心血管疾病、神经退行性疾病等病理生理过程的研究中。

在心血管疾病中，ROS的水平与动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病的发生发展相关。

研究人员通过DCFH-DA 荧光探针检测活性氧的水平，探索ROS与心血管疾病的关联，并希望通过抑制ROS的积累来减缓或治疗心血管疾病。

在神经退行性疾病中，如帕金森病和阿尔茨海默病，也发现ROS的水平升高。

科学家通过DCFH-DA荧光探针的应用，研究神经细胞中ROS的释放和清除机制，探索神经退行性疾病的发病机制。

第二篇示例：DCFH-DA是一种常用的荧光探针分子，通常应用于生物学研究领域。

它是一种非极性脂溶性分子，由于其能够在活细胞内被内切酯酶水解成为高度荧光的荧光染料，因此DCFH-DA广泛用于检测活细胞中的ROS（活性氧种）水平。

活性氧的检测方法活性氧（reactive oxygen species，ROS）是指一类具有高度活性的氧气衍生物，包括超氧阴离子（superoxide anion，O2·-）、过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）、羟基自由基（hydroxyl radical，·OH）等。

它们在正常生物体内起到重要的信号传导和正常生理功能的调节作用，但当其产生过量或生物体的抗氧化防御系统受损时，可引发氧化应激反应，导致蛋白质、脂质、DNA等生物分子的氧化损伤，从而参与多种疾病的发生和发展过程。

由于活性氧的生成和清除速度都非常快，直接测量活性氧的浓度和活性是非常困难的，因此科学家们开发了多种间接检测方法。

以下是几种常见的活性氧检测方法。

1. 过氧化物酶法（oxidative enzyme assay）该方法通过利用特定的过氧化物酶（例如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等）将活性氧转化为可测量的反应物质。

测量该反应物质的生成速率或浓度变化，可以间接反映出活性氧的产生量或含量。

2. 化学荧光探针法（chemical fluorescence probe）该方法使用特定的化学荧光探针，探针分子结构中含有特异性的活性氧敏感团或特异的活性氧响应元件。

当探针与活性氧反应时，荧光强度变化或荧光发射峰位移动，可以通过荧光光谱或荧光显微镜等技术手段来测定活性氧的产生量或含量。

3. 化学显色法（chemical colorimetric assay）该方法基于活性氧与一些特定的化学物质（如戊二醛、硫代巴比妥酸钠等）反应生成产物，这些产物具有特定的吸收光谱，可以通过比色法来测定活性氧的产生量或含量。

该方法简便易行，仪器设备要求低，适用于较低灵敏度的活性氧检测。

4. 高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography该方法通过高效液相色谱技术将待测样品中的活性氧产生物（如羟基自由基产生物3,4-二羟基苯乙酮酸）分离和检测，根据活性氧产生物的峰面积或峰高变化来测定活性氧的产生量。

评述与进展 活性氧测定的基本原理与方法林金明3　屈　锋　单孝全(中国科学院生态环境研究中心,北京100085)摘　要　综述了过氧化氢(H 2O 2)、一重态氧(1O 2)、超氧阴离子自由基(·O -2)以及羟自由基(·OH )等活性氧的测定方法。

侧重介绍活性氧的化学反应法、捕捉法和直接测定法的基本原理和最新的进展情况,并比较了这几种方法的各自特点。

关键词　活性氧,化学发光,自由基,评述　2001211208收稿;2002205205接受本文系中国科学院“百人计划”和国家杰出青年科学基金资助项目(N o.20125514)1　活性氧氧是生命运动过程中不可缺少的一种气体,人们一旦处于缺氧或者供氧不足的环境中,就会感到憋气的痛苦甚至死亡。

所以,自从1770年代初英国人Joseph Priestley 发现氧以来,氧一直被人们认为是一种对人体百益而无一害的气体。

可是,科学技术迅速发展起来的今天,我们知道,不管是空气中的氧还是水中的溶解氧都具有较高的氧化性,与一般的金属铁一样,处于空气中的人体各部位都在不断地受到氧的腐蚀而“生锈”,当然这种腐蚀与铁不同,它体现在人体的细胞水平上。

特别是人体各种器官随着年龄的增大不断地老化更是这种腐蚀“生锈”的直观表现。

1969年McC ord 与Fridovich [1]发现,在生化反应过程中O 2获得一个电子还原生成超氧自由基(O -2),进而经过红血球的分离精制后获得O -2的清除灭活酶,并命名为超氧化物歧化酶(superoxide dismultase ,S OD )。

这一发现激发了大批的科学研究者致力于O -2的生成过程、反应活性、毒性、生理和病理等等各方面的研究,去探索解明S OD 在生理学上的意义。

同时由O -2衍生出来的过氧化氢(H 2O 2)、羟自由基(·OH )、激发态氧(一重态氧或称单线态氧,1O 2)也受到了人们的重视。

A: DCFH-DA法:测得是总活性氧,但对超氧化物不是非常灵敏.
1,取组织,用PBS或生理盐水冲洗一遍
2,按照1:500用无血清培养液稀释DCFH-DA(配好的探针需要避光放置)，24孔板每孔加入约3ml(以能完全浸没组织为准).37℃细胞培养箱内孵育20分钟。

3,用无血清细胞培养液(或PBS)洗涤细胞三次，以充分去除未进入组织内的DCFH-DA。

通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。

4,用小动物成像仪在488nm激发波长，525nm发射波长处观察荧光信号.
注A::
1,托盘需要没有荧光背景或背景很低.
2,由于胎鼠组织不易拿到,如果用母鼠的脑的话建议考虑血脑屏障会不会引起探针进不去? 没有胎鼠组织的话建议选择母鼠的脑及肝作为预试组织。

DHE法: 测的是超氧化物.
1,取组织,用PBS或生理盐水冲洗一遍
2,按照1:200用无血清培养液稀释DHE(配好的探针需要避光放置)，24孔板每孔加入约3ml(以能完全浸没组织为准).37℃细胞培养箱内孵育20分钟。

3,用无血清细胞培养液(或PBS)洗涤细胞三次，以充分去除未进入组织内的DCFH-DA。

通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。

4,用小动物成像仪在535nm激发波长，610nm发射波长处观察荧光信号.(或者300nm激发波长，610nm发射波长)
注B:
1,托盘需要没有荧光背景或背景很低.
2,由于胎鼠组织不易拿到,如果用母鼠的脑的话建议考虑血脑屏障会不会引起探针进不去?
3.DHE与超氧化物反应后的产物有毒,操作过程中需要防护(戴手套,防止污染台面),用过的皿及枪头等垃圾建议分类处理.。