生物化学实验理论教学课件-分光光度计的结构与使用方法

0.575
光源
单色器 吸收池 接收器
以下分别介绍各部件
6
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
1. 光源 用6～12V白炽灯 作用：提供光强一定的复合光(白光) 性能要求: 亮度稳定(以使入射光通量强度 故需电源电压稳定, 一般用稳压器提供稳压。
误差越小。 4.分光光度法，其他条件一定，ε越大，测定的灵
敏度越高。 5.朗伯-比尔定律不仅使用于可见分光光度法,也使
用于紫外分光光度法。 6. 透光率T与吸光物质浓度成反比。
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为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
721型分光光度计 应用
1. 测定组分浓度与含量: 依据A= -lgT= bc
2. 测定配合物的组成
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为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
小结
1.熟练掌握分光光度计的基本组成 部件 2.了解分光光度计的基本组成部件的作用 3.明确参比溶液的作用
作业:P232-10.12 15
自测题 为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益 判断题 1.可见分光光度法所用参比溶液的作用是调A=0.00 2.可见分光光度法测定KMnO4时,应选紫色光为
入射光。 3.光度分析中,测定的吸光度越大,测定结果的相对
光源 参比
样品

朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的理论基础。
— 1—
（知 识点 名称）
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• 紫外-可见分光光度计的使用原理-----朗伯比尔定律
3、吸光系数
当l 以cm，c以g/L为单位，κ称为吸光系数，用 a表示。 A= a cl
a 的单位为L/(g.cm)
— 1—
过渡页
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紫外-可见分光光度计的结构
二
1.检测的定义及作用 2.检测的重要性 3.检测的类别 4.检测的原理图 5.XXXXXXXXX
— 2—
（知 识点 名称）
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• 紫外-可见分光光度计的结构 基本结构： 光源→单色器→吸收池→检测器→信号显示系统
样品
— 1—
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• 紫外-可见分光光度计的结构
1、光源 在紫外可见分光光度计中，常用的光源有两类：热辐射光源和气体放电光源。 热辐射光源用于可见光区，如钨灯和卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。 2、单色器 单色器的主要组成：入射狭缝、出射狭缝、色散元件和准直镜部分。单色器质量的优劣， 主要决定于色散元件的质量。色散元件常用棱镜和光栅。。 3、吸收池 吸收池又称比色皿或比色杯，按材料可分为玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外 区。吸收池的种类很多，其光径可在0.1~10cm之间，其中以1cm光径吸收池最为常用。
目录页
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一
紫外-可见分光光度计使用原理
二
紫外-可见分光光度计结构
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紫外-可见分光光度计的使用原理

第二十二页，共42页。
波钨 长灯 的灯 关丝 系温
度 和
第二十三页，共42页。
⑵ 单色器
单色器是分光光度计的心脏部分，它的作用是把来自光源的混 合光分解为单色光并能随意改变波长。它的主要组成部件和作
用是：①入射狭缝——限制杂散光进入。②色散元件——即
棱镜或光栅，是核心部件，可将混合光分解为单色光。③准直
第十五页，共42页。
紫外光谱中常用的术语
发色团、助色团、增色效应和减色效应。
发色团：凡是与饱和碳氢化合物连接能引起n→π*、 π→π*、 n→σ* 等电子跃迁的基团称为发色团。例 如：C＝C、C＝O等。
助色团：助色团是一些具有非共价键的基团（如 OH、NH2、SH等）。这些基团在波长＞200 nm 处没有吸收，当它与发色团相连接时，使发色团的吸 收带向长波移动，称为红移（或浅色效应），红移的 同时吸收带的强度增加。若助色团与发色团相连接， 产生 n→π* 跃迁，使吸收波长向短波移动，称为
用于可见光和近红外光区的光源是钨灯，现在最常用的是卤
钨灯（Halogen lamp），即石英钨灯泡中充以卤素， 以提高钨灯的寿命。适用波长范围是320～1100nm。 由于能量输出的波动为电压波动的四次方倍，因此电 源电压必须稳定。 用于紫外光区的是氘灯（Deuterium lamp），适用波 长范围是195～400nm，由于氘灯寿命有限，国产氘 灯寿命仅五百小时左右，要注意节约灯时。
10-200
Near ultraviolet 200-380
Visible
380-780
Near infrared
780-3000
Middle infrared 3000-30,000
Far infrared

单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质 的浓度和液层的厚度〔光路长度〕成正比，其关系如下式：
A=-lg(I/I。)=-lgT=kLc
式中：A为吸光度；
I。为入射的单色光强度；
I为透射的单色光强度；
T为物质的透射率；
k为摩尔吸收系数； L为被分析物质的光程，即比色皿的边长 ；
拓展-任务原理
；
分类-按波长
1、可见光分光光度计：测定波长范围为400～760nm的可见光区； 2、紫外分光光度计：测定波长范围为200～400nm的紫外光区； 3、红外分光光度计：测定波长范围为大于760nm的红外光区； 4、荧光分光光度计：用于扫描液相荧光标志物所发出的荧光光 谱； 5、原子吸收分光光度计：光源发出被测的特征光谱辐射，被经 过原子化器后的样品蒸气中的待测元素基态原子所吸收，经过测定 特征辐射被吸收的大小，来求出被测元素的含量。
市局面上普通运用的石英比色皿均为石英粉烧接的，可用公用 超声波清洗，比色皿清洗时毛面朝下。
清洁方法 1、比如测定溶液是酸，假设不干净，就用弱碱溶液洗，要是测 定溶液是碱，假设不干净，就用弱酸溶液洗，要是测定溶液是有机 物质，假设不干净，就用有机溶剂，比如酒精等溶液洗 2、选择比色皿洗涤液的原那么是去污效果好，不损坏比色皿， 同时又不影响测定 3、分析常用的铬酸洗液不宜用于 洗涤比色皿，这是由于带水 的比色皿在该洗液中有时会部分发热，致使比色皿胶接面裂开而损
分光光度计
2021年2月18日
；
目录
A
简介
B
722分光光度计
C
仪器缺点及处理
D
拓展
；
简介
分光光度法是经过测定被测物质在特定波优点或一定波 长范围内光的吸收度，对该物质进展定性和定量分析。

• m λ= 2dsinθ
• 式中，d 是沟纹之间的距离，θ是光栅常数； m是干涉价数。当m=1时，为一阶谱； m=2时，为二阶谱。
• 光栅的分辨能力取决于它的mN值，N是光 栅上总沟纹数或总条数。条数多时，一阶 谱的分辨力高。与棱镜相比，光栅的分辨 能力更高些，并能用于所有谱段范围，光 栅的色散呈线性。
• ⊿E=hυ
• 这里，h为普朗克常数。此时，在微观上出 现分子由较低的能级跃迁到较高的能级， 在宏观上则表现为透射光的强度变小。若 用一连续辐射的电磁波照射分子，将照射 前后光强度的变化转变为电信号，并记录 下来，就可以得到一张光强度变化对波长 的关系曲线图——分子吸收光谱图。
• 紫外--可见区的分子吸收光谱一般是谱带较 宽的带状光谱，它是由于电子能级跃迁而 产生的光谱，因此又叫做电子光谱。
• 溶液颜色的深浅与浓度之间的关系可以用 吸收定律来描述。它是由朗伯定律和比尔 定律相结合而成的，所以叫朗伯-比尔定律。 原子吸收分光光度计也符合这个定律。
• 溶液对光的吸收 当一束强度为I的平行单 色光照到溶液时，一部分光被溶液吸收， 一部分光被界面散射，其余的光则透过溶 液，如图4-2所示
• 有：
• 实验证明，棱镜的色散具有非线性，即① 谱线弯曲；②不同波长区域色散效果不同， 红端色散差，紫端色散较好。虽然在实际 应用中的棱镜单色器与图示的不尽相同， 然而它们的工作原理是一样的。
• 2．光栅单色器
• 衍射光栅也可用作单色器。衍射光栅是由 一系列刻划在高光洁度反射表面上沟纹组 成的。沟纹排列异常密集，每英寸长度上 有15000或30000条。将光栅放在一平行光 束里，光栅的一面被照亮，这一面可看作 是块非常小的反射镜。
• 光栅的表面镀有铝膜，质地松软，极易擦 伤。所以在维护时严禁用任何擦拭物擦拭， 更不能用手去触摸，否则，会造成永久损 坏。也不准用嘴去吹光栅上的灰尘。光栅 万一脏了，可以用洗耳球吹去表面上的灰 尘。如不奏效，可以在光栅上均匀地涂上 一层粘胶棉〔俗称火棉胶〕液，等胶液干 了以后，将液膜轻轻揭下。此法可以将光 栅上的脏物去掉。现在有的光栅已镀有保 护膜。

I0 I
值大，表示溶液吸收光线较多；
当I 0时，lg I0 值无穷大，表示光线几乎被溶液完全吸收，即溶液不透光。 I
由此可见， lg I0 表示溶液对光吸收的程度，称作吸光度（absorbance）， I
用A表示，即A lg I0 I
2012春季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
如何求被测组分的含量
分光光度法
南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心
2012春季学期
内容
1 分光光度法的原理 2 如何求被测组分的含量
3
3 分光光度计的基本结构 4 分光光度计的使用与注意事项
2012春季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
分光光度法
• 概念：是利用物质所特有的吸收光谱来 鉴别物质或测定其含量的一项技术。
lg Io k l ＋ lg Io k c ＝ lg Io k c l
I
I
I
2012春季学期
A k cl
生物化学与分子生物学实验教学中心
分光光度法的原理
lg Io k c l IΒιβλιοθήκη 公式的意义：当I
I
时，
0
lg
I0 I
0，表示溶液完全不吸收光线；
当I＜I0时，lg
若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律，则必然 得到一条通过原点的直线，即标准曲线，亦称工作曲线 。以后对末知浓度物质测定时，无需再作标准管，据测 定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。
2012春季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
根据测定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度
。
A
0.8 0.6 0.4

准备待测的样品，确保样品适用于分光光度计测量。
2
2. 校准和基线
校准仪器并进行基线校正，确保准确的测量结果。
3
3. 光程、波长设置
设置适当的光程和测量波长，以获得准确的吸光度。
4
4. 测量和记录
将样品放入进样系统，测量吸光度并记录结果。
VI. 分光光度计的原理
分光光度计原理基于比较样品吸收的光线强度与参考样品或空白试验的光线强度的差异。这样可 以确定样品中特定物质的浓度。
VII. 分光光度计的应用领域
生物化学
用于测量酶活性、细胞浓度等。
环境科学
用于水质、大气等环境参数测量。
药学
用于药物配方和质量控制。
食品科学
用于食品成分和质量分析。
VIII. 分光光度计的精度和灵敏度
分光光度计具有高精度和灵敏度，可以测量微量物质的浓度和变化，从而在科学研究和质量控制 方面发挥重要作用。
II. 分光光度计的分类
紫外可见分光光度计
用于测量UV和可见光范 围内的吸光度。
红外分光光度计
用于测量红外光范围内 的吸光度。
紫外可见红外分光 光度计
同时覆盖紫外、可见和 红外光范围。
III. 常见的分光光度计
台式分光光度计
适用于实验室和教学环境，具有较高的精度和 灵敏度。
手持式分光光度计
便携、易于携带，适用于野外研究和快速测量。
《分光光度计培训》PPT 课件
这个PPT课件将向您介绍分光光度计的各个方面，包括原理、分类、工作原理 以及应用领域。让我们来一起探索这个精密仪器的世界。
I. 什么是分光光度计
分光光度计是一种用于测量物质溶液中吸光度的仪器。它可以通过分析样品对特定波长的光线的 吸收情况，来确定样品中特定物质的浓度。

透 光 窗
然后盖上盖子。
*
按 MODE 键
（3）调节投射比为 0.000
至投射比（T）灯亮
*
T 方式
“0%”键
按一下“0%”键，此时仪器自动校正后显示 “0.000”。 （有的分光光度计没有黑体，需要在打开试样 室盖（起黑体的作用）的情况下调 T = 0.000）
*
（4）调透射比为 100% 将手柄向操作者方向拉出一档（听到“咔嚓”一 声），此时参比（0 号）溶液进入光路。 按一下“100% T”键， 此时仪器显示“BLA” 表示仪器正在自动校 正，校正完毕后显示 “100.0”。
编 号
0
1
2
3
4
5
6
V标准液/mL
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
0.00
V试液/mL
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
5.00
4
4
4
4
4
4
4
V磺基水杨酸/mL
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
滴加氨水至黄色后再多加 4 mL 。定容、摇匀，测吸光度。
100% T
B L A
100.0
*
（5）重复（验证）（3）、（4）两步，直至透 射比为 0.000 和 100% 不变。 按“MODE”键至“ABSORBANCE”灯亮（此 时转换到测吸光度功能上）。
*
将手柄向操作者方向再拉出一档（听到“咔嚓” 一声），此时被测（1 号）溶液进入光路。 此时仪器所显示的数值即为 1 号被测溶液的吸光 度值（记录下来）。

γ-射线排成一列，即组成电磁波的波谱，如下图所示。
2.2.1 分光光度计的 光谱范围
包括波长范围为400~760 nm的可见光区和波长范围 为200～400 nm的紫外光区。不同的光源都有其特有的 发射光谱，因此可采用不同的发光体作为仪器的光源。
钨灯的发射光谱：钨灯光源所发出的400～760nm 波长的光谱，光通过三棱镜折射后，可得到由红、橙、 黄、绿、蓝、靛、紫组成的连续色谱；该色谱可作为可 见光分光光度计的光源。
防止有色配合物离解。有效的方法是加入缓冲 溶液（考虑干扰）
在pH＝2～3 Fe(ssal)+
紫红色
在pH＝4～7 在pH＝8～10 在pH>12
Fe(ssal)22Fe(ssal)3 Fe(OH)3
棕橙色 黄色 沉淀
3、温度 4、时间 5、溶剂 6、共存干扰离子的影响及消除
(a) 控制酸度； (b) 加入掩蔽剂； (c) 改变干 扰离子价态； (d) 分离干扰离子。
分
nm的红外光区
光
光
度 计
可见光分光光度计: 测定波长范围为400~760
的
nm的可见光区
分
类
测定波长范围为200～400 紫外分光光度计:
nm的紫外光区
2.2 分光光度计工 作原理
人眼可见的光只占电磁波谱的很小—部分
（400~760nm）。它是一种频率较大的电磁波。电磁
波按频率大小，从频率最小的无线电波到频率最大的
主讲教师：徐文俊 成都大学生物工程系
2005年6月
教学目的：
1. 掌握分光光度法的定义和在实践中的应用； 2. 掌握分光光度计的基本结构和工作原理； 3. 掌握可见光分光光度计的正确使用方法； 4. 掌握紫外分光光度计正确使用方法；