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固定液和组织的比例依据
固定液和组织的比例是根据所需固定的组织的大小和类型来确定的。
一般而言，常用的固定液和组织的比例是10:1，即10部分的固定液与1部分的组织混合。
然而，不同的组织类型可能需要不同的比例。
以下是一些常用的组织固定液比例：
1. 大体组织：对于较大的器官或动物组织，通常使用10%缓冲福尔马林溶液（10% buffered formalin）固定。
这意味着将10部分的缓冲福尔马林溶液和1部分的组织混合。
2. 细胞和细胞簇：对于大部分细胞和细胞簇的固定，一般使用4%缓冲福尔马林溶液。
这意味着将4部分的缓冲福尔马林溶液和1部分的细胞或细胞簇混合。
3. 骨骼组织：对于骨骼组织的固定，常用的固定液是10%缓冲福尔马林溶液或中性缓冲福尔马林溶液。
需要较长的固定时间。
除了以上常用的固定液比例外，还有其他特殊组织和细胞类型可能需要不同的固定液比例。
此外，固定时间和固定温度也会影响固定效果，需要根据具体实验要求进行调整。
因此，最好根据实验需要和参考相关文献确定合适的固定液和组织比例。
第1页共1页4%组织细胞固定液说明书货号：P1110规格：100mL/500mL保存：常温，有效期1年。
产品说明：该固定液是免疫组织化学(IHC)和免疫细胞化学（ICC)研究中最常用的固定剂之一。
较为温和，能很好地保存组织的抗原性和细微结构，适于组织标本和细胞片的较长期保存，非常适合组织和细胞的光镜免疫化学研究。
本产品是用PBS 配置的组织细胞固定液，可直接用于组织和细胞固定。
若需使用其他低浓度的固定液，可使用0.01M PBS 按比例稀释。
使用说明（仅供参考）：组织固定：室温或4℃浸泡固定2-24h ，用缓冲液漂洗后即可石蜡或碳蜡或塑封包埋用于组织切片。
切片固定：室温或4℃固定10min-2h ，视切片厚度而定，用缓冲液漂洗后即可用于染色。
细胞固定：室温或4℃固定10-30min ，用缓冲液漂洗后即可用于染色。
注意事项：为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
相关产品：C1010柠檬酸钠缓冲液0.01mol/L ，pH6.0C1050ELISA 包被液DA1010DAB 显色试剂盒（20×）G1120HE 染色试剂盒P10100.01M PBS 干粉，PH7.2-7.4S2100抗荧光衰减封片剂X10200.1%胰蛋白酶液消化液相关文献:[1]Jingcai Liu,Lan Li,Hongchen Yan,et al.Identification of oxidative stress-related Xdh gene as a di(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP)target and the use of melatonin to alleviate the DEHP-induced impairments in newborn mouse ovaries.Journal of Pineal Research.April 2019.(IF 15.221)[2]Tengjiao Ma,Zhiwei Zhang,Yilu Lu,et al.CLOCK and BMAL1stabilize and activate RHOA to promote F-actin formation in cancer cells.Experimental &molecular Medicine.October 2018.(IF 5.584)[3]Chengya Wang,Youyang Qu,Di Wang,et al.The Proangiogenic Roles of Long NonCoding RNAs Revealed by RNA-Sequencing.Cellular Physiology and Biochemistry.(IF 5.500)[4]Zhaoqing Li,Tingting Zhu,Yini Xu,et al.A novel STAT3inhibitor,HJC0152,exerts potent antitumor activity in glioblastoma.American Journal of Cancer Research.April 2019.(IF 4.737)注：更多使用本产品的文献请参考索莱宝官网。
4%多聚甲醛固定细胞原理
原理：固定（Fixation）的目的是使蛋白质等成分凝固，使组织结构或细胞形态更接近生活状态。
使细胞内的蛋白质、抗原等沉淀或固定，定位在细胞内原有位置，终止或减少外源性和内源性分解酶的反应，防止组织因离体时间延长而发生细胞自溶，减少细胞可溶性蛋白质、脂肪和糖类物质的弥散、破坏与丢失。
同时也可使组织硬化成形，便于后续的包埋、切片及染色。
4%多聚甲醛固定液是目前最常用的固定液之一。
对多种组织都具有良好固定能力。
使用说明：对于细胞样品，去除培养液后，按照每六孔板一个孔加入1毫升固定液的比例，加入免疫染色固定液。
对于其它样品，加入免疫染色固定液的量都以充分盖住样品为准。
通常室温固定10分钟即可。
也可以4℃过夜。
对于组织样本固定液必须足量，一般是组织块总体积的10-50倍，保证固定液充分渗入组织中。
保存条件：2-8℃保存，一年有效。
注意事项：免疫染色固定液含有多聚甲醛，有毒，请注意适当防护。
流式检测DNA染色步骤
材料与试剂：
使用说明：
DNA染料，尤其是PI，具有较强的粘性。
样本上机检测之后，应遵照仪器说明书仔细清洗流式细胞仪，以免对下一位操作者结果造成影响。
固定好的细胞可保存长达12个月(储存于70-80%的乙醇，置于-20°C保存).
操作步骤：
1. 收获细胞于流式管中，加入3-4ml的PBS清洗细胞。
2. 1000rpm离心10分钟，弃上清。
3. 逐滴加入5ml或更多预冷的70-80%的乙醇，涡旋混匀细胞，4°C避光过夜（>18小时）。
4. 1000-1500rpm离心细胞10分钟，弃上清。
之后清洗细胞2次以去除所有的乙醇。
注：第一次用1xPBS，第二次用染色液（货号：554656）。
5. 细胞染色：每管样本需10^6细胞。
具体操作如下：
1) 对于PI/RNase 染色，将细胞重悬于0.5mLPI/RNase 染色液（货号：550825）。
2) 对于7-AAD染色，将细胞重悬于0.1mL染色液（货号：554656），同时加入20μL7-AAD染
色液（货号：559925）
6. 室温避光孵育15分钟。
7. 分析前4°C避光保存样本。
1小时之内上流式细胞仪检测。
几种细胞固定方法选择最佳固定液标准是：（1）最好地保持细胞和组织的形态结构；（2）最大限度地保存抗原的免疫活性。
一些含重金属的固定液在免疫组化和细胞化学技术中是禁用的；（3）不要用可能带有自发荧光的固定剂，如带有苦味酸的固定剂，还有甲醛升汞固定液，会使上皮细胞产生非特异性荧光；（4）固定剂的选择、固定时间、温度和PH值都会影响实验结果。
单纯固定液（1）4%中性甲醛固定液：最常用的固定液，能满足常规HE及免疫组化、PCR等工作（Job）。
中性甲醛是以的磷酸缓冲液为溶剂配制的，其固定效果及对组织抗原性的保存均优于一般的4%甲醛固定液。
此固定液配制后应密封并保存在阴凉处，保存时间不超过一个月。
（2）乙醇固定液：使用时以80%-95%的浓度为宜，具有硬化、固定、脱水等作用，对组织渗透力较弱，因此很少单独使用，但其保存组织中的核酸强于中性甲醛，故常用于有核酸操作的实验或检查，假如用于证实尿酸结晶和保存糖原，可用于100%乙醇固定组织。
（3）4%多聚甲醛固定液：主要用于培养细胞的固定。
混合固定液（1）乙醇-甲醛（乙醇-福尔马林，AF）固定液：适用于皮下组织中肥大细胞的固定。
该固定液有固定兼脱水作用，固定后的标本可直接入95%乙醇脱水。
（2）B5（醋酸钠-升汞-甲醛）固定液：多用于固定淋巴组织。
染色前应进行脱汞沉淀处理。
（3）Bouin固定液：非凡适用于睾丸活检组织的固定。
Bouin液对组织固定较均匀，收缩很少，不会使组织变硬变脆。
需现配现用。
（4）Carnoy固定液：穿透能力强，可很好的固定细胞质和细胞核，非凡适用于固定外膜致密的组织，也适用于糖原及尼氏小体的固定。
（5） Zenker固定液：经此液固定的标本，细胞核和细胞质染色颇为清楚，但成本较高且需非凡处理汞。
该固定液要避免接触阳光，以免引起化学变化而失效。
多聚甲醛固定细胞原理和步骤实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
实验步骤一、材料准备可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用),Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。
细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,无血清DMEM,(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基,DMEM完全培养基,1640完全培养基(也可加到20%血清),无菌PBS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0.1%(g/ml)PBS结晶紫)二、步骤和流程2.1基质胶铺板用BD公司的Matrigel 1:8(根据细胞产生mmp的量来决定)稀释,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。
使用前进行基底膜水化。
2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h,进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS洗1-2遍),用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至5×105/ml。
2.3接种细胞①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。
②24孔板下室一般加入600μl含20S的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。
③培养细胞:常规培养12-48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。
病理组织常用固定液的配制（免疫组化）一、常规固定液的配制（1）10%甲醛液浓甲醛 10ml蒸馏水 90ml(2 ) 缓冲中性甲醛液浓甲醛10mlPBS缓冲液（Ph7.2）90ml(3 ) 10%中性甲醛液浓甲醛10ml蒸馏水90ml碳酸钙加至饱和(4 ) Bouin氏固定液苦味酸饱和水溶液75 ml甲醛2 ml冰醋酸5 ml该固定液中的冰醋酸，对胶原纤维等组织有膨胀作用，而甲醛对组织有收缩作用，两种试剂的混合使用，用以抵消彼此间的副作用，使组织固定达到优良的固定水平。
（5）醛糖钙固定液甲醛100ml蔗糖300ml乙酸钙20g蒸镏水90ml先将蔗糖和乙酸钙溶于蒸镏水，后加入甲醛。
该固定液对于做酶的组织化学的研究效果较好，组织固定后，做冰冻切片，再给予显示。
当前国内外基本上都还是要用甲醛来固定组织。
从免疫组织化学的角度来说，甲醛固定的组织大部分都可以用免疫组化的手段来检测，据多人认为，它对lgA ，lgM，J链，K 链和λ链的标记效果较好，且背景清晰。
但美中不足的是：经它固定的组织，可与蛋白形成醛交联蛋白，这种醛键可封闭抗原。
固此，在免疫组化实际检测中，应根据不同的要求和需要，采用酶消化或者其它抗原修复如微波、高压等的方法，以便破坏醛键重新暴露抗原。
（6）Zenker氏固定液：重铬酸钾25g升汞50g蒸馏水1000ml冰醋酸50ml先将重铬酸钾和升汞溶于水中，尢其是重铬酸钾，应用热水或加温的方法将其溶解，然后过滤贮存于带盖的玻璃瓶中，如暴露于空气中，该溶液将会被慢慢氧化而便颜色加深，导致失效。
临用时，取贮存液950ml，加入50ml的冰醋酸，即可使用。
应用该固定液固定的组织，一般不要超过24h，取出组织，流水冲冼12小时以上，然后保存于75%-80%的酒精中，在切片染色前，必须用碘除去汞盐的沉着。
应用该固定液的组织，细胞核及细胞浆染色十分清晰，特别是要显示骨骼肌的横纹时，应用本液可获得满意的结果，但由于其含有醋酸，故不能用于保存细胞颗粒，红细胞及含铁血黄素。
破膜剂试剂手册BD Cytofix / Cytoperm 固定/渗透试剂盒手册（目录号554714）BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/渗透试剂盒（BD GolgiStop含有莫能菌素的蛋白质转运抑制剂）（目录号554715）BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/渗透试剂盒（含布雷菲德菌素A的BDGolgiPlug蛋白质转运抑制剂）（目录号555028）Ficoll是Amersham Biosciences AB的注册商标。
Hypaque是Amersham Health AS的注册商标。
BD流式细胞仪是1流激光产品。
仅供研究使用。
不用于诊断或治疗程序。
2016年Becton，Dickinson 和公司。
版权所有。
本出版物的任何部分不得以电子，机械，磁性，光学，化学，手册或其他方式以任何形式或通过任何方式复制，传播，转录，存储在检索系统中或翻译成任何语言或计算机语言，未经BD Biosciences事先书面许可。
购买不包括或携带任何权利转售或转让本产品作为独立产品或另一产品的组成部分。
未经Becton，Dickinson和Company明确书面许可，严禁使用本产品以外的许可使用。
2016BD，BD徽标和所有其他商标均为Becton，Dickinson和Company的产权。
目录BD Cytofix / Cytoperm固定/渗透试剂盒BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/渗透试剂盒（BD GolgiStop蛋白质转运抑制剂）BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/渗透试剂盒（BD GolgiPlug蛋白质运输抑制剂）警告和注意事项1.一般程序A.刺激细胞1.使用BD GolgiStop的程序蛋白质转运抑制剂（含有莫能菌素）2。
使用BD GolgiPlug 蛋白质转运抑制剂的程序（含布雷菲德菌素A）B.方案：细胞表面抗原和细胞内细胞因子的多色染色1收集细胞2.阻止Fc受体3.细胞表面抗原染色4.固定和渗透细胞5.备选固定和渗透方案6细胞内细胞因子染色C.流式细胞分析。
细胞固定及常用的固定液•取材后的组织需立刻投于固定剂中–固定使组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持原有结构和形态；–对免疫组化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或弥散。
•常用固定液：固定剂品种很多，但大多属于醛类和醇类。
其固定原理不同，各有优缺点。
–醛类（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）–醇类（常用乙醇）–其它（丙酮）(1) 醛类•甲醛(福尔马林)应用最广–原理：形成分子间的交联，影响蛋白构型而使之固定。
–优点：形态结构保存好，且穿透性强，组织收缩少。
–缺点：•甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；•醛基与抗原蛋白的氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍；•分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。
可造成假阴性的染色结果。
–注意事项：• C)，为此组织块不宜过厚。
缩短固定时间，降低固定温度•改用中性缓冲福尔马林，以pH值7.2～7.4 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成10％甲醛固定液，减少固定液pH的变化。
•固定后充分水洗以减少分子间交联。
•切片在作免疫组化染色前，先经预处理使抗原再现(抗原修复)。
•戊二醛：–穿透性强，微细结构保存好，但对抗原有一定影响，常与其他固定剂联合用作免疫电镜固定液。
•多聚甲醛(常用4%)：–可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光染色。
•主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等。
(2) 醇类•最常用的醇类固定剂是乙醇。
–其固定作用：使细胞内蛋白、糖类发生沉淀。
–优点：穿透性强、抗原性保存好。
–缺点：•脱水性强，易引起组织收缩、变硬，影响切片质量，因而乙醇固定时间不宜过长(2h内)。
•乙醇使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。
(3) 其它固定剂•丙酮：–对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少用于组织标本，但细胞爬片常用丙酮固定。
1.转染48小时后，弃去旧液，1ml PBS洗两遍用BD公司的固定透膜液400ul （Fixation and Permeabilization Solution）于4度冰箱内固定透膜20分钟后，PBS洗两遍
2.用弯曲的针头挑起爬片，镊子夹出置于载玻片上，内源性过氧化物酶阻断剂室温（无色液体）孵育10分钟
3.吸水纸吸去阻断剂后将玻片在摇床上PBS中洗3次，每次5分钟。
（若洗的次数多则细胞脱片程度也有可能加大，摇洗的力度也不宜过高）
4.滴加试剂A（蓝色液体）室温孵育10分钟，用吸水纸从一侧吸去，勿洗。
5滴加20倍稀释的单抗，800倍稀释的感染血清，于湿盒内37度孵育2小时。
6.吸水纸吸去稀释后的一抗，在摇床上PBS洗3次，每次5分钟。
7.滴加试剂B（黄色液体）室温孵育10分钟。
8.吸水纸吸去试剂B后，于摇床上PBS洗3次，每次5分钟。
9.滴加试剂C（橙色液体）室温孵育10分钟。
10.吸水纸吸去试剂C后，于摇床上PBS洗3次，每次5分钟。
11.显色剂DAB显色。
BD Cytofix™Technical Data SheetFixation BufferProduct InformationMaterial Number:554655Size: 100 mlDescriptionBD Cytofix™ Fixation Buffer is comprised of a neutral pH-buffered saline (i.e., Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline) that contains 4% w/v paraformaldehyde. This fixation buffer is intended to preserve human and rodent lymphoid cells for the subsequent immunofluorescentstaining of intracellular cytokines. BD Cytofix can also be used to preserve the light-scattering characteristics and fluorescence intensities ofhuman and rodent hematopoietic cells that have been stained by immunofluorescence for subsequent flow cytometric analysis.Preparation and StorageStore at 4° C and protected from prolonged exposure to light.Application NotesRecommended Assay Procedure:BD Cytofix can be used to fix unstained cells for subsequent immunofluorescent staining of intracellular cytokines. The suitability of fixing cellsfor immunofluorescent staining depends on whether the fluorescent antibodies can specifically detect their cognate antigens in a fixed form. Withrespect to intracellular cytokines, Pharmingen offers a large panel of conjugated anti-cytokine antibodies that can be successfully used to stainfixed and permeabilized cells. For the staining of antigens expressed on the surface of fixed cells, several fluorescent antibodies directed againstmouse cell surface antigens have been identified to be useful.BD Cytofix can also be used to fix cells after immunofluorescent staining in order to preserve the light-scattering signals and fluorescentintensities of cells for analysis at a later time. Cell Fixation Buffer may be useful to avoid the capping or shedding of fluorescent antibodies and/orsurface antigens during the period before flow cytometric analysis.Procedure for fixing cells with BD Cytofix™:1. Pellet 10e6 suspended cells (e.g., cytokine-producing cells generated by stimulatory culture) by centrifugation (250 - 300 x g) and carefullyremove supernatants to avoid cell loss.2. Add either 200 µl (for microwell plates) or 500 µl (for tubes) aliquots of cold DPBS containing protein and NaN3, gently resuspend cells,pellet, and remove supernatants.3. Repeat step 2.4. Add either 100 µl (for microwell plates) or 250 µl (for tubes) aliquots of fixation buffer to each cell pellet and resuspend the cells by eitherpipetting or vortexing. Incubate the cells with fixation buffer for 15 to 30 min at 4°C. (Cell aggregation can be avoided by vortexing prior to theaddition of the fixation buffer.)5. Fixed cells should be washed and suspended in a buffer that contains protein and NaN3, e.g., either Stain Buffer (FCS) [Cat. No. 554656] orStain Buffer (BSA) [Cat. No. 554657]. Store the fixed cells at 4°C (protected from light) for subsequent immunofluorescent staining ofintracellular cytokines. It is recommended that fixed cell samples be read as soon as possible, i.e., within one week.For the immunofluorescent staining of intracellular cytokines, cells that have been previously fixed with BD Cytofix™ can be washed two timesin a buffer that contains protein and NaN3 followed by incubating the cells for at least 10 minutes (4°C) in a buffer containing thecell-permeabilizing agent, saponin. BD Perm/Wash™ buffer (Cat. No. 554723) is ideally suited for this purpose. The fixed and permeabilizedcells can then be stained for intracellular cytokines as described in detail in the Immune Function handbook (BD Biosciences. 2003. Techniquesfor Immune Function Analysis, Application Handbook 1st Edition), available:/pdfs/manuals/02-8100055-21A1rr.pdf.Procedure for fixing immunofluorescently-stained cells with BD Cytofix™:Cells stained by immunofluorescence for cell surface antigens can be fixed as described above and stored (4°C, protected from light) forsubsequent analysis by flow cytometry (or fluorescence microscopy).NOTE : BD Cytofix/Cytoperm™ solution (Cat. No. 554722) and the BD Perm/Wash™ buffer (Cat. No. 554723) are included in BDCytofix/Cytoperm Kit (Cat. No. 554714) as well as the BD Cytofix/Cytoperm Plus Kit with GolgiStop™ (containing monensin; Cat. No. 554715)and BD Cytofix/Cytoperm Plus Kit with GolgiPlug™ (containing brefeldin A; Cat. No. 555028).Warnings and Precautions: BD Cytofix Buffer contains formaldehyde.R40Limited evidence of a carcinogenic effect.R43May cause sensitization by skin contact.S2Keep out of reach of children.S13 Keep away from food, drink and animal feedingstuffs.S23Do not breathe gas/fumes/vapour/spray.S36/37Wear suitable protective clothing and gloves.S46If swallowed, seek medical advice immediately and show this container or label.S56Dispose of this material and its container at hazardous or special wasteSuggested Companion ProductsCatalog Number Size CloneName554656Stain Buffer (FBS)500 ml(none) 554657Stain Buffer (BSA)500 ml(none) 554723Perm/Wash Buffer250 tests(none) 554714BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeablization Kit250 tests(none) Product Notices1.Since applications vary, each investigator should titrate the reagent to obtain optimal results.2.Please refer to /pharmingen/protocols for technical protocols.ReferencesAlaverdi N, Waters JB. Pharmingen's Hotlines. 1997:6-15.(Methodology)BD Biosciences. Techniques for Immune Function Analysis, Application Handbook 1st Edition. 2003; Available:/pdfs/manuals/02-8100055-21A1rr.pdf 2007, Jan. 25.(Methodology)Lanier LL, Warner NL. Paraformaldehyde fixation of hematopoietic cells for quantitative flow cytometry (FACS) analysis. J Immunol Methods. 1981; 47(1):25-30.(Methodology)Sander B, Andersson J, Andersson U. Assessment of cytokines by immunofluorescence and the paraformaldehyde-saponin procedure. Immunol Rev. 1991;119:65-93.(Methodology)。
