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一、实验原理随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。
16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。
5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，仅几十bp，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分子量太大，分析较困难。
而16S rRNA相对分子量在2kb左右，较为适合PCR 扩增，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
16SrRNA的编码基因是16SrDNA，但是要直接将16SrRNA提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase降解，因而利用16S rDNA鉴定细菌，其技术路线如下：PCR实验原理即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
二、主要器具及试剂PCR、电泳系统、DNA提取体系、Taq Polymerase、DNA Marker，溶菌酶、dNTP和E.coli JM109感受态细胞、pMD18-T Vector、琼脂糖、SDS裂解缓冲液、50×TAE电泳缓冲液贮存液、1×TE（pH 8.0）三、操作方法1. 细菌基因组总DNA的提取接种纯化的菌株于LB液体培养基中，180 r/min，37 ℃培养过夜，按以下的方法提取细菌基因组总DNA。
一、基因组提取及电泳检测1．基因组提取过程：按照生工SK1201-UNIQ-10 柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取。
说明书附见SK1201.PDF文档。
2．基因组电泳分析图谱：二、PCR反应1．PCR体系建立（50ul）：Template （基因组）10pmolPrimer up (10uM) 1ulPrimer down (10 uM) 1uldNTP mix (10Mm each) 1ul10*Taq reaction Buffer 5ulTaq (5u/ul) 0.25 ul加水至50ul2.PCR 程序设定预变性98℃ 5mim ;循环 95℃ 35S , 55℃ 35S , 72℃ 1min 30s , 35个循环，延伸 8min3．PCR产物电泳图谱4．引物序列：27f 5’AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG 3 ‘ 20bp1492r 5’ GGTTACCTTGTTACGACTT 3’ 19bp三、DNA琼脂糖切胶纯化由PCR产物电泳结果切割所需DNA目的条带，纯化方式见附见说明书SK1131胶回收PDF文档.四、DNA 测序（见测序图谱）五、主要实验仪器PCR反应扩增仪（加拿大BBI公司）；3730测序列分析仪( 美国ABI 公司)SW-CJ-1D洁净工作台（江苏苏洁净化设备厂）；DK-8D型电热恒温水槽（上海森信实验仪器有限公司）；DYY-8型稳压稳流电泳仪（上海琪特分析仪器有限公司）；YXJ-2离心机（湘仪离心机仪器有限公司）H6-1微型电泳槽（上海精益有机玻璃制品仪器厂）；凝胶成像系统（Gene Genius公司），U-3010紫外-可见分光光度计(Hitachi公司)；移液器（范围100-1000μl，20-200μl，0.5-10μl）（加拿大BBI公司）；。
16s rdna测序原理16s rDNA测序是一种用于研究微生物群落结构和功能的重要技术，它可以帮助科研人员了解微生物的多样性和相互关系，对环境微生物的研究具有重要意义。
本文将介绍16s rDNA测序的原理及其在微生物学研究中的应用。
16s rDNA是细菌和古细菌的小亚基RNA基因的一部分，它在所有细菌和古细菌中都存在，并且在细菌的进化过程中具有高度的保守性。
因此，通过对16s rDNA序列进行测序和比对，可以帮助科研人员了解不同微生物的分类和演化关系。
在进行16s rDNA测序时，首先需要从样品中提取微生物的DNA，然后通过PCR扩增得到16s rDNA的片段。
接下来，对PCR产物进行纯化和测序准备，最常用的方法是通过测序仪进行Sanger测序。
随着高通量测序技术的发展，现在也可以使用Illumina、454或Ion Torrent等平台进行高通量测序，大大提高了测序的效率和速度。
得到16s rDNA序列后，接下来的工作就是对序列进行比对和分析。
科研人员可以利用公开数据库中的16s rDNA序列作为参考，通过比对来确定待测序列的分类地位和系统发育关系。
此外，还可以利用一些生物信息学工具对序列进行多样性分析、物种丰度分析等，从而了解微生物群落的结构和功能。
在微生物学研究中，16s rDNA测序被广泛应用于环境微生物群落的研究。
通过对土壤、水体、空气等不同环境中微生物的16s rDNA进行测序和分析，可以揭示微生物的多样性、分布规律以及其对环境的影响。
此外，16s rDNA测序还可以用于研究人体内的微生物群落，例如肠道菌群的研究，有助于了解微生物与宿主健康的关系。
总之，16s rDNA测序是一种重要的技术手段，它为科研人员提供了解微生物多样性、分类和系统发育关系的重要途径，对微生物学、生态学和生物医学研究具有重要意义。
随着测序技术的不断发展和完善，相信16s rDNA测序在微生物学研究中的应用将会更加广泛和深入。
一、 实验原理 随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA 杂交、rDNA 指纹图、质粒图谱和16SrDNA 序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA ，分别为5SrRNA 、16SrRNA 、23SrRNA ，rRNA 基因由保守区和可变区组成。
16SrRNA 对应于基因组DNA 上的一段基因序列称为16SrDNA 。
5SrRNA 虽易分析，但核苷酸太少，仅几十bp ，没有足够的遗传信息用于分类研究；23SrRNA 含有的核苷酸数几乎是16SrRNA 的两倍，分子量太大，分析较困难。
而16SrRNA 相对分子量在2kb 左右，较为适合PCR 扩增，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16SrRNA 作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
16SrRNA 的编码基因是16SrDNA ，但是要直接将16SrRNA 提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase 降解，因而利用16SrDNA 鉴定细菌，其技术路线如下：DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA 互补的子链DNA 的过程。
是一项DNA 体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA 。
二、主要器具及试剂PCR、电泳系统、DNA提取体系、TaqPolymerase、DNAMarker，溶菌酶、dNTP和感受态细胞、pMD18-TVector、琼脂糖、SDS裂解缓冲液、50×TAE电泳缓冲液贮存液、1×TE（）三、操作方法1.细菌基因组总DNA的提取接种纯化的菌株于LB液体培养基中，180r/min，37 ℃培养过夜，按以下的方法提取细菌基因组总DNA。
(1)菌体收集：取新鲜的菌液于EP管中，12000r/min离心30s，弃净上清，收集菌体。
一、实验材料菌种：某浸矿混合菌。
设备：eppendorf管、移液枪、台式高速离心机、电泳仪、水浴锅、PCR仪、无菌操作台、牙签、枪头、酒精灯。
试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒、LB液体培养基、LB固体平板培养基、TE 缓冲液（pH 8.0）、切胶回收试剂盒、Taq DNA polymerase，10 mM dNTPmix，引物，双蒸水，琼脂糖、溴乙锭EB、电泳缓冲液（50×TAE电泳缓冲液：取Tris 24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/L EDTA（pH8.0）20ml，加蒸馏水至100ml）、pGM-T 克隆试剂盒、Hind III、石蜡。
二、实验步骤1 细菌基因组DNA提取1.1 样品收集菌种培养至OD600为1-1.5，此时1 mL 菌液中约含1.0×109细胞，用灭过菌的1.5mL离心管去菌液1 ml，室温10,000 rpm离心1 min，收集菌体。
1.2 基因组DNA的提取（使用前先在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积参照瓶上的使用说明。
）1.向菌体沉淀中加入200 μl 缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮；2.向管中加入20 μl 蛋白酶K溶液，混匀；3.加入220 μl 缓冲液GB，振荡15秒，70℃放置10 min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；若溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯；4.加入无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；5.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；6.向吸附柱CB3中加入500 μl 缓冲液GD，12,000 rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3 放入收集管中；7.向吸附柱CB3中加入700 μl 漂洗液PW，12,000 rpm 离心30秒，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中；8.向吸附柱CB3中加入500 μl 漂洗液PW，12,000 rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；9.将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；10.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 μl 洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000 rpm 离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
一、实验原理随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。
16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。
5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，仅几十bp，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分子量太大，分析较困难。
而16S rRNA相对分子量在2kb左右，较为适合PCR 扩增，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
16SrRNA的编码基因是16SrDNA，但是要直接将16SrRNA提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase降解，因而利用16S rDNA鉴定细菌，其技术路线如下：PCR实验原理即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
二、主要器具及试剂PCR、电泳系统、DNA提取体系、Taq Polymerase、DNA Marker，溶菌酶、dNTP和E.coli JM109感受态细胞、pMD18-T Vector、琼脂糖、SDS裂解缓冲液、50×TAE电泳缓冲液贮存液、1×TE（pH 8.0）三、操作方法1. 细菌基因组总DNA的提取接种纯化的菌株于LB液体培养基中，180 r/min，37 ℃培养过夜，按以下的方法提取细菌基因组总DNA。
16s rdna测序原理16S rDNA测序是一种常用的微生物多样性分析方法，通过对16S rDNA基因的测序和分析，可以揭示微生物群落的组成和结构，对环境微生物的研究具有重要意义。
本文将介绍16S rDNA测序的原理及相关内容。
1. 16S rDNA基因简介。
16S rDNA是细菌和古细菌的小亚基核糖体RNA基因，其序列在细菌中高度保守，但又存在一定的变异性，这使得16S rDNA成为研究微生物系统发育和分类的理想分子标记。
在细菌和古细菌中，16S rDNA一般由9个高度保守的区域（称为conserved region）和10个变异区域（称为variable region）组成，其中变异区域的序列差异较大，可用于微生物的分类和鉴定。
2. 16S rDNA测序原理。
16S rDNA测序的原理是通过PCR扩增获得16S rDNA基因片段，然后对扩增产物进行测序，最后对测序结果进行分析和解读。
首先，从样品中提取微生物DNA，然后利用通用或特异引物对16S rDNA基因进行PCR扩增，得到所需的16S rDNA片段。
接下来，对PCR产物进行纯化和测序，通常采用Sanger测序法或高通量测序技术（如Illumina、454、Ion Torrent等）。
最后，利用生物信息学方法对测序结果进行分析，包括序列比对、物种注释、多样性分析等。
3. 16S rDNA测序分析。
在16S rDNA测序分析中，首先需要对测序结果进行质控和过滤，去除低质量序列和引物污染，然后进行序列比对和物种注释。
序列比对是将测序结果与16S rDNA数据库进行比对，找到最佳匹配的参考序列，从而确定微生物的分类和系统发育关系。
物种注释是根据比对结果，将未知序列注释为已知的微生物分类单元，如属、种等。
此外，还可以进行多样性分析，如Alpha多样性指数（反映微生物群落的丰富度和多样性）、Beta多样性分析（比较不同样品间的微生物群落差异）等。
细菌16SrDNA测序鉴定一、细菌总DNA提取二、16SrDNA的扩增1、以单菌落或菌悬液为模板的16SrDNA扩增体系25ul体系Buffer(含有Mg2+)：2.5 uldNTP：2.5 ul：3，-primer：0.5ul5，-primer：0.5ul模板：1个单菌落（或1 ul在LB培养液中37℃，12h的菌悬液）吐温20：2ulTaq酶：0.3水：16.7（或15.7ul）细菌16S rDNA的通用引物为Pf-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和Rf-TACCTTGTTACCACTT许敬亮博士论文66页：扩增采用通用的引物，其正向序列为：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向互补序列为： 5'-TTCAGCATTGTTCCAT-3'。
黄婷婷博士论文70页：5’端：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'（Escherichia colibases 8 to 27），3’端：5'-TACCTTGTTACGACTT-3'（Escherichia coli bases 1507 to 1492）。
2、以总DNA为模板的16SrDNA扩增体系25ul体系Buffer(含有Mg2+)：2.5 ul (购买)dNTP：2.5 ul：3，-primer：0.5ul5，-primer：0.5ul模板：1 ulTaq酶：0.3（或0.2ul）双蒸水：17.7（或17.8ul）3、PCR反应条件94℃，5min；95℃，变性30s；50℃～52℃（可根据扩增情况进行适当调节），退火30s；72℃，延伸1min；30个循环；72℃，延伸15min；10℃(or4℃)，保温10min(or nh)。
4、检测扩增效果取1～3 ul扩增产物,适量load buffer，以DL2000为Marker，上0.75%琼脂糖凝胶跑电泳（电压挑低些80～100，胶长些，利于各扩增产物分离及回收切胶）注：扩增条件摸索时每个模板只扩1管即可三、16SrDNA的回收扩增出的每一管16SrDNA经0.75%琼脂糖凝胶电泳检测后，将效果好的各管16SrDNA合并使达到60～100ul样量，100ul16SrDNA+10ul溴酚蓝跑电泳回收胶(电泳液需换成新鲜的,DL2000为Marker)，EB染色后在紫外灯下切下16SrDNA条带放入1.5ml离心管中(离心管事先称重)，按DNA凝胶回收试剂盒操作说明回收16SrDNA，取回收16SrDNA 2ul(Dl2000为Marker)跑电泳观察浓度(亮度)与纯度(条带数与位置)。
海润德饲用微生物菌种的16SrDNA分子鉴定技术路线一、海润德饲用微生物菌种的16SrDNA分子鉴定技术路线↓提取分离菌株基因组DNA↓以细菌基因组DNA为模板，P1、P2为引物，PCR扩增其16SrRNA↓PCR产物切胶回收↓连接PMD18T-vector↓转化Ecoli DH5а；蓝白斑初筛、PCR、酶切鉴定重组质粒↓将鉴定正确的重组质粒，送交测序↓测序结果在NCBI上BLAST分析二、试验方法1、细菌基因组提取方法方法一：细菌基因组简易提取方法（参考国外文献）1．取1.5ml细菌过夜培养物,12000rpm,离心0.5min,弃上清。
2．加入200ul lysis buffer( 40 mM Tris-Cl; 20Mm NaAC; 1Mm EDTA; 1%SDS.),剧烈振荡。
(移液枪反复吹打或者涡漩,目的使菌体充分悬浮)。
3．加入66ul 5M NaCl剧烈混合。
4．离心12000rpm,10 min 取上清。
5．加入等量氯仿:异戊醇(24:1),反复颠倒50次混匀.(呈牛奶色)。
6．离心12000 rpm ,10min,取上清。
7．加2倍的无水乙醇，置-20℃冰箱，沉淀DNA。
8．加适量70%乙醇漂洗沉淀9．DNA与超净台，风干。
10 加适量ddH2O溶解DNA。
11．加0.5-1 ul RNAase,37℃作用20 min 。
12．-20℃冰箱保存。
方法二：SDS/CTAB法1．取1.5ml细菌过夜培养物,12000rpm,离心0.5min,弃上清。
2．加500ul TE 缓冲液充分悬浮菌体。
3．加30μl 10%SDS,3μL 蛋白酶Ｋ，混匀，37℃,1h.4．加 100μl NaCL(5M) 混匀。
5．加80μl 的CTAB/NaCL,混匀；65℃ 10min 。
6．加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀。
7．离心12000rpm,4-5min8．重复6、7步骤，抽提2-3次9．12000 rpm ,离心10min,取上清。
16SrDNA-DGGE技术基本路线一样品总DNA的提取1 实验器材：玻璃器材，铝盖，1.5mL离心管，螺口管，锆珠，搅拌器，4℃离心机。
2 实验试剂：PBS（0.05M，pH=7），水饱和酚，TE饱和酚，TN150，TE缓冲液，TAE缓冲液，NaAc (pH=5.2),氯仿/异戊醇（24：1）（V/V），96%冷乙醇，70%冷乙醇。
3 实验操作：3.1 细胞分裂称取0.5g样品入含0.3g锆珠、已灭菌的screw-capped tube 中，加入1mL TN150，和150µＬ酸性酚，bead-beater匀浆（5000rpm,3min）,冰上冷却，加入150µＬ氯仿/异戊醇，涡旋混匀，10000rpm离心，5min转移上清液至已灭菌的eppendorf管3.2 DNA提取加入150µＬ氯仿/异戊醇，和150µＬTE饱和酚至上述eppendorf管中涡旋混匀1min，10000rpm离心1min，上清移入灭菌的eppendorf管中，重复上述步骤直至水相之间的界面清晰为止，上清移入灭菌的eppendorf管中，加入300µＬ氯仿/异戊醇，10000rpm离心1min，上清移入灭菌的eppendorf管中，加入96%冷乙醇1mL，和50µＬ3M NaAc (pH=5.2),-20℃沉淀DNA过夜。
10000rpm离心20min弃上清，加入500µＬ70%冷乙醇溶解沉淀，10000rpm离心5min弃上清。
风干沉淀加入50µＬTE缓冲液溶解DNA-20℃保存提取的DNA4实验注意事项：酚是致癌物质，实验操作应配带手套，且不要将该溶液洒在桌面上或地面上。
实验中使用了挥发性有毒物质，操作应在通风橱中进行。
实验过程中样品应放置冰面上，所有离心操作在4℃下进行。
二DNA的检测—琼脂糖凝胶电泳1试剂和器材：电泳缓冲液（1*TAE），溴乙锭（EB）染色贮存液（1mg/mL）,0.25%溴酚兰，琼脂糖，双蒸水。
用16S rDNA 方法鉴定细菌种属一、实验目的1. 掌握16S rDNA 对细菌进行分类的原理及方法；2. 掌握DNA 提取、PCR 原理及方法、DNA 片段回收等实验操作。
二、实验原理随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA 杂交、rDNA 指纹图、质粒图谱和16S rDNA 序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA ，分别为5S rRNA 、16S rRNA 、23S rRNA ，rRNA 基因由保守区和可变区组成。
16S rRNA 对应于基因组DNA 上的一段基因序列称为16S rDNA 。
5S rRNA 虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA 含有的核苷酸数几乎是16S rRNA 的两倍，分析较困难。
而16S rRNA 相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA 作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
利用16S rDNA 鉴定细菌的技术路线：PCR 的基本原理：必须已知部分序列设计出引物，10-30bp 。
细菌培养液 基因组DNA DNA 提取 PCR 扩增 16S rDNA 片段片段回收 连接克隆载体 阳性克隆鉴定 测 序 序列比对以此类推，呈几何级增长。
一般进行25-35个扩增循环DNA可扩增106~109倍。
三、实验步骤（一）细菌基因组DNA提取技术路线：具体步骤：1. 挑单菌落接种到10 mL LB培养基中37℃振荡过夜培养。
（前期由老师完成）2. 取2 mL培养液到2 mL Eppendorf管中，8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。
3. 再往同一离心管中2 mL培养液到2 mL Eppendorf管中，8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。
4. 加入200 μL 缓冲液GA，充分悬浮、混匀，将菌体彻底悬浮。
5. 再加入20 μL Protein K，混匀，55℃温育10分钟。
（55℃为酶最适温度）6. 加入220 μL缓冲液GB，混匀后，55℃温育10分钟。
（实为50-60℃之间）7. 加入220 μL 无水乙醇（降低体系粘稠度），充分混匀。
将上清（挑去其中絮状杂质，少部分，会产生气泡，除不去））小心转入UNIQ-10柱（羟基纤维素膜，特异吸附核酸，因为吸附有限，所以损失核酸）中。
13000 rpm（离心机最高设定实为10000rpm）离心5分钟，倒弃收集管内的液体。
6. 加入500 μL GD Solution，10000 rpm离心1分钟。
8. 加入500 μL 70％乙醇（Wash Solution），10000 rpm离心0.5分钟。
（离心机最小设定实为1min，仪表盘上显示时间的梯形最小面积为1min，所以没法在到梯形面积中间时按暂停）9. 再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。
吸附柱转移到一个新的1.5 mL的离心管。
10. 加入50 μL预热（60℃）的洗脱缓冲液（TE，含RNase），加到柱子中间的膜上。
60℃放置5分钟。
12000 rpm离心2分钟，流下的液体即为基因组DNA。
11. 电泳。
取5 μL提取DNA溶液+2μL Loading Buffer（不用吸放混匀，以免机械损伤DNA）进行电泳检测质量。
（吖啶橙做染色液，橙红色）（二）PCR扩增1. 根据已发表的16S rDNA序列设计保守的扩增引物。
16S (F) 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'16S (R) 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'2. PCR扩增体系：在0.2 mL Eppendorf管中加入1μL DNA，再加入以下反应混合液：16S (F) 1μL (10μM)16S (R) 1μL (10μM)2×PCR Mix 25 μL（含10×PCR Buffer，dNTP，Taq酶）ddH2O22 μL（最先加）反应体系50 μL，简单离心混匀。
3. PCR反应将Eppendorf管放入PCR仪，盖好盖子，调好扩增条件。
扩增条件为：94℃ 3 min94℃30 sec50℃（实为52℃）45 sec 35 cycles72℃100 sec（因为Taq酶1Kb/min,时间为经验所得）72℃7 min（充分延伸）4. PCR产物的电泳检测拿出Eppendorf管，取出全部溶液点入预先制备好的1%的琼脂糖凝胶大孔中。
电泳1 hr。
在紫外灯下检测扩增结果（下午1:50）。
（三）扩增片段的回收根据上步实验结果，如果扩增产物为唯一条带，可直接回收产物。
否则从琼脂糖凝胶中切割核酸条带，并回收目的片段。
1）称量一2 mL.的Eppendorf 管质量，记录0.99g 。
2）在紫外灯下切割含目的条带的凝胶，放入2 mL 的Eppendorf 管内，称量1,06g 。
计算凝胶质量0.07g 。
3）每100 mg 凝胶加入300 μL Buffer DE-A （促融），混匀。
70℃温育至凝胶融化。
4）加入0.5倍体积的Buffer DE-B （帮助连接），混匀。
全部转入UNIQ-10柱，10000 rpm 离心1分钟，倒去收集管（与之前的试剂盒中的收集管规格不同）内的液体。
5）加入500 μL Buffer W1（Wash Solution ），10000 rpm 离心1分钟，倒去收集管内的液体。
6）加入500 μL Buffer W2（去盐液，70%乙醇），10000 rpm 离心0.5分钟。
（离心机最小设定实为1min ）7）再10000 rpm 离心2分钟彻底甩干乙醇。
吸附柱转移到一个新的1.5ml 的离心管。
8）加入30 μL 预热的洗脱缓冲液（Eluent ），60℃放置3分钟。
12000 rpm 离心2分钟，流下的液体即为回收的DNA 片段。
（四）DNA 片段测序将回收的片段（足量）送至生物公司测序，测序引物为16S PCR 引物。
（Sanger 双脱氧法，一边PCR ，一边测序）四、实验结果及分析1．细菌基因组提取DNA 电泳结果：第十一泳道为我组结果，条带清晰，说明提取的DNA 含量较高。
正极 负极 点样孔（小孔，4ul ）DNA28sRNA18sRNA5.8sRNA2. PCR产物的电泳检测：负极正极点样孔为大孔，96μL。
Marker 6条带，清晰明亮。
第五泳道为我组结果，可见条带清晰，说明提取的DNA含量较高。
3. 根据测序结果，到NCBI Blast项目上进行比对，确定该未知菌的种属。
分析讨论实验的过程及结果。
选择序列三：1）打开网站，选取BLAST。
2）选择核酸比对3）将序列粘贴到框中，下面的方框选Reference genomic sequence，按BLAST，得到结果。
序列三与葡萄球菌属细菌的16S rDNA基因相同性最高,与Staphylococcus saprophyticus subspATCC.的16S rDNA基因的相同性为99%。
可初步判定序列三所属菌株可能是Staphylococcus属的成员。
如果要明确的得到其种属，还要进行相关的生理生化分析。
（四）结果处理：生成文件，制作进化树。
1）点击Rrna-16S ribosomal RNA进去后，按图示点击，Create Files,保存在文件夹中，供生成进化树时使用。
每一种保存一次，我们共对20组生成了文件，保存在一个文档中。
2）运行MEGA 5.05软件，按如下操作，打开下载下来的Sequence文件。
4）点击Alignment,Align by ClustalW，然后按OK键，等待。
5）得到以下画面，删除序列两端不能对齐的碱基（不同源）。
6）按Data,Phylogenetic Analysis,关闭窗口，将文件保存。
7）选择一个方法，构建系统发育树。
8）Bootstrap 选择1000，点击compute开始计算。
9）得到最终的进化树。
(我们用的是样品3，命名为Alice)五、分析讨论（一）本次试验主要是通过16S rDNA的方法来鉴定细菌种属，通过提取基因组DNA、PCR扩增、电泳检测，最后将得到的序列在NCBI上比对，找出与之同源性最大的菌种，最后用MEGA4软件制作出进化树。
在做这个时要注意的地方：①细菌基因组DNA的提取中，加入缓冲液GA后要彻底悬浮菌体，来回吸打几次，使菌体彻底悬浮，切记不要产生气泡。
②加完GB缓冲液后，手拿Eppendorf管轻轻地上下颠倒混匀，令其充分反应，破坏细胞膜。
加完无水乙醇后会看到澄清透亮的液体中有一团白色的残渣漂浮着，用枪头小心地把它挑出，避免抽入不溶性的絮状沉淀，否则后面会出现较多的粘稠状物质堵住膜孔③离心前要精确平衡，避免对离心机造成机械损害④预热的洗脱缓冲液要竖直打到硝酸纤维素膜上，该膜能特异性的吸附核酸，若打到壁上会造成损失⑤提取好的基因组DNA要在4℃条件下保存⑥在制作PCR扩增产物时，先加水，打DNA液时将枪头伸入水中，防止有DNA液损失在壁上。
其他的可以几个人一组制成大体系混合液，这样取用更加方便而且准确；⑦取液时注意试剂瓶上的标志，如10×、6×等，用前记得稀释；⑧割胶的时候要带手套，带好紫外线防护罩，防止伤害眼睛。
⑨通过查找资料，我们摸索出了在NCBI上进行序列比对以及构建进化树的方法，过程很艰辛，但结果令人欣慰。
⑩构建进化树时，一定要参考多和同学们讨论，有条件时多多向实验室的研究生学长学姐请教，他们经常会用到BLAST和MEGA软件，知道很多小技巧和注意事项，在做进化树的时候给我很大的帮助。
⑪（二）1．由于核糖体进化保守，所以可以通过测定核糖体16S rDNA（序列约1.5KB）来鉴定细菌种属。
若要鉴定真核生物，则测定核糖体18S rDNA。
2．氯仿抽提可以去除蛋白（中间层）和有机物，G+菌用溶菌酶，G-菌用细胞膜裂解液。
GA为Tris-Hcl，GB为裂解缓冲液SDS。
3．好引物的特点：扩增产物多，杂带少。
4．由于分子生物学实验的特点是实验时间长，中间等待时间长，涉及的高值仪器多，接触有害试剂多，实验原理较复杂，所以我们要严格遵守实验室纪律，认真做好实验，认真做好值日，从有限的学时中真正地学到东西。
