生物反应器优化——放大控制的最佳手段

生物反应器优化——放大控制的最佳手段在生物产业的生产中，中试放大、处理和控制的知识应该被分享和记载以便获得和维持卓越运营。

通过音频工程基本原理和彻底的过程理解，现代细胞培养工艺已经成功放大到大于25000L的体积。

这并不是偶然发生的，而是生物工程专家对生物反应器的性能和发展趋势作了系统全面的描述，开发了坚实可靠的放大工序，建立和维持了恰当的质控标准的结果。

对于一家cGMP标准的细胞培养工厂而言，那些对运行最佳实践进行确定并记载的生产商同时也是能够保持成功运行并以及时可靠的服务为病人提供优质生物产品的生产商。

图1.一个生物反应器内喷头位置的描述(并不是对应尺寸).生物反应器设计恰当的生物反应器设计可以解决许多可能会产生的问题。

一个不应该被低估的有关生物反应器设计的关键问题就是反应器间几何相似的重要性:维持纵横比、叶轮尺寸比、叶轮间距比和挡板的尺寸和位置将大大提高放大生产后的成功率。

恰当的生物反应器设计可以减少有限时间内的质量和过程验证，同时使得工艺过程更加稳健、操作更易成功。

另一个与生物工程中试放大成功有关的重要方面就是喷头的设计。

通常情况下，生物反应器内会安装两个喷头但是只有一个喷头用于种子生物反应器。

尽管工业生产中有不同型号的喷头可供使用，我们成功的补充运用了钻杆和喷射石。

钻杆产生大的气泡和低的kLa(后面将加以讨论)，而喷射石产生小的气泡和高的kLa 以至于同样气流速率下可以递送更多数量的氧气进入细胞悬液中。

图1和图2阐明了喷头的位置和两个喷头的类型。

生物反应器输送氧气进入细胞的能力可由方程1中所示的质量转移关系定义。

氧气浓度的改变由kLa、气泡中的平均饱和氧气浓度、溶解的氧气浓度([O2]dissolved)和任何存在细胞的氧气吸收控制(OUR)。

方程1：kLa可以根据功率/体积和表面气体流速的幂律函数作图。

对kLa的理解可以帮助我们估计生物反应器的OUR，预测所需氧气的流速和预测溶解的二氧化碳水平的时间和进程曲线。

基于过程的需要和喷头的能力，工艺工程师确定生物反应器的优化配置。

如果过程OUR需要足够低，默认的设置就是在种子生物反应器中使用一个钻杆，在生产反应器中使用两个钻杆。

钻杆和喷射宝石可以合并使用，但由喷射宝石提供的氧气转移能力却并不是必须的。

如果可能的话，应该避免使用喷射宝石，因为这样增加了生物反应器安装的操作复杂性、在维持溶解二氧化碳水平的过程中气流流速的手动改变、增加了泡沫和潜在的清洁问题。

图2.从喷射石（左）和钻杆（右）中喷射的气泡粒径的比较混合特性当对生物反应器的细胞培养混悬液进行放大时，对混合的特性进行详尽的理解是非常必要的。

如果生物反应器内的混合过程被很好的控制，那么细胞所生存的环境与实验室规模的生物反应器就非常相似，因此就很有可能重现小规模生物反应器的结果。

文献表明许多中试放大的方法都考虑了很多因素，包括匹配功率/体积、叶轮轮顶速度、体积混合雷诺系数和体积混合时间。

由于这些不同参数的特性，中试放大时要在一种条件下维持所有参数的特性是不可能的。

经验表明，不同尺寸的生物反应器间维持一个类似的功率/体积比可以大大增加生物反应器内混合恰到好处的可能性。

如方程2所示，P/Vi是叶轮几何形状、搅拌速率和工作体积的函数，其中ρ代表密度，n是叶轮的数目，Np代表叶片功率数。

N是搅拌速率，Di是叶轮直径，V是液体体积。

方程2：为了进一步对混合进行定性，不同搅拌速率的体积搅拌时间可以经由pH或者电导率、或者使用商用模型进行计算。

考虑到pH或者电导率，这样做可以测定全部液体达到99%均匀所需要的时间。

将kLa作图的结果、混合时间测定的结果以及P/V计算的结果合并可以帮助过程工程师选择适当的搅拌设定点，从而使中试放大取得成功。

一旦确定了搅拌的设定点，可以设定喷射方案以确保生物反应器中溶解的氧气维持在一定水平而二氧化碳能够有效的从生物反应器中除去，聚集的泡沫也可以保持在最小。

生物反应器控制和报警生物工程中的哺乳动物细胞培养需要监测和控制生物反应器的环境以确保稳定的生物工程表现。

需要控制的参数包括温度、搅拌、溶解氧气和pH。

其它参数例如细胞密度、营养浓度、预期和未预期的产品培养间接通过培养介质和饲料处方进行控制，并受物理和化学参数影响很大。

忽略了这些参数的控制可能会影响最终产品的质量，因此可以采用在线测定以维持培养液在最优状态。

生物反应器的控制方案如下面的步骤所叙。

参数的监测和控制需要使用适当的分析设备、取样方法和能够恰当的处理接受信息的控制系统。

在线的监测和控制系统是快速的、非损伤性的并能够使引入污染的可能性降到最小。

该系统可以在生物反应器内外进行操作但是可以直接连到生物反应器内部。

传统的与在线分析有关的参数包括pH,溶解氧气的浓度,搅拌,反压力和温度。

额外的化学参数的测定包括细胞密度和存活率、废物代谢以及离线测定的营养物质和产品浓度（尽管许多技术正在使在线测定成为可能）。

在线控制使用探针，其中每个探针都有一个传感器，传感器的功能就是搜集与细胞培养生长状态有关的信息。

这些信息被转换成可以放大的信号、记录并且分析以便驱动可用的控制方案。

由此可见，这些信息应该与生物过程的现在和未来状态有关、能够快速产生并使用最小的人工干预进行处理。

传感器的选择具有下面的标准:引起污染的可能性、传感器元件的耐用性和可靠性、相应测量的参数具有特异性并对生物反应器的恶劣环境不敏感。

当最小化停工期时，维持可重复的和可接受的产品质量和生产效率是有效的生物过程监测和控制策略的驱动因素。

有效的生物反应器控制使得监测所承担的并不仅仅只是基本的控制参数。

例如，我们曾经遭遇到这种情况：pH位于控制范围内，但是碱液一直在加入罐内，当时控制器已经输出零值而不再给出加入碱液的指令。

后来我们调查发现，从碱容器到生物反应器的管并没有正确的连接到蠕动泵，碱液一直渗透经过泵进入生物反应器。

我们还遇到一个种子生物反应器氧气过高的问题。

这引起生长变慢、存活率降低和乳酸产生过多。

这个事故的调查结果发现氧气泄露进入空气管路。

DO探针每次指令都会进行校正，但是氧气泄露导致错误的读数和不正确的生物反应器的控制。

这些错误读数的唯一指示就是DO探针的纳米安培读数，其比正常值高很多。

温度控制温度是一个需要全程监测和控制的重要参数以确保哺乳动物细胞数目持续增长和繁殖。

一般来说，±0.5℃的精确性对于细胞培养来说是充分的，尽管暂时的异常会超出温控范围，但对产品的质量和细胞生长状态不会有影响。

经典的生物反应器测量装置是阻温测定装置（RTDs），该设备高度精确、可重复，只是有一些昂贵。

这些设备的响应时间只有几秒。

这些RTDs通过铂线传递温度的变化来定量温度。

在RTD的温度控制传感器里，信号被放大、线性化并传递到控制器，在那里与设定点进行比较。

在持续比较的基础上，通过对生物反应器周围的夹套的温度进行调节来控制生物反应器的温度。

如果温差存在并记录下来，夹套的温度可以通过使用热交换器进行调节。

溶解氧气控制哺乳动物细胞需要氧气以便生产有机碳来源的能量-例如葡萄糖。

考虑到氧气在水中的溶解度较差，需要仔细的控制氧气的流量以确保这个环节不会成为生产过程中的限速因素。

相反，一个高氧的生物反应器空气供应可以不可逆的反向影响培养效果。

由于波动的细胞浓度以及与此相关的氧气消耗率，细胞培养基中溶解氧气的量(DO)是一个动态学的平衡状态。

在常温状态下，细胞培养基中溶解氧气的量(CL)与培养基中气相中氧气的量成一定比例，其比例系数与温度与培养基中组分有关（用Henry常数表示，等式中的H）CL = HCG一般情况下使用电流计DO探针测量阴极氧气的减少和阳极氯化银的形成，使用电解液桥接节点间的空隙。

考虑到电流计DO探针的本性，使用前有必要对这些探针进行活化。

然后进行校正，如果探针不在可接受的校正范围内，就需要置换探针的膜体和电极。

PH控制除了温度和溶解氧气的控制外，有效的pH控制对于工艺过程的成功也非常重要。

由于细胞的高度敏感性，如果pH控制没有被检测，那么细胞损伤就有可能发生。

尽管细胞培养基本身可以提供一定程度上的pH的缓冲，但是哺乳动物细胞代谢过程中会不断产生乳糖和二氧化碳，而这两者都是酸性的，因此，培养基的pH会降低。

过度的氢离子浓度会通过损伤底物的吸收和产物的释放而改变正常的细胞代谢和繁殖。

此外分泌的一些单克隆抗体和治疗多肽的生活活性也会受pH 影响。

有代表性的是，生物反应器的pH探针在安装到罐体的传送器和使用前要进行校正。

经典的校正是使用两种缓冲液，校正操作在缓冲液介质中进行。

失败的校正一般是因为pH探针受损，也可能是由于电缆或者传送器的缘故。

由于探针漂移、慢的响应时间或者敏感度降低，即使pH探针进行了校正，偶而也会观察到不准确的读数。

这些错误的读数通常是由于极度的温度变化和细胞介质污染导致的传感器膜的改变引起的。

作为一个结果，需要使用作为金标准的直角pH测定方法对探针进行重新校正。

中试阶段的生物反应器通过使用两个分离的PID环路可以获得有效的pH控制，其中一个是酸性控制器，另外一个是腐蚀性控制器。

在一个碳酸盐的缓冲体系，酸性控制器控制二氧化碳的流量并对相应参数进行设定以便当二氧化碳的流量快速上升并且超过酸性控制器所设定的安全点时能够立即关闭。

液体腐蚀性控制器利用脉冲宽度调节器来控制腐蚀性蠕动泵开关的时间。

蠕动泵的设定点根据每一个生产指令进行手工设定，然后控制器就只负责开关蠕动泵了。

通过对控制环路进行调节可以改变测量的频率和脉冲的附加和持续时间从而有效的影响控制的水平。

由于腐蚀性饲料的高pH，饲料可以通过一个亚表面的端口快速加入生物反应器中并分散到培养基中。

溶解的二氧化碳控制溶解的二氧化碳（pCO2）水平可以预测细胞代谢，因此是细胞培养状态的常规检测指标。

一般来说，如果溶解的二氧化碳的浓度极低或者极高，所培养的哺乳动物细胞会很敏感。

高的二氧化碳浓度会抑制细胞的生长和代谢从而影响所得产品的质量，例如蛋白产品的糖基化。

有几个参数可能会影响pCO2的水平，包括pH设定点、温度、碳酸钠浓度、细胞代谢、介质中的碱性添加剂和空气流量。

每个参数都必须被仔细考虑以使pCO2得到成功控制。

通常，pH、温度和重碳酸盐的浓度在控制pCO2的过程中并不被调节，而是控制气流量和所加入的碱性添加剂来维持pCO2浓度在期望的范围内。

作为经验选择气流量来调节溶解二氧化碳的量在预期范围内，这说明二氧化碳的水平主要受通过生物反应器的总气体流量影响而不是kLa。

如果培养液pH超出参数值死区的酸性点，增加空气流量吹走二氧化碳可能会导致加入碱量的减少。

减少的碱量会导致培养终点更低的pCO2，那时候乳糖的水平显著减少。

尽管如此，如果pH在死区的碱性点，当通入二氧化碳时，增加空气流量只会导致二氧化碳流量增加而不会影响pCO2。