植物愈伤组织诱导培养基的配制

班级：植物092 姓名：徐炜佳学号：0901080223愈伤组织的诱导和培养一、实验目的及意义植物愈伤组织的诱导和培养在植物科学的基础研究和应用研究中都有重要的意义。

通过本次实验，可以初步掌握植物外植体材料消毒、接种的无菌操作技术，愈伤组织的诱导方法和愈伤组织继代培养的方法。

二、实验原理植物组织与细胞培养是应用无菌操作的方法培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。

如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择适当的消毒剂对植物外植体进行表面消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得植物组织培养，成功的基本前提和重要保证。

由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织（callus）。

植物生长调节剂如2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）等是诱导外植体形成遇上组织的重要因素。

三、实验仪器与药品超净工作台，酒精灯，镊子，剪刀，解剖刀，75%乙醇，酒精消毒棉材料：烟草无菌苗，甘薯无菌苗四、实验步骤1.按下表分别配制培养基将配置的四种培养基分别分装入20个培养瓶，高温灭菌后水平放置凝固2.接种前，将实验所需器具放入超净工作台，打开紫外灯灭菌20~30min，关闭紫外灯，开启通风开关。

洗手后用酒精喷洒消毒手、手臂、实验材料及培养基外部等进入超净工作台的部分。

进入超净工作台，用酒精棉擦拭台面（手勿伸出工作台），台面完全风干后点燃酒精灯。

3.接种开始时，将镊子及手术刀在酒精中浸泡，并在酒精灯外焰上烧炽片刻，充分冷却。

取幼嫩的烟草（甘薯）叶片，用手术刀切割成小片，再用镊子将其接种至相应的培养基上，每瓶接种3~5片，封口后取出超净工作台，标注姓名、日期、培养基和接种材料。

4.将上述培养材料常温暗培养，每隔7天观察一次，并记录培养情况五、实验结果组织长芽，而当生长素含量大于细胞分裂素含量时，二者共同作用在室温下可诱导外植体生成不定根，也可形成愈伤组织，细胞色素沉淀情况严重；NAA为植物生长素，6-BA为细胞分裂素，促进扦插生根，而当细胞分裂素含量大于生长素含量时，二者共同作用在室温下可诱导外植体生成不定芽，此次实验由于温度非形成愈伤组织的最适温度，所以未形成完整的愈伤组织细胞团。

水稻愈伤组织的诱导实验报告实验目的：本实验旨在探究水稻愈伤组织的诱导方法，为将来的水稻遗传改造研究提供参考。

实验材料和仪器：1. 材料：水稻种子、MS培养基、植物生长调节剂2,4-D、生长调节剂TDZ、无菌器具、琼脂、无菌操作室。

2. 仪器：无菌操作台、显微镜、实验室平衡器等。

实验步骤：1. 生物材料准备：选取幼苗期生长良好、品种鲜明的水稻种子作为材料。

将水稻种子进行表面消毒，处理方法为分别用70%的酒精和5%的次氯酸钠(1:1)混合消毒3-5分钟，然后充分清洗。

2. 建立组织培养体系：将消毒后的水稻种子在无菌操作台上进行分离培养。

将种子取出后，从胚乳中取出胚轴，用剪刀消毒后放入含有MS培养基的无菌培养瓶中，置于无菌操作室中进行培养。

在35-37°C下连续培养3-5天。

3. 筛选愈伤组织：将培养2-3天的胚轴等植物试管苗等组织放置在含有不同浓度的2,4-D和TDZ的培养基中，培养10-15天。

筛选出生长具有愈伤能力的组织，采用显微镜等方法进行观察，并进行相应的分离和培养。

4. 愈伤组织的维持和复壮：将筛选出的愈伤组织维持在含有2,4-D和TDZ的培养基中，定期进行转移或分离。

当愈伤组织增生至一定程度后，将其转移到不含激素的培养基中，进行复壮。

实验结果：在实验过程中，我们选择了4个不同浓度的2,4-D和TDZ进行培养，筛选出了愈伤组织，并进行了维持、修复工作。

经过5次转移和增殖培养，我们成功地建立了稳定的水稻愈伤组织体系。

结论：本实验采用的方法可行，成功地建立了稳定的水稻愈伤组织体系。

本研究为今后的水稻遗传改造和抗性育种提供了良好的基础。

植物组培培养基及其配制培养基好比土壤，是组织培养中离体材料赖以生存和发展的基地。

因此，在组织培养基的各个环节中，应着重掌握培养基，了解它的组成和配制方法。

一、组成培养基的五类成分目前，大多数培养基的成分是由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等五类物质组成的。

1.无机营养物无机营养物主要由大量元素和微量元素两部分组成，大量元素中，氮源通常有硝态氮或铵态氮，但在培养基中用硝态氮的较多，也有将硝态氮和铵态氮混合使用的。

磷和硫则常用磷酸盐和硫酸盐来提供。

钾是培养基中主要的阳离子，在近代的培养基中，其数量有逐渐提高的趋势。

而钙、钠、镁的需要则较少。

培养基所需的钠和氯化物，由钙盐、磷酸盐或微量营养物提供。

微量元素包括碘、锰、锌、钼、铜、钴和铁。

培养基中的铁离子，大多以螯合铁的形式存在，即FeSO4与Na2—EDTA(螯合剂)的混合。

2.碳源培养的植物组织或细胞，它们的光合作用较弱。

因此，需要在培养基中附加一些碳水化合物以供需要。

培养基中的碳水化合物通常是蔗糖。

蔗糖除作为培养基内的碳源和能源外，对维持培养基的渗透压也起重要作用。

3.维生素在培养基中加入维生素，常有利于外植体的发育。

培养基中的维生素属于B 族维生素，其中效果最佳的有维生素B1、维生素B6、生物素、泛酸钙和肌醇等。

4.有机附加物包括人工合成或天然的有机附加物。

最常用的有酪朊水解物、酵母提取物、椰子汁及各种氨基酸等。

另外，琼脂也是最常用的有机附加物，它主要是作为培养基的支持物，使培养基呈固体状态，以利于各种外植体的培养。

5.生长调节物质常用的生长调节物质大致包括以下三类：(1)植物生长素类。

如吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。

(2)细胞分裂素。

如玉米素(Zt)、6-苄基嘌呤(6-BA或BAP)和激动素(Kt)。

(3)赤霉素。

组织培养中使用的赤霉素只有一种，即赤霉酸(GA3)。

二、常用培养基配方及其特点1.常用培养基配方组织培养是否成功，在很大程度上取决于对培养基的选择。

实验1 愈伤组织的诱导1、实验目的（1）学习植物材料表面灭菌的常规方法；（2）了解接种的无菌操作技术；（3）学习诱导植物器官形成愈伤组织的方法。

2、实验原理植物组织培养是应用无菌操作的方法，培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。

如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择合适的消毒剂对植物外植体进行消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得组织培养成功的前提和重要保证。

由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上，可以通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织。

3、实验仪器和试剂仪器：超净工作台、光照培养箱、酒精灯、打火机、记号笔、脱脂棉、75%酒精及棉球。

无菌器材：无菌吸水纸（定性滤纸）、灭菌培养皿、无菌水、镊子、解剖刀。

植物材料：直根胡萝卜、烟草叶片。

试剂：95%乙醇、0.1%氯化汞。

培养基：MS+1mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+10g/L琼脂,pH5.84、实验步骤（1）接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯及接种间紫外灯，照射约30 min，然后关闭紫外灯，通风20 min后，打开日光灯即可进行无菌操作。

（2）外植体预处理：将胡萝卜根用流动的自来水冲洗干净，用小刀削去其表皮1-2mm，切成大约15-20mm厚的块段。

（3）以75%乙醇棉将手擦试一遍。

以下操作全部在无菌条件下进行。

（4）外植体消毒：用0.1%的升汞消毒1min-3min（烟草叶片消毒10秒钟左右）,然后用无菌水中漂洗3次，每次2分钟。

（5）将胡萝卜片放入垫有无菌滤纸的培养皿中，一手用消毒好的镊子固定胡萝卜，一手用灭菌后的解剖刀切除胡萝卜块段截面的表面部分，余下部分切成包含形成层的长、宽约5mm，厚约5mm的小块。

在完成切割后，将解剖刀和镊子放入95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后，放回原处，待冷却后即可使用。

备注：培养基和激素母液配制方法（1）母液配制时，先向容量瓶中注入1/3定容体积的蒸馏水，再一一称取各种盐放入烧杯中溶解，装入容量瓶，不得一次称取所有盐，混合溶解！在配制大量母液时，氯化钙最后加入。

（2）200×Fe盐溶液称取1.39g FeSO4•7H2O溶于水（A液）；称取1.865 g Na2•EDTA溶于热水（B液）；将A液缓慢倒入正在加热的B液中，加水接近250ml，煮沸，混合液颜色变深，冷却到室温，定容到250ml后,置于棕色试剂瓶内4℃保存。

（3）0.5mg/ml 2,4-D母液的配法称取50mg 2,4-D，置于小烧杯内；加少量无水乙醇或95%乙醇使之完全溶解；加水定容至100ml，4℃保存。

如果出现沉淀，需要重新配置。

（4）0.5mg/ml α-NAA母液的配法称取100mgNAA置于小烧杯内；用1N的KOH溶液溶解NAA；用水定容至200m l，4℃保存。

（5）0.5mg/ml 6-BA母液的配法称取100mg 6-BA置于小烧杯中；加少量的浓盐酸，用玻棒研磨成糊状，再加入少量浓盐酸，使之完全溶解；用水稀释并定容至200ml，4℃保存。

（6）100mM乙酰丁香酮（As）的配制称取196.2mg As，用5ml DMSO直接溶解，再加水定容至10ml，过滤灭菌后，分装入无菌小管，-20℃冰冻保存。

使用前加入灭菌培养基。

（7） 0.5mg/ml KT和ABT的配法称取50mg kenetin或ABT生根粉，先用少量1N KOH溶解，再用水稀释定容至100ml，4℃保存。

（8）其他附加物的溶解及配制A、称取吗啉乙磺酸（MES）5g溶于水中，定容至10mL。

4℃保存。

B、称取1g L-半胱氨酸(Cys) 溶于2mL 0.2mol/L或10%的NaOH溶液, 用蒸馏水稀释定容至10mL，现用配制。

4℃保存。

C、称取850mg硝酸银，用蒸馏水溶解后定容至100mL。

4℃保存。

D、头孢霉素（cefotaxime）2500mg，用蒸馏水溶解后定容至10mL。

水稻愈伤组织的诱导实验报告
实验目的：
通过诱导方法获取水稻愈伤组织，为后续的基因转化等实验打下基础。

实验材料和设备：
水稻种子、MS培养基、2,4-D溶液、NaClO溶液、无菌操作
器材、显微镜等。

实验步骤：
1.种子消毒：将水稻种子放入1% NaClO溶液中浸泡10分钟，再用去离子水洗净后，放进无菌操作室中。

2.种子发芽：将消毒后的种子放进含有营养的MS培养基中，
在25℃下进行光照培育。

3.愈伤组织诱导：将发芽后的幼苗从培养基中取出，用无菌水
清洗。

将茎部和叶片等不同部位的组织嫁接在含有2,4-D溶液
的MS培养基上，培养在25℃下、光照下，观察诱导组织的
生长情况。

4.分离愈伤组织：当组织生长到一定大小后，用无菌操作器材
将组织用无菌剪刀分离下来。

5.愈伤组织培养：将分离出的愈伤组织放入含有NAA、BA、MS培养基中进行培养。

结果分析：
在诱导的茎部和叶片等不同部位，均出现了白色愈伤组织的诱导生长。

经过分离和培养，得到了纯化的愈伤组织。

通过显微镜观察发现，愈伤组织的细胞间隙变窄，胞间质增多，中心细胞数量增多，细胞核增大，一些细胞内的小器官也出现转化现象。

结论：
通过2,4-D溶液的诱导方法，可以在水稻幼苗的不同部位诱导出白色愈伤组织，愈伤组织的分离和培养也取得了成功。

实验结果为后续的基因转化、基因工程等实验提供了基础。

实验一植物愈伤组织诱导培养基的配制一、实验目的掌握培养基的配制，灭菌等基本实验操作技术。

二、实验原理培养基是离体培养组织或细胞赖以生存的营养基质，是为离体培养材料提供的近似生物体内生存的营养环境。

完善的植物培养基配方为水、无机营养成分、有机营养成分、生长调节物质还有琼脂。

MS培养基是目前使用最普遍的培养基。

其具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长。

MS固体培养基可用于诱导愈伤组织，也可用于胚、茎段、茎尖及花药的培养，其液体培养基用于细胞悬浮培养时能获得明显的成功。

MS培养基的无机养分的数量和比例比较合适，足以满足植物细胞在营养上和生理上的需要。

和其它培养基的基本成分相比，MS培养基中的硝酸盐、钾和铵的含量高，这是它的显著特点。

三、主要仪器与试剂1.实验仪器：搪瓷杯、玻璃棒、量筒、移液管、加样器、移液枪、电子天平、药匙、称量纸、电热炉、pH试纸、三角培养瓶、试剂瓶、培养皿、高压蒸汽灭菌锅、镊子、解剖刀2.实验试剂：琼脂、蔗糖、各类MS母液、2,4-D、HCl、NaOH、三蒸水四、实验步骤1.按照配方配制培养基时,先将储存母液按顺序摆放好，根据欲配制的总体积，量取各种不同体积的母液，加入搪瓷杯中，并加入1mL2，4-D后，加入三蒸水至大约400ml。

2. 称取15g蔗糖加入搪瓷杯中，调节pH至5.7-5.8。

3.加入琼脂4.5g，加热搅拌溶解，沸腾后立即端离火源，分装在100ml的三角培养瓶中拧紧瓶盖。

4.取一个试剂瓶，加入适量去离子水。

5.将配置好的培养基、装有去离子水的试剂瓶以及一个空试剂瓶、培养皿、镊子、解剖刀放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌，备用。

五、实验结果MS培养基配制完成。

植物组织培养前期准备完成。

六、思考题1.培养基配制应注意哪些问题？①注意琼脂和蔗糖的称量②一定要添加2,4-D③配制MS培养基时应该注意调节pH至5.7~5.8，因为过酸培养基不易凝固，过碱培养基会变硬，同时过酸或过碱还会影响到培养材料的生长。