实验室检测技术概要ppt课件
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实验室常用检测技术简要介绍
;
1
主要内容
➢ 概述 疾病鉴别诊断过程 临床症状和大体病变检 ➢ 病料中细菌的检测 ➢ 病料中病毒的检测
病料的采集及处理
实验室检验
;
2
一 、疾病鉴别诊断过程
临床标本的采集及处理 原则
合理的采样时机 正确的采样方法 适宜的采样部位
;
3
一 、标本采集
尽量在病程的早期采集；标本应放置无菌容器中；标本应做适当的标记， 如动物、地点、时间、暂定的诊断等。
;
36
SYBR Green I染料法
与DNA结合时发光
游离时不发光
染料法的优点：成本低不需要探针；适合初步筛查先用SYBR筛查，再用TaqMan精 确定量部分关键样品；融解曲线鉴定PCR有无杂带、引物二聚体； 染料法的缺点：无模板特异性 不能分辨主带与杂带，给出的是总信号；不能做多
重检测 每孔只能检测一个目标基因；灵敏度低适合于5000 拷贝以上的基因定量。
;
5
病原学检测常用的实验室技术
分离培养 （“金标准”） 形态学检查 （病毒 电镜镜检） 细菌的生化试验 动物实验 免疫学诊断技术 ELISA IFA 免疫组化 分子生物学诊断技术 PCR 荧光定量PCR
;
6
二、病料中细菌的检测方法
细菌的形态学检查 细菌的分离培养 细菌的生化试验 动物试验 血清学试验 分子生物学方法
virus
;
23
补体结合反应
Ag 补体
Ab
红细胞 溶血素
溶血 （-）
Ag
红细胞 不溶血 （+）
补体
Ab
溶血素
;
24
免疫扩散
;
25
电镜技术
鸡痘病毒（超薄切片） ;
狂犬病毒包涵体 （Negri body）
26
ELISA分类
;
27
;
28
;
29
ELISA Procedures
;
30
;
31
分子生物学方法
;
14
革兰氏染色
染色原理及过程：
革
初染（结晶紫）
兰 氏
媒染（碘液）
阳
脱色（ 95％酒精）
性
复染（复红）
革 兰 氏 阴 性
;
15
细菌的生化试验
靛基质试验
硫化氢试验 糖发酵试验 MR试验
VP试验
;
16
药敏试验示意图
贴上药敏纸片 2
涂布细菌 1
温箱培养 3
测量抑菌圈 4
;
17
以大肠杆菌为例：
7 cycle = 128 Amplicon
;
No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target
1
2
2
4
3
8
4
16
5
32
6
64
20
1,048,576
30
1,073,741,824
35
荧光定量PCR Taqman 技术
• 特异性荧光双标 记探针
• Taq酶 5’→3’外切 酶活性
PCR (Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)
荧光实时定量PCR （real time PCR） NASBA （依赖核酸序列的扩增）
;
32
PCR原理:实质就是体外基因复制技术
靶序列
Mg2+
dCTP dGTP dUTP dATP
Primer
Taq DNA聚合酶 加热变性95 °C
1 唾液在生理理盐水中常加0.5%明胶或BSA，以保护不稳定病毒。 2 鼻、咽及肛门拭子 3 粪便标本 4 脑脊髓液、心包液、尿液等 5 尸体材料
死后应尽早获取，无菌采取，不使用防腐剂。
不同病毒所取材料不同，如NDV，取脑、气管，FMV取肺、PRRS取肺、 SFV取淋巴结等。
;
4
二 标本的保存和运送
尽量活体送检，大部分病毒不稳定，必须尽快送实验室；如有延误， 则标本必须冷藏，到实验室立即处理和接种，延误时间短的，可置4℃； 时间延误较长，置-70℃。 如邮寄标本则需放置有干冰的保温箱内。
三 标本处理
1 体液 可以直接接种、检测 2血标本 凝固血离心后的血清即可用于检测 3各种拭子 4粪便标本 5 组织材料
般
程
序
血清学试验
分子生物学技术
;
19
常用检测方法
分离培养 血清学 中和试验 补体结合试验 血凝及血凝抑制试验 免疫扩散试验 免疫学诊断技术 ELISA IFA 免疫组化 分子生物学检测 PCR 分子杂交技术
;
20
病毒分离
标本采集
杀灭杂菌 （青链霉素）
接种
三大方法
易感动物
出现病状
鸡胚 病变或死亡
;
13
HE（苏木素伊红)琼脂平板
不发酵乳糖的某种肠
发酵乳糖的某种肠杆菌。 道菌，而且产生硫化 氢，可能是沙门氏菌
不发酵乳糖的肠道菌， 可能就是志贺氏菌。
本培养基倾注平皿待冷却后呈草绿色，质控菌株接种后。36±1℃培养 18—24h，观察结果 。大肠杆菌部分被抑制，橙黄色-橙红色。葡萄球 菌生长被抑制。
AmpErase
靶序列引物退火55 °C 引物延伸72 °C
;
33
原理图示
一
二
三 完成一个循环
;
34
30次循环后靶序列扩增的数量
1 cycle = 2 2 cycleAm= p4liAcomnplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon
;
7
细菌的形态观察
光学显微镜下细菌的形态
;
8
光镜和电镜的比较
大 肠 杆 菌
葡 萄 球 菌
光学显微镜镜检 ;
电镜镜检 9
培养结果
初次分离
纯培养
鉴别培养
;
10
麦康凯平板
不乳糖
发酵乳糖
;
11
EMB平板
不发酵乳糖的细菌
大肠杆菌，呈现黑色金属光泽
;
12
SS平板
大肠杆菌或者别的发酵 乳糖的肠杆菌
有黑色中心的是沙门氏菌。如果 没有黑色中心，就很可能是志贺 氏菌了。
;
37
举例：基于结核分枝杆菌插入序列IS1081，建立SYBR Green荧光定 量PCR方法。实验结果：
细胞培养
细胞病变
鉴定病毒种型
;
21
病毒的分离与鉴定
1．动物接种
2．鸡胚培养
3．组织培养
;
22
病毒中和试验 本实验极为特异和敏感，是病毒学中重要的血清学实验。主要用于病毒
感染的血清学诊断、病毒分离株的鉴定、不同病毒株的抗原关系研究、疫苗 免疫原性的评价、免疫血清质量的评价以及实验动物中是否存在相应的抗体 等。
1. 剖检（采集病料） 2. 纤维素渗出物的涂片染色 3. 分离培养（普通营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板或伊红美兰琼脂平板） 4. 培养物涂片G染色 5. 生化试验 6. 动物试验 7. 血清学实验 玻板凝集鉴定血清型
;
18
三、病料中病毒的检测
Baidu Nhomakorabea
病
毒
标本采集与送检
分
离 和
病毒的分离鉴定
鉴
定
的
电镜技术
一
;
1
主要内容
➢ 概述 疾病鉴别诊断过程 临床症状和大体病变检 ➢ 病料中细菌的检测 ➢ 病料中病毒的检测
病料的采集及处理
实验室检验
;
2
一 、疾病鉴别诊断过程
临床标本的采集及处理 原则
合理的采样时机 正确的采样方法 适宜的采样部位
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3
一 、标本采集
尽量在病程的早期采集；标本应放置无菌容器中；标本应做适当的标记， 如动物、地点、时间、暂定的诊断等。
;
36
SYBR Green I染料法
与DNA结合时发光
游离时不发光
染料法的优点：成本低不需要探针；适合初步筛查先用SYBR筛查，再用TaqMan精 确定量部分关键样品；融解曲线鉴定PCR有无杂带、引物二聚体； 染料法的缺点：无模板特异性 不能分辨主带与杂带，给出的是总信号；不能做多
重检测 每孔只能检测一个目标基因；灵敏度低适合于5000 拷贝以上的基因定量。
;
5
病原学检测常用的实验室技术
分离培养 （“金标准”） 形态学检查 （病毒 电镜镜检） 细菌的生化试验 动物实验 免疫学诊断技术 ELISA IFA 免疫组化 分子生物学诊断技术 PCR 荧光定量PCR
;
6
二、病料中细菌的检测方法
细菌的形态学检查 细菌的分离培养 细菌的生化试验 动物试验 血清学试验 分子生物学方法
virus
;
23
补体结合反应
Ag 补体
Ab
红细胞 溶血素
溶血 （-）
Ag
红细胞 不溶血 （+）
补体
Ab
溶血素
;
24
免疫扩散
;
25
电镜技术
鸡痘病毒（超薄切片） ;
狂犬病毒包涵体 （Negri body）
26
ELISA分类
;
27
;
28
;
29
ELISA Procedures
;
30
;
31
分子生物学方法
;
14
革兰氏染色
染色原理及过程：
革
初染（结晶紫）
兰 氏
媒染（碘液）
阳
脱色（ 95％酒精）
性
复染（复红）
革 兰 氏 阴 性
;
15
细菌的生化试验
靛基质试验
硫化氢试验 糖发酵试验 MR试验
VP试验
;
16
药敏试验示意图
贴上药敏纸片 2
涂布细菌 1
温箱培养 3
测量抑菌圈 4
;
17
以大肠杆菌为例：
7 cycle = 128 Amplicon
;
No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target
1
2
2
4
3
8
4
16
5
32
6
64
20
1,048,576
30
1,073,741,824
35
荧光定量PCR Taqman 技术
• 特异性荧光双标 记探针
• Taq酶 5’→3’外切 酶活性
PCR (Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)
荧光实时定量PCR （real time PCR） NASBA （依赖核酸序列的扩增）
;
32
PCR原理:实质就是体外基因复制技术
靶序列
Mg2+
dCTP dGTP dUTP dATP
Primer
Taq DNA聚合酶 加热变性95 °C
1 唾液在生理理盐水中常加0.5%明胶或BSA，以保护不稳定病毒。 2 鼻、咽及肛门拭子 3 粪便标本 4 脑脊髓液、心包液、尿液等 5 尸体材料
死后应尽早获取，无菌采取，不使用防腐剂。
不同病毒所取材料不同，如NDV，取脑、气管，FMV取肺、PRRS取肺、 SFV取淋巴结等。
;
4
二 标本的保存和运送
尽量活体送检，大部分病毒不稳定，必须尽快送实验室；如有延误， 则标本必须冷藏，到实验室立即处理和接种，延误时间短的，可置4℃； 时间延误较长，置-70℃。 如邮寄标本则需放置有干冰的保温箱内。
三 标本处理
1 体液 可以直接接种、检测 2血标本 凝固血离心后的血清即可用于检测 3各种拭子 4粪便标本 5 组织材料
般
程
序
血清学试验
分子生物学技术
;
19
常用检测方法
分离培养 血清学 中和试验 补体结合试验 血凝及血凝抑制试验 免疫扩散试验 免疫学诊断技术 ELISA IFA 免疫组化 分子生物学检测 PCR 分子杂交技术
;
20
病毒分离
标本采集
杀灭杂菌 （青链霉素）
接种
三大方法
易感动物
出现病状
鸡胚 病变或死亡
;
13
HE（苏木素伊红)琼脂平板
不发酵乳糖的某种肠
发酵乳糖的某种肠杆菌。 道菌，而且产生硫化 氢，可能是沙门氏菌
不发酵乳糖的肠道菌， 可能就是志贺氏菌。
本培养基倾注平皿待冷却后呈草绿色，质控菌株接种后。36±1℃培养 18—24h，观察结果 。大肠杆菌部分被抑制，橙黄色-橙红色。葡萄球 菌生长被抑制。
AmpErase
靶序列引物退火55 °C 引物延伸72 °C
;
33
原理图示
一
二
三 完成一个循环
;
34
30次循环后靶序列扩增的数量
1 cycle = 2 2 cycleAm= p4liAcomnplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon
;
7
细菌的形态观察
光学显微镜下细菌的形态
;
8
光镜和电镜的比较
大 肠 杆 菌
葡 萄 球 菌
光学显微镜镜检 ;
电镜镜检 9
培养结果
初次分离
纯培养
鉴别培养
;
10
麦康凯平板
不乳糖
发酵乳糖
;
11
EMB平板
不发酵乳糖的细菌
大肠杆菌，呈现黑色金属光泽
;
12
SS平板
大肠杆菌或者别的发酵 乳糖的肠杆菌
有黑色中心的是沙门氏菌。如果 没有黑色中心，就很可能是志贺 氏菌了。
;
37
举例：基于结核分枝杆菌插入序列IS1081，建立SYBR Green荧光定 量PCR方法。实验结果：
细胞培养
细胞病变
鉴定病毒种型
;
21
病毒的分离与鉴定
1．动物接种
2．鸡胚培养
3．组织培养
;
22
病毒中和试验 本实验极为特异和敏感，是病毒学中重要的血清学实验。主要用于病毒
感染的血清学诊断、病毒分离株的鉴定、不同病毒株的抗原关系研究、疫苗 免疫原性的评价、免疫血清质量的评价以及实验动物中是否存在相应的抗体 等。
1. 剖检（采集病料） 2. 纤维素渗出物的涂片染色 3. 分离培养（普通营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板或伊红美兰琼脂平板） 4. 培养物涂片G染色 5. 生化试验 6. 动物试验 7. 血清学实验 玻板凝集鉴定血清型
;
18
三、病料中病毒的检测
Baidu Nhomakorabea
病
毒
标本采集与送检
分
离 和
病毒的分离鉴定
鉴
定
的
电镜技术
一