家蚕谷胱甘肽转移酶基因的克隆、序列分析及其表达模式研究
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酸序列与其它物种的 GSTs 进行相似性比较和系统发育分析，发现此基因为 delta 家族的成员，并命名为
。 RTPCR
结果表明，
基因在家蚕 5 龄第 3 天的 8 个组织中都有表达，中肠和表皮的表达丰度较高。在辛硫磷处理家蚕后的 72
h 内，
基因的转录水平与对照组相比没有显著的变化。对
基因的 5' 侧翼区的调控序列进行了预测，共发现
(xenobiotic response element，5'GCGTG3') (Reyes
, 1992)、激活蛋白 1(activator protein1，AP1)结合
位 点 也 叫 佛 波 酯 反 应 元 件 TRE (TPA response
element，5' TGASTMA3') (Rauscher , 1988)、抗
12 个可能与内源和外源物代谢以及抗氧化相关的转录调控元件。
关键词: 家蚕；谷胱甘肽 S 转移酶；序列分析；表达模式
中图分类号：S188 文献标识码：A 文章编号:10061304(2007)04059507
Cloning, Sequcene Analysis and Expression Pattern of Glutathione Stransferase Gene in
有关(Tang and Tu, 1994)，按蚊中也发现与有机磷和
DDT 抗性有关的基因，过量表达的重组按蚊 GSTs
基因产物 在体外 能催化 DDT 脱氯 化氢降 解生成
DDE(Hemingway , 1991; Ranson , 2001)。大
规模 EST 和全基因组测序的完成使得果蝇和按蚊
GSTs 的研究迅速发展。但是目前家蚕的 GSTs 研究
较少，Yamamoto .(2005) 对家蚕的 1 个 GST 基
因进行了克隆和外源表达，初步鉴定了其生化性质。
有机磷在防治鳞翅目害虫中发挥了重要作用，
但随着有机磷的大量施用，昆虫抗性也日益加剧。家
蚕作为鳞翅目昆虫的模式生物，研究家蚕 GST 表达
模式和调控机制，为阐明 GSTs 与杀虫剂抗性的关
氧化 反应元件 ARE (antioxidant response element，
5'TGACNNNGC3') (Rushmore , 1991)、亲电试
剂反应元件 EpRE (electrophile responsive element，
5'TGACA(A/T)(A/T)GC3') (Friling , 1992)以及
55℃ 30 s，72℃ 1 min, 共 35 个循环，最后 72℃ 10
农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2007,15 (4): 595~601
研究论文·
家蚕谷胱甘肽转移酶基因的克隆、序列分析及其表达模式 *
左伟东, 余泉友, 李 斌, 刘 志, 代方银, 鲁 成 **
(西南大学农业部蚕桑学重点实验室，重庆 400715)
积 ）：2.5 滋L 10 伊PCR 缓 冲 液 ，2 滋L 25 mmol/L
MgCl2,2 滋L 2.5 mmol/L dNTP，各 1 滋L 10 滋mol/L 上 下游引物，2 滋L cDNA, 1 U DNA 聚合酶，用超
纯水补足 25 滋L。PCR 在 BioRAD 热循环仪上进
行 ，扩 增 条 件 为 ：94℃ 预 变 性 3 min，94℃ 1 min，
did not
change significantly. In addition, 5'flanking region of
was used to predict the transcription regulatory elements and 12 ele
ments in total were found,which are related to detoxification of endogenous exogenous compounds ,and antioxidant role .
sect. The amino acid sequences of insect GSTs were downloaded from GenBank, and used to search the silkworm (
)
genome sequences by TBLASTN program. Many putative GST genes were found in silkworm genome. One new GST gene was cho
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农业生物技术学报
2007 年
酶 和 异 构 酶 的 活 性 (Bartling
, 3；
FernandezCa觡on and Pe觡alva, 1998)。此外，GSTs 的
多态性还与疾病的易感性有关(Hayes ., 2000)。
目前，昆虫 GSTs 的研究热点主要集中于杀虫
剂抗性。果蝇和家蝇中证实 GSTs 基因与 DDT 抗性
* 基金项目：国家重点基础研究发展规划（973）项目（No. 2005CB121004）、科技部国家攻关项目（No. 2005BA711A07）和国家自然科学基金 （No. 30300262）资助。
** 通讯作者。Author for correspondence. 教授，博导，主要从事家蚕遗传育种学及分子生物学研究。Email: <lucheng@>. 收稿日期：20061122 接收日期：20070130
系，防治农林害虫有着重要的理论和实践意义。为了
解谷胱甘肽 S 转移酶在家蚕中的表达情况和作
用，更好地阐明昆虫抗药性产生的机理，本实验克隆
并测序验证了 1 个新的家蚕 GST 基因，并研究了家
蚕在辛硫磷处理后，所克隆的 GST 基因的表达模
式。另外，还对这一 GST 基因的 5' 端侧翼区调控序
列进行了预测。
家蚕 GST 基因的核心启动子区域通过神经网 络 启 动 子 预 测 的 方 法 (http://www.fruitfly. org/seq_tools/promoter.html)进行预测，并在转 录起 始位点 (TSS，+1) 上游的 2 500 bp 区域中搜寻与 GST 异生物代谢和抗氧化活性相关的转录调控元 件 ， 搜 索 的 元 件 包 括 ： 异 生 物 响 应 元 件 XRE
分别取脂肪体，并立即置于液氮中保存备用。
1.3 总 RNA 的提取与 cDNA 第 1 链的合成
用 RNA 试剂盒 TRIzo（l Invitrogen）试剂提取各
组织的总 RNA。cDNA 第 1 链采用 Oligo (dT)18 和
AMV 反转录酶（Promega）按操作说明合成。
1.4 家蚕 GST 基因克隆及序列测定
1 材料和方法
1.1 家蚕 GST 基因的预测及分析 从 GenBank 数据库中下载昆虫 GST 氨基酸序
列，与家蚕的基因组数据库进行 TBLASTN 比对，获 得家蚕的 GST 同源序列。以候选家蚕 GST 的编码 区 (conding sequence, CDS) 与 NCBI (http://www. /)的家蚕 EST 数据库 BLASTN 比对 ( value ≤ e20)。获 得的 ESTs 用 DNASTAR 中的 Seqman 进行拼接，将拼接的 contig 作为种子序列再 次在 NCBI 的家蚕 EST 数据库重复检索、延伸，直 到 不 能 延 伸 为 止 。 用 sim4 (http://pbil.univlyon1. fr/sim4.php) 分析外显子和内含子边界。在 expasy ()上在线预测氨基酸序列的分 子量、等电点等。
as
. RTPCR results showed that the
expressed in eight tissues of the 3rd day of 5th instar silkworm, but its ex
pression was higher in midgut and epidermis. After the silkworm exposed to phoxim, the transcription level of
用如下引物进行家蚕 GST 基因的克隆：
正向引物：5'CCATGGCAATAGATCTATACTTCAC3'；
反向引物：5'GGATCCTATTTACTCTGGTGAACTC3'。
以大造 5 龄第 3 天脂肪体的第 1 链 cDNA 为
模板，进行 PCR 扩增。PCR 反应体系（25 滋L 的总体
每个单体又含有两个重要的功能结构域，N 末端结 构域结合还原型谷胱甘肽而高度保守，C 末端结构 域结合不同底物而异常多变, 在 GSTs 的催化作用 下，还原型谷胱甘肽的硫醇基团攻击有毒化合物的 亲电中心，产生易溶于水的复合物而利于排出体外 (Enayati , 2005; Vararattanavech ，2006)。除 了消除有毒物质的作用，部分 GSTs 还具有过氧化
ZUO Weidong, YU Quanyou, LI Bin, LIU Zhi, DAI Fangyin, LU Cheng**
(
)
Glutathione Stransferases (GSTs) play a central role in detoxication of xenobiotic and endogenous compounds in in
摘要: 谷胱甘肽 S 转移酶(GSTs)是昆虫体内重要的解毒酶系，在对外源和内源化合物解毒代谢中起着重要的作用。以
