酶活DNS法测定

1果胶酶酶活力测定方法果胶酶降解底物的糖苷键，生成含还原端基产物，故采用常用的还原糖测定法—DNS 法。

1.1 测定原理果胶酶在一定条件下水解底物果胶，生成半乳糖醛酸等醛糖，醛糖与3,5—二硝基水杨酸共热产生棕红色的氨基化合物, 在一定范围内还原糖的量和含有呈色氨基化合物的反应液颜色深浅成正比，在540 nm 下测其吸光度，从而计算出果胶酶酶活。

·酶活性单位定义：在上述测定条件下，以每分钟水解底物生成1 μg 还原糖所需酶量定义为一个酶活性单位，单位为U/mL。

1.2 DNS 试剂用400 mL 蒸馏水溶解6.3 g 3,5-二硝基水杨酸，逐步加入21 g 氢氧化钠，再加入185 g 四水合酒石酸钾钠(C4H4O6KNa-4H2O)、5.0 g 苯酚、5.0 g 无水亚硫酸钠，温水浴(不超过48 ℃)，不断搅拌，直至溶液清澈透明。

用蒸馏水定容至1000 mL，保存在棕色瓶中，与二氧化碳隔绝，静置5~7 d 后使用，贮存期为6 个月。

1.3 pH 7.0 的磷酸—柠檬酸缓冲溶液参见《现代生化技术》，取Na2HPO4·12H2O 71.62g、C6H8O7·H2O 21.01 g，分别定容到1000 mL，按16.47:3.53 的体积比混合，即可。

1.4 底物的配制称取1.00 g 果胶，用pH 7.0 的缓冲溶液溶解，于磁力搅拌器上恒速搅拌0.5 h，用缓冲溶液定容至100 mL。

存放在0~4 ℃冰箱里。

1.5 粗酶液的制备取发酵液，于10000 r/min，4 ℃离心5 min 后，取上清液即为酶液。

2酶学性质分析2.1 酶的最适温度在45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃，pH 7.0的条件下，反应30 min，测定果胶酶酶活。

以最大的酶活的活力为100%，其他的以它的百分比计。

2.2 酶的最适pH在pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0（pH≤8.0的用磷酸氢二钠- 柠檬酸缓冲液，pH>8.0 的用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液），最适温度的条件下，反应30 min，测定果胶酶酶活。

检测纤维素‎酶酶活力—滤纸酶活力‎(F PA)滤纸酶活力‎代表了纤维‎素酶的三种‎酶组分协同‎作用后的总‎酶活。

采用3，5一二硝基‎水杨酸法测‎定酶活：(简称DNS‎法)1、原理：纤维素经纤‎维素酶水解‎后生成还原‎糖，还原糖能将‎3，5一二硝基‎水杨酸中硝‎基还原成氨‎基，溶液变为橙‎色的氨基化‎合物，即：3一氨基一‎5二硝基水‎杨酸，在一定的还‎原糖浓度范‎围内，橙色的深度‎与还原糖的‎浓度成正比‎，据此可以推‎算出纤维素‎酶的活力。

2、采用的滤纸‎酶活单位定‎义：滤纸酶活反‎映了纤维素‎酶的3种水‎解酶，即内切型葡‎聚糖酶、外切型葡聚‎糖酶和β葡‎聚糖苷酶组‎成的诱导复‎合酶系的协‎同水解纤维‎素能力。

是该菌株整‎个纤维素酶‎系的酶活力‎水平的综合‎体现。

代表了纤维‎素酶的三种‎酶组分协同‎作用后的总‎酶活。

在此滤纸酶‎活单位定义‎为：以滤纸为底‎物，在一定反应‎条件(pH4.8，50℃，恒温lh)下，以水解反应‎中，1ml纤维‎素酶液1m‎i n催化纤‎维素生成l‎u g葡萄糖‎为1个滤纸‎酶活单位，以U表示。

3、滤纸酶活力‎(F PA)的测定：①取0．5ml适当‎稀释的酶液‎，加入PH值‎为4.8，0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲‎液l ml或‎柠檬酸-柠檬酸钠缓‎冲液lml‎；②再加入50‎±0.5mg滤纸‎(1cmx6‎c m)一条，于50℃保温酶解反‎应1小时，(先预热5分‎钟)；③加入DNS‎显色液3m‎l(标准曲线用‎量是1.5ml)，放入已沸腾‎的水中沸水‎浴l Omi‎n，流水冷却后‎在540n‎m下测吸光‎度；④同时用10‎0℃煮沸lOm‎i n后失活‎的酶液做对‎照，扣除本底；⑤根据吸光度‎从葡萄糖标‎准曲线中查‎出相应的葡‎萄糖含量，根据生成的‎葡萄糖克数‎计算出酶活‎值。

滤纸酶活按‎下面公式计‎算：X=（WxNxl‎O OO）／（TxM）X:为滤纸酶酶‎活力，单位U／mL。

DNS法对食用菌发酵液淀粉酶活力的测定1. 研究背景食用菌是一种常见的菌类食品，具有丰富的营养价值和药用价值。

而淀粉酶作为重要的酶类成分，在食用菌的发酵过程中起着重要作用。

对食用菌发酵液中淀粉酶活力的测定具有重要意义。

2. DNS法的原理DNS法是测定还原糖的方法之一，也是目前测定淀粉酶活力的常用方法之一。

该方法利用二糖苷键，能使α-醛基于2-氮杂己糖缺氧基和1-喹啉酮缓和形成稳定的红色络合物。

3. 实验方法（1）试剂准备：取得极少数数DNS试剂，製备酸水（2）样品处理：取得一定量食用菌发酵液样品（3）测定操作：操作过程如下...（4）结果处理：计算淀粉酶活力，公式如下...4. 实验结果和分析（1）样品A淀粉酶活力为X，样品B淀粉酶活力为Y（2）通过对比实验结果分析，得出...5. 结论本实验通过DNS法对食用菌发酵液中淀粉酶活力进行了测定，得出了样品A和样品B的淀粉酶活力结果。

实验结果表明...6. 意义和展望该实验结果对于食用菌产业和相关研究领域具有一定的意义，同时也为淀粉酶活性的测定方法提供了一种有效的方案。

未来有望进一步探索...7. 参考文献（1）XXX，XX.（2018）。

（2） XXX，XX.（2019）...8. 附录实验原始数据表格...总结：本实验使用DNS法对食用菌发酵液中淀粉酶活力进行了测定，并得出了实验结果。

该方法具有操作简便、结果准确等优点，对于相关研究和生产实践具有一定的借鉴意义。

食用菌发酵液淀粉酶活力的测定，是一项具有重要意义的研究。

食用菌作为一种常见的菌类食品，不仅具有丰富的营养价值，还具有一定的药用价值。

而淀粉酶作为食用菌发酵过程中的重要酶类成分，对于提高食用菌发酵液的产率和质量起着关键作用。

准确测定食用菌发酵液中淀粉酶活力，对于食用菌产业和相关研究领域具有重要意义。

在实验中，DNS法是常用于测定淀粉酶活力的方法之一，其原理是利用二糖苷键，形成红色络合物来测定还原糖的含量。

DNS法测定酶活实验方法总结及优化方案
目前纤维素酶没有统一的测定方法，诸多因素影响纤维素酶酶活测定大小的比较。

选择适宜的酶活测定条件，提高测定结果的准确性，可根据有关资料中采用的测定条件，以及通过控制变量法对酶活力测定中的主要影响因素进行研究。

目前实验室采用测酶活方法：
1、葡萄糖标准曲线制作：
530nm比色。

2、酶活测定方法：
考虑到酶液中培养基成分会对吸光值造成一定的影响，所以空白管0还是采用先将酶高温灭活的方法，后面保持实验条件一致，显色时间与标准曲线的显色时间保持一致。

单位酶活的计算：T n k OD ml U 1000
1
)/(⨯⨯⨯=酶活力 n ：稀释倍数；
K：曲线斜率；
T：反应时间，min；
1000：mg换算成ug.
以下是近期所做的实验结果：
葡萄糖标准曲线
两种产纤维素酶细菌不同测试结果
测定结果
实验结论：从以上几种对酶液的处理方法来看，183的酶活要比R2高，两种菌都是以胞外酶为主。

目前尚没找到有关于加缓冲溶液并且超声破碎的文献，所得测量结果与前面三种方法均不符，这一步需另外探索。

根据《纤维素酶活力测定条件研究》（夏服宝等，《饲料工业》2005年第26卷第16期）和《影响纤维素酶活力测定的几个因素》（刘妙莲等，中国食品发酵工业研究所）这两篇文献，实验室可先从底物浓度、温度、DNS用量、显色时间以及对菌体的超声破碎时间这几方面进行探索，进而优化实验方法。

检测纤维素酶酶活力—滤纸酶活力(FPA)滤纸酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。

采用3，5一二硝基水杨酸法测定酶活：(简称DNS法)1、原理：纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖，还原糖能将3，5一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基，溶液变为橙色的氨基化合物，即：3一氨基一5二硝基水杨酸，在一定的还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比，据此可以推算出纤维素酶的活力。

2、采用的滤纸酶活单位定义：滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶，即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素能力。

是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。

代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。

在此滤纸酶活单位定义为：以滤纸为底物，在一定反应条件(pH4.8，50℃，恒温lh)下，以水解反应中，1ml纤维素酶液1min催化纤维素生成lug葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示。

3、滤纸酶活力(FPA)的测定：①取0．5ml适当稀释的酶液，加入PH值为4.8，0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液lml或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液lml；②再加入50±0.5mg滤纸(1cmx6cm)一条，于50℃保温酶解反应1小时，(先预热5分钟)；③加入DNS显色液3ml(标准曲线用量是1.5ml)，放入已沸腾的水中沸水浴lOmin，流水冷却后在540nm下测吸光度；④同时用100℃煮沸lOmin后失活的酶液做对照，扣除本底；⑤根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。

滤纸酶活按下面公式计算：X=（WxNxlOOO）／（TxM）X:为滤纸酶酶活力，单位U／mL。

W：为从葡萄糖标准曲线中查得的葡萄糖的浓度。

N：为酶液稀释总倍数。

T：为反应时间。

M：为样品的体积。

4、葡萄糖标准曲线绘制方法标准曲线绘制：取25ml具塞刻度试管6支，加入1.0 mg /ml的葡萄糖标准溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml,加蒸馏水2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0ml,加DNS试剂1.5 ml，混匀后在沸水浴中加热5分钟，取出立即用冷水冷却，用水定容至25 ml，摇匀，测吸光度A，以吸光度为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线。

dns法测定纤维素酶活力原理纤维素酶，这个名字听起来就像高大上的科学词汇，其实它在咱们的日常生活中可是大有来头。

想想看，咱们的衣服、纸张，甚至一些食品里，都和它有着千丝万缕的联系。

说白了，纤维素酶就是一种能把纤维素这个“大块头”分解成小分子的“超级英雄”。

要不然，这些纤维素可真是“难啃的骨头”，光靠我们自己的牙口可没法啃下去。

所以，这种酶的活力就显得尤为重要了。

现在，咱们来聊聊用DNS法测定纤维素酶活力的原理，听起来有点复杂，其实也并不难，咱们慢慢道来。

DNS法其实就是一种颜色变化法。

嘿，你没听错，颜色变化！你想啊，咱们日常生活中，很多东西都是通过颜色来判断的，比如熟不熟、甜不甜，甚至是“这件衣服合不合适”。

所以，这个方法就是借助颜色变化，来观察纤维素酶的活力到底有多强。

这里的“DNS”指的是一种化学试剂，名字比较长，不想说了，简单点，叫它“变色剂”就行。

这个“变色剂”能跟分解后的纤维素反应，形成一种深红色的物质。

就像调色板上的颜色，越深的颜色，说明分解得越彻底，酶的活力就越强。

这个过程是怎么发生的呢？想象一下，纤维素在水中，纤维素酶像一个勤劳的小工人，正在不停地工作。

它一边“啃”着那些纤维素，一边把分解出来的小分子释放到水里。

好比咱们吃饭，吃了一口又一口，最后把盘子清理得干干净净。

然后，DNS法就是通过测量水里的颜色来评估纤维素酶的工作效率。

颜色越深，酶的活力越高，反之，颜色浅，就说明这位小工人可能今天状态不佳，干得不够。

可能有人会问，咱们为什么要关心纤维素酶的活力呢？这可是个好问题。

因为纤维素酶在许多行业里都有广泛的应用，比如说造纸、酿酒，甚至在生物燃料的生产中，都是不可或缺的“好帮手”。

如果咱们知道它的活力，就能调整工艺，优化生产，省时又省力，简直就是为生产效率加了一把火。

说说这个DNS法的操作步骤。

咱们得准备好一堆材料，包括纤维素、酶、还有那个神秘的“变色剂”。

然后，把纤维素和酶混合，放到特定的温度下，让它们好好亲密接触。

dns法测定酶活力原理以DNS法测定酶活力原理为标题的文章一、引言在生物学和生化实验中，测定酶活力是非常重要的。

酶是一种催化剂，在生物体内起到促进化学反应的作用。

因此，测定酶活力可以帮助我们了解生物体内各种生化反应的速率。

本文将介绍一种常用的测定酶活力的方法——DNS法。

二、DNS法的原理DNS法是一种测定还原糖酶活力的常用方法。

该方法基于还原糖酶催化还原糖的过程，通过测定还原糖产生的产物浓度的变化来间接反映酶活力。

具体来说，DNS法是通过测定还原糖产生的醛基与二硫代巴比妥酸（DNS）发生反应生成的有色产物的吸光度变化来测定酶的活力。

醛基与DNS反应生成的有色产物的吸光度与还原糖的浓度成正比，因此可以通过测定吸光度的变化来间接测定还原糖的浓度，从而推测出酶的活力。

三、实验步骤1. 准备工作：首先，准备好所需的试剂和设备，包括还原糖溶液、酶液、DNS试剂、比色皿、吸光度计等。

2. 制备标准曲线：将一系列不同浓度的还原糖溶液分别加入比色皿中，然后加入适量的DNS试剂，混匀后放置一段时间使反应进行，最后测定吸光度。

根据吸光度与还原糖浓度的对应关系可以得到标准曲线。

3. 测定样品：将待测样品中的酶液加入比色皿中，然后加入适量的还原糖溶液，混匀后放置一段时间使反应进行，最后加入DNS试剂，混匀后立即测定吸光度。

4. 计算结果：根据标准曲线，可以将吸光度值转化为还原糖的浓度。

通过比较不同样品的还原糖浓度，可以推测出酶的活力。

四、注意事项1. 实验过程中要注意操作的严密性，避免试剂污染和外界干扰。

2. 实验过程中要注意控制温度，因为温度对酶的活性有很大影响。

3. 实验中还需要注意样品的处理和测定的准确性，避免误差的产生。

五、优点和应用DNS法测定酶活力具有以下优点：1. 方法简单易行，操作方便。

2. 结果可靠，测定结果与酶活力呈正相关。

3. 适用范围广，可以测定多种不同酶的活力。

由于DNS法测定酶活力的优点，它在生物科学研究中得到了广泛应用。

DNS法测定酶活实验方法总结及优化方案
目前纤维素酶没有统一的测定方法，诸多因素影响纤维素酶酶活测定大小的比较。

选择适宜的酶活测定条件，提高测定结果的准确性，可根据有关资料中采用的测定条件，以及通过控制变量法对酶活力测定中的主要影响因素进行研究。

目前实验室采用测酶活方法：
1、葡萄糖标准曲线制作：
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530nm比色。

2、酶活测定方法：
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考虑到酶液中培养基成分会对吸光值造成一定的影响，所以空白管0还是采用先将酶高温灭活的方法，后面保持实验条件一致，显色时间与标准曲线的显色时间保持一致。

单位酶活的计算：T n k OD ml U 1000
1
)/(⨯⨯⨯=酶活力 n ：稀释倍数； K ：曲线斜率； T ：反应时间，min ； 1000：mg 换算成ug.
以下是近期所做的实验结果：
葡萄糖标准曲线
两种产纤维素酶细菌不同测试结果
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测定结果
实验结论：从以上几种对酶液的处理方法来看，183的酶活要比R2高，两种菌都是以胞外酶为主。

目前尚没找到有关于加缓冲溶液并且超声破碎的文献，所得测量结果与前面三种方法均不符，这一步需另外探索。

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根据《纤维素酶活力测定条件研究》（夏服宝等，《饲料工业》2005年第26卷第16期）和《影响纤维素酶活力测定的几个因素》（刘妙莲等，中国食品发酵工业研究所）这两篇文献，实验室可先从底物浓度、温度、DNS用量、显色时间以及对菌体的超声破碎时间这几方面进行探索，进而优化实验方法。

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一、实验目的1. 了解淀粉酶的生物学特性及其在生物体内的作用。

2. 掌握淀粉酶活性的测定方法。

3. 分析淀粉酶活性受温度、pH值等因素的影响。

二、实验原理淀粉酶是一种水解淀粉的酶，可以将淀粉分解为麦芽糖和葡萄糖。

淀粉酶活性是指单位时间内淀粉酶催化淀粉分解的速率。

本实验采用DNS法测定淀粉酶活性，DNS 法是一种灵敏、准确、精确度高的测定方法，适用于测定小样品淀粉酶活性。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：淀粉酶、淀粉、DNS试剂、标准葡萄糖溶液、pH缓冲液、蒸馏水、试管、恒温水浴锅、移液器、量筒、滴定管等。

2. 实验仪器：pH计、电子天平、电子显微镜、分光光度计等。

四、实验步骤1. 配制淀粉酶溶液：称取适量淀粉酶，用蒸馏水溶解，配制成一定浓度的淀粉酶溶液。

2. 配制淀粉溶液：称取适量淀粉，用蒸馏水溶解，配制成一定浓度的淀粉溶液。

3. 测定淀粉酶活性：取一定量的淀粉溶液于试管中，加入适量淀粉酶溶液，置于恒温水浴锅中，在一定温度下反应一定时间。

4. 测定DNS反应液：取一定量的反应液，加入DNS试剂，置于沸水浴中反应一定时间。

5. 比色：用分光光度计在特定波长下测定DNS反应液的吸光度。

6. 计算淀粉酶活性：根据标准葡萄糖溶液的吸光度值，绘制标准曲线，计算反应液中葡萄糖的浓度，进而计算淀粉酶活性。

五、结果与分析1. 淀粉酶活性随温度升高而增加，在一定温度范围内达到最大值，之后随温度升高而降低。

2. 淀粉酶活性随pH值升高而增加，在一定pH范围内达到最大值，之后随pH值升高而降低。

3. 淀粉酶活性受激活剂和抑制剂的影响，其中激活剂可以增强淀粉酶活性，抑制剂可以抑制淀粉酶活性。

六、实验结论1. 淀粉酶是一种水解淀粉的酶，在生物体内具有重要作用。

2. DNS法是一种灵敏、准确、精确度高的测定淀粉酶活性的方法。

3. 淀粉酶活性受温度、pH值、激活剂和抑制剂等因素的影响。

七、实验讨论1. 实验过程中，淀粉酶溶液和淀粉溶液的浓度对实验结果有较大影响，需要严格控制浓度。

纤维素酶活力的测定实验报告1.实验目的本实验旨在通过测定纤维素酶的活力，了解其在不同条件下的活性及作用效果，为进一步研究纤维素酶的应用提供实验依据。

2.实验原理纤维素酶是一种能够分解纤维素为可溶性糖的酶，其活性高低直接影响着纤维素分解的效果。

本实验采用DNS法测定纤维素酶活力，该方法具有操作简便、准确性高等优点。

具体原理如下：在一定条件下，纤维素酶与底物反应产生可溶性糖，其含量可用DNS试剂进行显色反应，根据吸光度值计算可溶性糖的含量，进而求得纤维素酶活力。

3.实验步骤（1）实验准备：准备5mmol/LCMC-Na溶液、10mg/mLDNS溶液、100mmol/LNaOH溶液、纤维素酶溶液；取2mLDNS溶液、1mLCMC-Na溶液、1mL 酶液、2mLNaOH溶液，混合后摇匀。

（2）设置对照：取2mLDNS溶液、1mLCMC-Na溶液、2mLNaOH溶液混合后摇匀，作为对照溶液。

（3）反应：将酶液和对照液分别加入两支试管中，于50℃水浴中恒温20分钟。

（4）显色：取出试管，分别加入1mLDNS溶液，摇匀后再次置于50℃水浴中恒温20分钟。

（5）比色：取出试管，冷却至室温，分别以空白试剂为参比，于540nm波长处测定各管吸光度值。

4.实验结果根据实验数据可知，纤维素酶活力为20.33U/mL，对照液吸光度值为0.65。

5.实验分析通过实验结果可知，本实验条件下得到的纤维素酶活力为20.33U/mL，与文献报道值相符。

这说明本实验所选条件较为适宜，能够反映纤维素酶的实际活性水平。

同时，实验过程中采用了DNS法测定可溶性糖含量，该方法具有较高的准确性，因此实验结果可靠。

6.实验结论本实验通过DNS法测定纤维素酶活力，得到了较为准确的实验结果。

这说明本实验所选条件和方法均较为适宜，能够反映纤维素酶的实际活性水平。

同时，本实验也为进一步研究纤维素酶的应用提供了实验依据。

在实际应用中，可根据具体需求调整实验条件和方法，以获得更为准确的实验结果。

dns法测定淀粉酶活力原理1. 什么是淀粉酶？淀粉酶，顾名思义，就是一种能把淀粉分解成糖的“高手”。

想想看，咱们吃的米饭、面条，这些淀粉类的食物，都得靠淀粉酶来“打工”。

它们在咱们的口腔、胃肠道里忙得不可开交，帮助消化，让身体能顺利吸收营养。

简单来说，淀粉酶就像是餐桌上的“翻译”，把复杂的淀粉变成了身体能理解的“语言”。

2. DNS法到底是啥？好啦，说到DNS法，那可就有趣了！DNS全名是“3,5二硝基水杨酸”，听起来像个化学实验室里的秘密武器，其实它是用来测量淀粉酶活力的“神器”。

这个方法就像一位魔术师，能在你面前变出色彩缤纷的结果。

说白了，就是利用化学反应来判断淀粉酶工作得怎样。

2.1 原理大揭秘来，咱们把话题稍微深入一点。

DNS法的基本原理是这样的：当淀粉被淀粉酶分解成麦芽糖时，DNS就会参与反应，形成一种颜色鲜艳的化合物。

这种颜色的深浅，直接反映了淀粉酶的活性。

想象一下，就像画画，颜料越多，颜色越深，说明画得越好。

反之，颜色淡了，那就说明活性不够，工作效率下降了。

2.2 测量过程接下来，我们来说说具体的测量过程。

首先，咱们得准备一些样品，像是唾液、食品加工液等，里面可不乏淀粉酶。

然后，将这些样品与淀粉混合，接着再加入DNS试剂。

嘿！这一步可不能马虎，搅拌均匀后，放进水浴锅里加热。

这个加热的过程就像是给淀粉酶加点“热情”，让它们更卖力地工作。

最后，冷却后把溶液放入分光光度计里测量。

只要稍微动动手指，就能看到结果，真是太神奇了！3. DNS法的优势与应用当然，DNS法可不是光在实验室里“打发时间”，它在许多领域都有广泛的应用。

比如，在食品工业中，厂家可以用这个方法来检测淀粉酶的活性，确保产品的质量。

想象一下，消费者吃到的每一口都能放心，这可是一件多么重要的事儿啊！3.1 研究的重要性不仅如此，科学研究也离不开它。

许多研究者通过DNS法，能深入了解淀粉酶的特性、活性变化等。

这就好比侦探破案，层层深入，挖掘真相。

实验七DNS法测定纤维素酶活力
一、试剂耗材
实验共分为6组，在每组的实验台上需要配置以下试剂和耗材：
25mL比色管(容量瓶或离心管也可)10支；试管架1个；50mL容量瓶；移液枪（移液管）1000μL 1把；5000μL1把，对应枪头若干；DNS 溶液100mL；1mg/mL葡萄糖标准溶液100mL；0.5%羧甲基纤维素钠水溶液50mL，滴管数支，烧杯100mL2个。

公用仪器设备：电子天平，分光光度计(2台以上)，恒温水浴锅
二、需要配置的溶液
1.DNS溶液：称取10g 3，5-二硝基水杨酸溶于蒸馏水中，加入20g氢氧化钠，200g酒石酸钾钠和500mL水，加热溶解后再加入重蒸酚2g、无水亚硫酸钠0.5g，待全部溶解后冷却，定容至1000mL，储存于棕色瓶中，放置一周，用前过滤分装。

2.pH 4.5 0.1mol/L乙酸乙酸钠缓冲液配置：（1000毫升）参考缓冲液配置手册
3.1mg/mL葡萄糖标准溶液:称取1g葡萄糖,用蒸馏水溶解,并定容到1000mL.分装
4.0.5%羧甲基纤维素钠溶液：用00.1mol/LpH 4.5的乙酸乙酸钠缓冲液配置。

1 溶液的配制：轻工业部标准DNS试剂的配制称取3，5-二硝基水杨酸(10土0.1) g，置于约600 mL水中，逐渐加入氢氧化钠10 g，在50 ℃水浴中(磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠200 g、苯酚(重蒸)2 g和无水亚硫酸钠5 g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1000 mL，过滤。

贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7 d后使用。

(1)DNS的配制：DNS（3,5-二硝基水杨酸）：称取10g DNS溶于600mL水中，全部溶解后，逐渐加入20g NaOH，搅拌溶解。

缓慢加入200g 酒石酸钾钠，加热溶解（55℃）后加入2g 苯酚和0.5g 无水亚硫酸钠，加热搅拌至全部溶解，冷却，用水稀释至1000ml，储存于棕色试剂瓶中，一周后使用。

(2)可溶性淀粉底物溶液（1%）：称取1 g可溶性淀粉，溶于80ml煮沸的Tris-HCl(pH6.5)缓冲液中，再煮沸10mins，冷却后定容至100ml。

葡萄糖标准液（1mg/ml）: 取烘箱烘干的葡萄糖0.1g加入到100ml容量瓶中，定容至100ml。

2酶活测定（1）葡萄糖标准曲线的绘制取7支试管编号，分别取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 ml的葡萄糖标准液（1 mg/ml），用ddH20补加至2ml，再加入2ml DNS，将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温，定容至20ml，用第一支试管调零，测定在540 nm处的吸光值。

以葡萄糖含量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

（2）DNS法取2个试管，分别为对照管和样品管。

将两试管中各加入Tris缓冲液800 μl 和底物溶液100 μl，37℃水浴保温5min，然后在对照管中加入灭活的纯化酶液（沸水浴煮沸10min）100 μl，样品管中加入纯化酶液100 μl，立即混匀计时，在37℃水浴中准确反应30min后加入等体积的DNS(1ml)终止反应，沸水浴显色5min，冷却后，定容至10ml，在540nm分光光度计测定吸光值，每个样品重复三次，取平均值。

DNS法测淀粉酶活性DNS溶液配方：酒石酸钾钠：182g溶于500ml蒸馏水中，加热在热溶液中依次加入：3,5-二硝基水杨酸：6.3g氢氧化钠：20.69g苯酚：5ml亚硫酸钠：5g搅拌溶解后，冷却定容1L，贮于棕色瓶中一周后使用。

葡萄糖标准曲线的测定1.称取0.1g葡萄糖（干燥至恒质量），放入5mL的容量瓶中定容，配成浓度为20mg/mL的葡萄糖溶液。

2.再取2个5mL的容量瓶，分别吸取250μL的上述葡萄糖溶液加入到2个容量瓶中，定容，配成1mg/mL的母液。

3.取11个1mL的离心管，标号，分别吸取0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000μL上述母液加入到离心管中，然后补加水到1mL，制成浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mg/mL的葡萄糖标准液。

4.将上述各标准溶液转加到25mL的试管中，各加1mL的DNS溶液，90℃水浴5min，流水迅速冷却，加水定容至25mL。

5.在540nm下测定吸光值，绘制葡萄糖浓度与OD值的标准曲线。

二硝基水杨酸（DNSA）来测量可溶性淀粉中释放的还原糖。

1、反应混合液包括：50ul酶（菌株液体摇瓶，取菌悬液离心，取上清作为酶液）+450ulBuffer B（醋酸钠Buffer 20mM，pH5.5）+500ul 1%（w/v）可溶性淀粉（溶于Buffer B，需要现配现用，提前预热8min），最后加酶，60℃，5min。

2、加入几滴0.5M HCl，中断反应。

3、加入1.0mlDNS试剂，90℃，5min。

4、540nm测吸光值（空白：利用50ul蒸馏水代替50ul酶液，其他步骤相同）。

5、释放的还原糖量用葡萄糖标准曲线定量。

一个酶活单位：60℃每分钟释放1umol葡萄糖所需要的酶量。

醋酸钠Buffer 20mM，pH5.5（1L）：1.6406g NaAC固体，0.2ml冰醋酸，定容到1L。

纤维素酶测定方法
1、纤维素酶活的测定采用DNS法，,即首先以葡萄糖的μmoL数为横坐标,OD值为纵坐标,绘制标准曲线。

2、然后取3支带有25 mL刻度的试管,一支管作空白对照,2支管作平行样品管,每支样品管中加1 mL酶溶液,置于50℃水浴锅中预热2 min;再加入4 mL已预热至50℃底物溶液(0.625 g CMC溶于100mL pH4.6的醋酸缓冲液中加热,溶解,混匀)精确反应5 min;
3、然后在3支试管中立即分别加入1 mL 2 mol/ L氢氧化钠溶液和2 mL DNS显色液,摇匀后将支试管放入沸水浴中5 min后立即取出流水冷却,
4、然后在对照管中再加入1 mL酶液,再用蒸馏水定容至25 mL,于490 nm处测OD值。

5、酶活力计算:从标准曲线中查出葡萄糖μmol数,酶活力(U)=葡萄糖量/(5×EW)
其中:5为保温时间(酶与底物作用时间,min); EW为1 mL酶液中含有的样品量(g); U是指在特定条件下,每分钟每克酶粉催化纤维素水解生成的葡萄糖量。

实验七D N S法测定纤
维素酶活力
Document number【SA80SAB-SAA9SYT-SAATC-SA6UT-SA18】
实验七 DNS法测定纤维素酶活力
一、试剂耗材
实验共分为6组，在每组的实验台上需要配置以下试剂和耗材：
25mL比色管(容量瓶或离心管也可)10支；试管架1个；50mL容量瓶；移液枪（移液管）1000μL 1把；5000μL1把，对应枪头若干；DNS 溶液100mL；
1mg/mL葡萄糖标准溶液100mL；%羧甲基纤维素钠水溶液50 mL，滴管数支，烧杯100 mL 2个。

公用仪器设备：电子天平，分光光度计(2台以上)，恒温水浴锅
二、需要配置的溶液
溶液：称取10g 3，5-二硝基水杨酸溶于蒸馏水中，加入20g氢氧化钠，200g 酒石酸钾钠和500mL 水，加热溶解后再加入重蒸酚2g、无水亚硫酸钠，待全部溶解后冷却，定容至1000mL，储存于棕色瓶中，放置一周，用前过滤分装。

L乙酸乙酸钠缓冲液配置：（1000毫升）参考缓冲液配置手册
3. 1mg/mL葡萄糖标准溶液:称取1g葡萄糖,用蒸馏水溶解,并定容到1000mL.分装
4. %羧甲基纤维素钠溶液：用L pH 的乙酸乙酸钠缓冲液配置。

酶活DNS法测定一、将初筛的菌株接入100mL 种子培养基(250ml 三角瓶) 中, 25 ℃150r ·min - 1 培养24h（此步骤在初筛期省略）,取培养至对数生长期的种子液3mL 接入60mL 发酵培养基(250mL规格三角瓶)中发酵培养。

在30℃,150r ·min - 1 转速下培养144h ,8000r ·min - 14 ℃离心10min ,取上清用DNS 法测酶活。

二、标准曲线的制作精确称取100 ℃干燥至恒重的葡萄糖0. 10g ,加蒸馏水溶解并定容至100mL ,配成1.00mg ·mL - 1浓度的溶液,（按表1）在各比色管中加入溶液,沸水浴反应5min ,冷却加蒸馏水定容至25mL 后,以去离子水作为空白校正,用紫外分光光度计于550nm下测A值。

三、褐藻酸酶活力测定- DNS 法3 ,5-二硝基水杨酸法测定酶活力 ,利用比色法测定酶解后还原产物的生成量 ,以表示酶的活力。

具体为:吸取 1 mL 发酵液 ,2 mL 1 %褐藻酸钠溶液(pH7. 0 的 1/ 15N 的磷酸缓冲液配制) ,于试管中混匀 ,并且以 1 mL 蒸馏水替代发酵液做空白对照实验。

置于40 摄氏度水浴糖化30 min ,取出后立即于沸水中煮沸 15 min 使酶失活。

冷却 ,过滤 ,吸取 1 mL 滤液于比色管中 ,加入 3 ,5-二硝基水杨酸显色剂3 mL,再沸水浴 15 min ,冷却 ,用蒸馏水定容至 25 mL ，混匀 ,在 550 nm 下测光密度(用蒸馏水调零) 。

酶活力单位定义为 ,在实验条件下 ,每毫升酶发酵液每分钟催化底物生成 1μg还原糖所需的量。

4、菌株的产酶曲线的测定在复筛培养基中接入2mL 对数生长期的菌株一组,从48小时起，每隔18--24h测量发酵液的酶活力,并且测量发酵液于550nm下的A值,从而做出产酶曲线，得到最大酶活时间并为以后的测定提供参考时间。

1.药剂的配置1.1DNS配置：182g酒石酸钾钠，溶于500ml蒸馏水中，40-50℃水浴加热，依次放入6.3gDNS，21g NaOH，5g重蒸酚，5g亚硫酸钠，搅拌溶解后定容1L，放置7d后使用。

1.2pH4.5 丙二酸钠-丙二酸缓冲液（100mmol/L）1.6604g丙二酸钠，1.0406g丙二酸各放入100ml蒸馏水中，混合比例约等于1：1，酸要少倒一些。

1.3pH3.0酒石酸钠-酒石酸缓冲液（100mmol/L）1.9405g酒石酸钠，1.5009g酒石酸各放入100ml蒸馏水中，混合比例为5：11。

1.4pH4.6 乙酸钠-乙酸缓冲液（100mmol/L）0.6ml冰醋酸，0.82g乙酸钠各放入100ml蒸馏水中，混合比例为4：61.5pH6.5 磷酸缓冲溶液（50mM）1.3609g磷酸二氢钾（酸性），2.2822g磷酸氢二钾（碱性）各放入200ml蒸馏水中，混合比例为1.71：11.6ABTS（20mM）1.09736g于100ml水中1.7MnSO4（10mM）0.169g于100ml水中1.8H2O2（20mM）45.35ul（30%）于20ml水中1.9V A（40mM）0.6725g于100ml水中1.10邻苯二酚（50mM）0.551g于100ml水中1.111%CMC，1%可溶性淀粉均用pH4.6的醋酸钠缓冲溶液稀释2．测定方法2.1漆酶2ml体系pH4.5丙二酸钠缓冲液（100mM）1.7ml，粗酶液200ul，ABTS（20mM）100ul，OD420测定1min内的吸光度变化。

酶活单位：每分钟氧化1μmol底物（ABTS）所需要的酶量为一个酶活单位（U）计算公式：2.2多酚氧化酶pH6.0磷酸缓冲液（50mM）4ml，邻苯二酚（50mM）1ml，粗酶液100ul，30℃，30min，测OD410吸光度值，以灭活菌液为对照。

酶活单位：每分钟使OD410改变0.01为一个酶活单位计算公式：以每克样每分钟内A410增加0.01为1个酶活力单U。