细胞培养必备知识

细胞培养目录1. 实验所需器材 (3)1.1超净工作台 (3)1.2 超净实验室 (3)1.3 细胞培养箱 (3)1.4 冰箱 (3)1.5 细胞储存设备 (3)1.6 液体除菌过滤装置 (3)1.7 高温高压消毒装置 (3)1.8 离心机 (4)1.9 血细胞计数板 (5)2.0其他 (5)2.细胞培养试剂器材处理 (5)2.1 培养液 (5)2.2 血清 (5)2.3 培养用品清洗 (5)2.3.1 玻璃器皿的清洗 (5)2.3.2 橡胶制品清洗 (6)2.3.3 塑料制品的清洗 (6)2.4包装 (6)2.5灭菌 (6)2.6细胞房的日常维护 (6)3. 细胞培养所需液体的配制 (7)3.1培养液 (7)3.2胰蛋白酶溶液 (7)3.3 血清 (7)3.4 PBS与MTT (7)3.5 冻存液 (7)3.6 洗液 (7)3.7新洁尔灭配制 (8)3.8 消毒液配制 (8)4. 细胞培养基本操作 (8)4.1 无菌操作 (8)4.2 原代培养 (8)4.3 传代培养 (8)4.3.1传代前准备 (8)4.3.2 胰蛋白酶消化 (9)4.3.3吹打分散细胞 (9)4.3.4 分装稀释细胞 (9)4.3.5 继续培养 (9)4.4 MTT法筛选药物活性 (9)4.4.1种板 (9)4.4.2 细胞计数方法 (9)4.4.3 初始浓度化合物的配制 (10)4.4.4 加药 (10)4.4.5 加MTT (10)4.4.6加DMSO (10)4.5 细胞冻存 (10)4.6 细胞复苏 (11)1.实验所需器材1.1超净工作台这是一般实验室可采用的普及型无菌操作装置，其工作原理是利用鼓风机驱动空气经过高效过滤装置净化后在通过工作台面，在工作台面构成无菌环境，超净工作台应放在清洁无尘的房间，普通超净台可作生物安全I一级安全柜使用。

1.2 超净实验室空气洁净度应达到104颗粒/m3以下，并且应具有紫外杀菌装置，无菌操作间的房顶、墙壁、地面均应光滑、无死角、并定期进行清洁、消毒、检测。

引言：实验室细胞培养是一种重要的生命科学研究技术，通过体外培养细胞，可以模拟人体内的生理和病理状态，加深对细胞生物学和疾病机制的理解。

本文将介绍实验室细胞培养的基本知识，包括培养基的组成、细胞培养的种类、培养条件的调节等方面。

概述：实验室细胞培养是指在人工设备中，提供合适的环境条件，以维持细胞的生长和增殖。

细胞在培养基中不仅可以扩增，还可以进行各种实验室研究，如细胞凋亡、基因表达、药物筛选等。

下面将分五个大点详细介绍实验室细胞培养的基本知识。

一、培养基的组成：1.细胞培养基是由培养基基础组分和辅助组分构成的。

基础组分包括无机盐溶液、有机物、能量源、氨基酸等，辅助组分包括生长因子、激素、抗生素等。

2.常用的培养基有DMEM、MEM、RPMI1640等，其组成根据细胞类型和研究目的可有所差异。

3.细胞培养基的pH值、温度和储存条件对细胞生长至关重要，应根据细胞类型调整。

4.无菌技术在培养基制备过程中非常重要，避免细菌和真菌污染对细胞的影响。

二、细胞培养的种类：1.原代细胞培养是从组织中分离得到的初代细胞，细胞数和传代次数有限。

2.细胞株是从原代细胞培养中筛选得到的具有增殖潜能的细胞系列。

3.基于细胞的特定表型、遗传改造或药物处理的细胞系，可用于特定研究领域，如癌症研究、药物筛选等。

4.三维细胞培养技术可以模拟人体组织的三维结构和功能，提供更接近体内的环境。

三、培养条件的调节：1.细胞密度是影响细胞生长和增殖的重要因素，应根据细胞类型和实验需求进行优化。

2.培养温度应符合细胞体内温度，通常在37摄氏度下进行。

3.CO2浓度和通气情况对细胞生长至关重要，应根据细胞类型和培养基特性调节。

4.培养时间和细胞传代次数应根据培养基的要求和实验目的进行控制。

四、细胞检测与鉴定：1.细胞的染色方法是常用的细胞检测方法之一，包括细胞核染色、细胞分子染色等。

2.细胞增殖和凋亡的检测方法有CFSE染色、MTT法、流式细胞术等。

常规组织培养法1）初代消化培养法1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。

开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。

3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。

4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。

加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。

5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。

消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。

6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。

低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。

7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。

对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。

8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。

2）初代组织块培养法1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。

2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。

3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。

细胞培养相关知识点
细胞培养是指将细胞从体内或体外来源中采集到培养基中，通过提供合适的营养物质和环境条件使其在体外无限制地生长和繁殖的一种生物学实验技术。

常见的细胞培养技术包括原代细胞培养和细胞系培养。

1. 培养基：细胞培养中使用的培养基是包含多种营养物质的液体或固体培养基。

常见的培养基种类包括DMEM、RPMI-1640、MEM等，并根据细胞的类型和特殊需要进行相应的改制。

2. 细胞分离：通过一系列的操作将组织中的细胞分离出来，常用的方法有机械剪切、酶消化和离心等。

3. 细胞传代：细胞的传代是指将细胞从旧的培养皿中转移到新的培养皿中，以保持细胞的生长状态和增殖能力。

细胞传代的方法有裂解法、胶原酶法和选择性黏附法等。

4. 培养条件：细胞的生长需要适宜的温度、湿度、pH值和气体环境。

常见的培养条件为37℃、5% CO2和95%湿度。

5. 防止细胞污染：细胞培养中常见的污染源有细菌、真菌和支原体等。

常用的防止污染的方法包括消毒培养器具和介质、使用无菌操作等。

6. 细胞检测：常用的检测方法包括细胞形态观察、细胞数量计
数、细胞活力测定、染色体核型分析和细胞分化等。

7. 细胞培养的应用：细胞培养技术在生物医学研究中有广泛的应用，如药物筛选、疾病模型建立、组织工程和基因工程等。

注：以上所列举的知识点为细胞培养的基本内容，具体的细胞培养操作方法和技巧可根据具体实验需求和细胞类型进行进一步学习。

细胞培养实验基础知识和相关无菌操作流程细胞培养实验是指将动植物组织或细胞从体内分离并在无菌条件下培养的一种技术手段。

这种技术可以用于研究细胞的生物学特性、疾病的发生机制以及药物的筛选等方面。

以下是细胞培养实验的基本流程和无菌操作的相关知识。

一、细胞培养的基本知识1.细胞培养的种类：常用的细胞培养种类有原代细胞培养、细胞株的维持和传代培养以及细胞系的培养。

2.细胞培养的培养基：细胞培养的培养基可以分为无血清培养基和含血清培养基。

其中，无血清培养基是通过添加一定的生长因子和营养物质来满足细胞生长的需要，而含血清培养基则是使用含有细胞生长因子和营养物质的胎牛血清来供养细胞。

3.传代培养的液氮保存：为了保持细胞株的可用性，可以将细胞株保存在液氮中，以备将来使用。

4.细胞培养中的无菌操作：细胞培养实验需要在无菌条件下进行操作，以防止细胞污染和外源性菌落的输入。

1.工作台和操作区域的消毒：操作前，需要用75％的酒精或其他合适的消毒剂彻底清洁工作台面、培养箱、玻璃器皿等操作区域。

2.培养器具的消毒：需要对培养器具如离心管、移液枪、显微镜等进行高温高压的无菌处理。

3.培养基的制备和滤过：制备培养基时需要将培养基溶液进行高温高压的杀菌处理，并使用0.22微米的滤膜滤过杂质。

4.无菌技术的掌握：在细胞培养实验中，需要学习和掌握无菌技术，如无菌操作台、细菌灯和无菌手套等的正确使用方法。

5.细胞的分离和悬浮：将组织样本放入消化液中，进行细胞的分离和悬浮，并通过离心和过滤的方式获得单个细胞悬浮液。

6.细胞培养的接种：将细胞悬浮液接种在含有培养基的培养皿或离心管中，放入培养箱中进行培养。

7.细胞传代的操作：当细胞达到一定密度后，需要进行细胞传代操作。

传代操作时，需要将细胞悬浮液转移到新的培养皿中，并加入新的培养基进行细胞的维持和生长。

总之，细胞培养实验是生物学研究中不可或缺的一项实验技术，掌握细胞培养的基本知识和无菌操作流程对实验结果的准确性和可靠性至关重要。

名词解释：细胞组织培养：细胞（组织）培养是指从生物体内取出细胞（组织），模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存、生长并维持其结构和功能的方法。

二倍体细胞株：具有二倍体染色体数的细胞株。

细胞组织培养选材：根据实验目的、观察指标确定所选组织器官。

培养选材一般来自胚胎组织的培养物；比成体组织更易生存和生长。

这主要是因为胚胎组织有更多的胚胎组织干细胞，它们具有更高的自我更新和多能分化能力。

原代培养：一般指从组织中分离在体外生长至传代之前的细胞培养。

这种培养通常是异质性，生长缓慢，但比较能代表原组织的类型并表达原组织特性。

缺点是在培养过程中会失去许多原组织的细胞。

传代细胞：原代细胞生长物或细胞系生长到一定阶段，分散成单个细胞，按一定比例接种于新的培养容器内称之传代。

传代细胞称之细胞系，可分为两类：有限细胞系和连续细胞系。

传代形成的具有各自生物特性或标志的细胞系称之为细胞株。

世代：指细胞经过一次分裂后完成后至下次分裂的过程。

细胞富集：当细胞分离纯化并不完全彻底，培养物中能达到以某种细胞为主（占绝大多数）的程度。

细胞纯化：是指从原代培养前成分混杂的异质性细胞悬液中或者从培养物中获得单一类型细胞的过程。

通过细胞分离和纯化得到细胞株或系。

传代：也称为再培养，把一瓶培养细胞全部或分成几份再培养的过程。

组织工程：组织工程是应用生命科学和工程学的原则及方法，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。

Density inhibition:密度抑制，由于细胞密度过大，培养液营养耗尽、代谢产物过多和生存空间消失所引起细胞增殖的抑制现象。

消化液：在原代细胞培养和细胞传代时，都要用消化液，最常用的是胰蛋白酶和二乙烯四乙酸二钠（EDTA），其次是一些特殊的组织细胞培养用的各型胶原酶。

在原代细胞培养中，使用消化液从组织块中分离（散）出单个的细胞；在进行细胞传代时，消化液使细胞脱离生长表面并离散成单个细胞。

细胞培养实验技术大全第一章细胞培养的基本原理与技术现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。

比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。

基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。

正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。

总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。

第一节体外培养的概念一、基本概念体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。

组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。

细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。

器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。

二、体内、外细胞的差异和分化1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。

因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。

实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。

2、分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。

细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。