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细胞培养必备知识

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细胞培养常识

细胞培养常识

细胞培养目录1. 实验所需器材 (3)1.1超净工作台 (3)1.2 超净实验室 (3)1.3 细胞培养箱 (3)1.4 冰箱 (3)1.5 细胞储存设备 (3)1.6 液体除菌过滤装置 (3)1.7 高温高压消毒装置 (3)1.8 离心机 (4)1.9 血细胞计数板 (5)2.0其他 (5)2.细胞培养试剂器材处理 (5)2.1 培养液 (5)2.2 血清 (5)2.3 培养用品清洗 (5)2.3.1 玻璃器皿的清洗 (5)2.3.2 橡胶制品清洗 (6)2.3.3 塑料制品的清洗 (6)2.4包装 (6)2.5灭菌 (6)2.6细胞房的日常维护 (6)3. 细胞培养所需液体的配制 (7)3.1培养液 (7)3.2胰蛋白酶溶液 (7)3.3 血清 (7)3.4 PBS与MTT (7)3.5 冻存液 (7)3.6 洗液 (7)3.7新洁尔灭配制 (8)3.8 消毒液配制 (8)4. 细胞培养基本操作 (8)4.1 无菌操作 (8)4.2 原代培养 (8)4.3 传代培养 (8)4.3.1传代前准备 (8)4.3.2 胰蛋白酶消化 (9)4.3.3吹打分散细胞 (9)4.3.4 分装稀释细胞 (9)4.3.5 继续培养 (9)4.4 MTT法筛选药物活性 (9)4.4.1种板 (9)4.4.2 细胞计数方法 (9)4.4.3 初始浓度化合物的配制 (10)4.4.4 加药 (10)4.4.5 加MTT (10)4.4.6加DMSO (10)4.5 细胞冻存 (10)4.6 细胞复苏 (11)1.实验所需器材1.1超净工作台这是一般实验室可采用的普及型无菌操作装置，其工作原理是利用鼓风机驱动空气经过高效过滤装置净化后在通过工作台面，在工作台面构成无菌环境，超净工作台应放在清洁无尘的房间，普通超净台可作生物安全I一级安全柜使用。

1.2 超净实验室空气洁净度应达到104颗粒/m3以下，并且应具有紫外杀菌装置，无菌操作间的房顶、墙壁、地面均应光滑、无死角、并定期进行清洁、消毒、检测。

细胞培养基本知识基本技术

细胞培养基本知识基本技术
• 血清中的沉淀物
– 絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成， 这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm, 5 分钟去除，也可不用处理
– 显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成 会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常 误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生 长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批 号的血清
• 原代细胞：从机体取得组织材料，在体外
培养生长，到第一次传代前。
• 传代细胞：当原代细胞持续生长繁殖一段
时间，达到一定的细胞密度后传代的细胞。
培养瓶培养法
方法： 将培养对象直接接种于培养瓶内，再放
入培养箱进行培养。
优点： 1、可以避免培养瓶表面粗糙等原因对培养物 的影响。 2、可以方便地进行显微镜观察、染色等操作， 以及永久保存。 3、增加了培养瓶的培养面积。
• 1943年Earle、Dulbecco等创建单层细胞培 养法，首建长期传代的L-细胞系。
• 1951年Gey首建人肿瘤细胞——Hela细胞系。
• 从50年代末开始，组织培养技术应用进入 了一个繁盛的阶段，广泛应用于生物学和 医学研究各个领域。
无血清培养
无血清培养基:是不需要添加血清就可以维持细胞在
缺点：体外培养的细胞不能完全等同于体 内的细胞。
应用
• 病毒学：病毒鉴定，病毒抗原作用，疫苗生产…… • 免疫学：杂交瘤-单克隆抗体…… • 遗传学：染色体分析…… • 肿瘤学：筛选重要的抗肿瘤药物…… • 分化及发育：刺激使细胞群体发生改变…… • 细胞毒实验：药效测试…… • 临床医学及生物技术：干细胞培养定向诱导分
化后移植；组织工程软骨损伤修复；试管婴儿……

细胞培养基础知识

细胞培养基础知识

计数板上面，使之微微移向一侧，露出计数板台面少许； [2] 用移液枪在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液，加样时不要溢出盖玻片也不能溢
入两侧的玻璃槽内，如果产生上述情况需对计数板冲洗和拭干后重新加样，加样量也 不要过少或带气泡； [3] 在显微镜下，用 10×物镜观察，可见细胞均匀分散计数板各处。计算四角大方格内 的细胞数，压中线者只计算左线和上线者，右线和下线不计算在内(即仅计算压两个 边的细胞)，成团细胞按单个细胞计算。按照下面公式计算细胞密度： (细胞悬液的细胞数)/ml＝(四个大格子细胞数/4) ×稀释倍数×104 【注意事项】 [1] 消化单层细胞时，务求细胞分散良好，制成单细胞悬液。否则会影响细胞计数结果。 [2] 取样计数前，应充分混匀细胞悬液。在连续取样计数时，尤其要注意这一点。否则， 前后计数结果会有很大的误差。 [3] 镜下计数时，遇见 2 个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如细胞团 10%以 上，说明消化不充分；或细胞数少于 2 个/mm2 或多于 50 个/mm2 时，说明稀释不当， 需重新制备细胞悬液、计数。 5 培养细胞的运输 装运细胞的方法有两种，一种为冷冻储存运输，即利用特殊容器内盛液氮或干冰冻存， 保存效果较好，但较麻烦，且不宜长时间运输，多需空运。另一种简单的方法为充液法，步 骤如下： [1] 选择生长状态良好的细胞，可直接根据路程时间来选择接种细胞数量，一般以长满
【概述】
细胞计数法是细胞培养研究中的一项基本技术，它是了解培养细胞生长状态，测定培养 基、血清、药物等物质生物学作用的重要手段。常用的细胞技术有血球计数板计数法和电子 细胞计数仪计数法。 【用品】
血球计数板、吸管、胰酶、培养液、显微镜
【步骤】
[1] 准备计数板：用无水乙醇或 95%乙醇清洁计数板和盖玻片，待干燥后，把盖玻片覆在

实验室细胞培养基本知识

实验室细胞培养基本知识

引言：实验室细胞培养是一种重要的生命科学研究技术，通过体外培养细胞，可以模拟人体内的生理和病理状态，加深对细胞生物学和疾病机制的理解。

本文将介绍实验室细胞培养的基本知识，包括培养基的组成、细胞培养的种类、培养条件的调节等方面。

概述：实验室细胞培养是指在人工设备中，提供合适的环境条件，以维持细胞的生长和增殖。

细胞在培养基中不仅可以扩增，还可以进行各种实验室研究，如细胞凋亡、基因表达、药物筛选等。

下面将分五个大点详细介绍实验室细胞培养的基本知识。

一、培养基的组成：1.细胞培养基是由培养基基础组分和辅助组分构成的。

基础组分包括无机盐溶液、有机物、能量源、氨基酸等，辅助组分包括生长因子、激素、抗生素等。

2.常用的培养基有DMEM、MEM、RPMI1640等，其组成根据细胞类型和研究目的可有所差异。

3.细胞培养基的pH值、温度和储存条件对细胞生长至关重要，应根据细胞类型调整。

4.无菌技术在培养基制备过程中非常重要，避免细菌和真菌污染对细胞的影响。

二、细胞培养的种类：1.原代细胞培养是从组织中分离得到的初代细胞，细胞数和传代次数有限。

2.细胞株是从原代细胞培养中筛选得到的具有增殖潜能的细胞系列。

3.基于细胞的特定表型、遗传改造或药物处理的细胞系，可用于特定研究领域，如癌症研究、药物筛选等。

4.三维细胞培养技术可以模拟人体组织的三维结构和功能，提供更接近体内的环境。

三、培养条件的调节：1.细胞密度是影响细胞生长和增殖的重要因素，应根据细胞类型和实验需求进行优化。

2.培养温度应符合细胞体内温度，通常在37摄氏度下进行。

3.CO2浓度和通气情况对细胞生长至关重要，应根据细胞类型和培养基特性调节。

4.培养时间和细胞传代次数应根据培养基的要求和实验目的进行控制。

四、细胞检测与鉴定：1.细胞的染色方法是常用的细胞检测方法之一，包括细胞核染色、细胞分子染色等。

2.细胞增殖和凋亡的检测方法有CFSE染色、MTT法、流式细胞术等。

细胞培养必备知识

细胞培养必备知识

常规组织培养法1）初代消化培养法1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。

开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。

3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。

4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。

加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。

5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。

消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。

6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。

低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。

7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。

对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。

8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。

2）初代组织块培养法1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。

2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。

3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。

细胞培养相关知识点

细胞培养相关知识点

细胞培养相关知识点
细胞培养是指将细胞从体内或体外来源中采集到培养基中，通过提供合适的营养物质和环境条件使其在体外无限制地生长和繁殖的一种生物学实验技术。

常见的细胞培养技术包括原代细胞培养和细胞系培养。

1. 培养基：细胞培养中使用的培养基是包含多种营养物质的液体或固体培养基。

常见的培养基种类包括DMEM、RPMI-1640、MEM等，并根据细胞的类型和特殊需要进行相应的改制。

2. 细胞分离：通过一系列的操作将组织中的细胞分离出来，常用的方法有机械剪切、酶消化和离心等。

3. 细胞传代：细胞的传代是指将细胞从旧的培养皿中转移到新的培养皿中，以保持细胞的生长状态和增殖能力。

细胞传代的方法有裂解法、胶原酶法和选择性黏附法等。

4. 培养条件：细胞的生长需要适宜的温度、湿度、pH值和气体环境。

常见的培养条件为37℃、5% CO2和95%湿度。

5. 防止细胞污染：细胞培养中常见的污染源有细菌、真菌和支原体等。

常用的防止污染的方法包括消毒培养器具和介质、使用无菌操作等。

6. 细胞检测：常用的检测方法包括细胞形态观察、细胞数量计
数、细胞活力测定、染色体核型分析和细胞分化等。

7. 细胞培养的应用：细胞培养技术在生物医学研究中有广泛的应用，如药物筛选、疾病模型建立、组织工程和基因工程等。

注：以上所列举的知识点为细胞培养的基本内容，具体的细胞培养操作方法和技巧可根据具体实验需求和细胞类型进行进一步学习。

细胞培养技术


二、培养细胞的特性
培养细胞的生长特点
贴附
贴附

贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一 以成纤维细胞为例，一般在细胞接种后，很快
（5-10min）便可见细胞以伪足初期附着，与底物
形成一些接触点；接着细胞逐渐呈放射状地伸展
开，细胞体的中心部分亦随之扁平；最后细胞成
为成纤维细胞的形态。
1. 培养细胞的生长方式及类型
五 细胞冷冻保存
1. 冷冻保护剂浓度为5 或10 ％ DMSO，
冷冻方法： 传统方法8小 时(或隔夜)--> 液氮槽蒸汽相中长期储存。
2. 材料用品
1） 2） 3） 4） 生长良好的培养细胞 新鲜培养基 DMSO (Sigma D-2650) 无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)
四、细胞传代培养
1. 细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一 般稀释比例为1:3 至1:6，依细胞种类而异。 2. 材料用品： PBS,0.25%胰酶, 新鲜培养基
3. 步骤：
3.1. 贴壁型细胞 1） 吸掉旧培养液。
2） 用PBS 洗涤细胞一至二次。
3） 0.25%胰酶37℃ 作用数分钟，于倒置显微镜下观察，当细 胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉胰酶溶液。
1. 细胞培养(cell culture)概念

从生物体内取出细胞或组织，在体外模拟体内生理环境，在 无菌、适当温度和一定营养条件下进行孵育培养，使之生存
和生长并维持其结构和功能的技术。
体内、外细胞的差异

体内细胞：
机体神经体液调节 和其他类型细胞影响 基因表达受到外来信号调节 增殖过程中不断发生着分化 （由一般到特殊） 高度特化的结构和功能
3. 操作步骤：

细胞培养基本知识 基本知识1培养细胞的生长特点和生长过程

• 失去接触抑制。
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3.每代细胞的生长过程
• 细胞的一代：从接种开始到下一次再传代接种的 时间。
• 每代细胞的生长过程分三个阶段 1)滞留期(latent phase) ：生长缓慢 2)指数生长期(logarithmic growth phase)又称对 数期，试验用 3)平台期又称生长停滞期(stagnate phase)。传代
S :DNA合成期，易受致癌物影响。 G2：DNA合成后期 ，进行RNA和蛋白质合成。
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9（2）Biblioteka 裂期:M期（前，中，后，末）：时 间短，主要是分裂。
细胞周期=间期+M期=G1+S+G2+M
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单个细胞的细胞周期
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– 正常细胞：接触抑制保证培养过程中不重叠。 – 转化和肿瘤细胞：无接触抑制现象，能继续移动
和增殖，细胞发生堆积。
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• 不受正常生长调控系统的控制，能持续的分裂与增殖。 • 许多癌细胞具有变形运动能力，并且能产生酶类，使血管基底 层和结缔组织穿孔，使它向其它组织迁移
培养细胞的生长特点和生长过程
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一、细胞的生长特点
1、贴附并伸展 • 是体外培养细胞的基本生长特点； • 大多数哺乳动物细胞在体内、体外均附着
底物生长。

细胞培养常识

标准及纯度， 一般化学试剂的品级：一级试剂、 二级试剂 、三级试剂、 四级试剂；国内标准名称：优级纯（保证试剂）、分析纯、化学纯、实验试剂 国内简写代号：GR AR CP LR；国内标签颜色：绿色 红色 蓝色 中黄色
五、天然培养基 包括各种动物血清、水解乳蛋白、胶原和组织提取液。
手提式压力蒸汽灭菌器过程：1加水 2放入消毒物品 3加盖4打开排气阀，加热。5关闭排气阀6停止加热。7灭菌完毕。
2 高温干热灭菌:主要使用电热烤箱。不便在压力蒸汽灭菌器中进行灭菌且不补高温损坏的玻璃器皿，金属器械以及不能和蒸汽接触的物品。另外，烧灼也是干热灭菌的方法之一。
3 紫外线消毒:实验室表面消毒最常用的一种方法。H：2.5m；0.06微瓦能量
4.较经济：可提供大量、同阶段、重复性好、生物学性状相似的实验对象。大规模的生物制品的生产，如：酶，单克隆抗体；大规模基因工程产品
（二）细胞培养的缺点：1.与体内主要不同：相对孤立、相对单一 缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响。2.主要表现：失去原有组织结构和细胞形态；分化减弱或不显；细胞趋向单一化 3.提示：要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体。
电热干燥箱：干热消毒（160℃ ，2小时）。主要用于玻璃器皿消毒。
紫外灯：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒。
一、超净工作台
原理：利用鼓风机，驱动空气通过高效空气微粒滤层净化后，慢慢通过工作台面，在操作地形成无菌环境 气流：外流式和侧流式
1血清：组织细胞培养中最常用的天然培养基是血清,因为血清中含有丰富的营养物质,包括大分子的蛋白质和核酸等,对促进细胞生长繁殖、粘附及中和某些毒性物质的毒性起着一定的作用。血清的好坏也常常是实验成败的关键。

细胞培养实验基础知识和相关无菌操作流程

细胞培养实验基础知识和相关无菌操作流程细胞培养实验是指将动植物组织或细胞从体内分离并在无菌条件下培养的一种技术手段。

这种技术可以用于研究细胞的生物学特性、疾病的发生机制以及药物的筛选等方面。

以下是细胞培养实验的基本流程和无菌操作的相关知识。

一、细胞培养的基本知识1.细胞培养的种类：常用的细胞培养种类有原代细胞培养、细胞株的维持和传代培养以及细胞系的培养。

2.细胞培养的培养基：细胞培养的培养基可以分为无血清培养基和含血清培养基。

其中，无血清培养基是通过添加一定的生长因子和营养物质来满足细胞生长的需要，而含血清培养基则是使用含有细胞生长因子和营养物质的胎牛血清来供养细胞。

3.传代培养的液氮保存：为了保持细胞株的可用性，可以将细胞株保存在液氮中，以备将来使用。

4.细胞培养中的无菌操作：细胞培养实验需要在无菌条件下进行操作，以防止细胞污染和外源性菌落的输入。

1.工作台和操作区域的消毒：操作前，需要用75％的酒精或其他合适的消毒剂彻底清洁工作台面、培养箱、玻璃器皿等操作区域。

2.培养器具的消毒：需要对培养器具如离心管、移液枪、显微镜等进行高温高压的无菌处理。

3.培养基的制备和滤过：制备培养基时需要将培养基溶液进行高温高压的杀菌处理，并使用0.22微米的滤膜滤过杂质。

4.无菌技术的掌握：在细胞培养实验中，需要学习和掌握无菌技术，如无菌操作台、细菌灯和无菌手套等的正确使用方法。

5.细胞的分离和悬浮：将组织样本放入消化液中，进行细胞的分离和悬浮，并通过离心和过滤的方式获得单个细胞悬浮液。

6.细胞培养的接种：将细胞悬浮液接种在含有培养基的培养皿或离心管中，放入培养箱中进行培养。

7.细胞传代的操作：当细胞达到一定密度后，需要进行细胞传代操作。

传代操作时，需要将细胞悬浮液转移到新的培养皿中，并加入新的培养基进行细胞的维持和生长。

总之，细胞培养实验是生物学研究中不可或缺的一项实验技术，掌握细胞培养的基本知识和无菌操作流程对实验结果的准确性和可靠性至关重要。

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16.弃上清液，加冻存液2ml 吹打，使细胞均匀混在 冻存液中，再加3ml冻存液，用吸管吸出打入多 个冻存管中，每管1.5ml。 17.盖上盖子，用封口膜封好,标上细胞名称和日期 . 18.冻存方式：4℃30分钟，-20℃15分钟，-80℃60 分钟，最后转移到液氮罐内。
注意：
冻存管移动时要夹在冰块中间。
注意：
1.打开培养箱时尽量不要说话； 2.步骤9中培养瓶放入培养箱时，应把盖子拧开少许。
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传代
1.把细胞培养瓶从培养箱中拿出，拧紧盖子； 2.观察瓶内培养基的颜色，是否浑浊等；放在 倒置显微镜下观察细胞生长状况。 3.放入超净工作台内，点燃酒精灯，拿培养瓶 口在酒精灯火焰上转两圈以上，至少三秒。 4.取下盖子，烧瓶口；倒掉培养基，烧瓶口； 5.拿出PBS瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞 子取出，烧瓶口（至少10圈）。
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6. 用吸管吸取3ml的PBS，打入培养瓶内。烧培养 瓶口，来回晃动PBS100次后到掉PBS。重复此 操作一次。 7. 拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子 取出，烧瓶口（至少10圈）。 8. 用吸管吸取1ml的胰酶，打入培养瓶内，烧培养 瓶口和盖子，盖上盖子； 9. 拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然 后用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；5 分钟后取出； 10. 在倒置显微镜下观察细胞的消化情况。若细胞 变成单个圆形，则可进行传代。
例如配制10ml的冻存液：
高压的小瓶中加3ml过滤的胎牛血清， 再加6ml培养基，最后加1ml的 DMSO,混匀即可。
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清洁液的配制
重铬酸钾 (单位:克) 浓硫酸 (单位:ml) 蒸馏水 (单位:ml)
弱液
100
100
1000
次强液
强液
120
63
200
1000
1000
200
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一般常用次强液。新配制的清洁液为棕红色， 多次使用后，成绿色时就不能再用, 需重新配制。
36%-38%的浓HCL到5%的稀HCL的配制比 例为3:17，
例如,配制1000ml的5%的稀盐酸,150ml的浓HCL加850ml的蒸馏水即 可。
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细胞计数 方法
吸出细胞悬液少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和 计数板之间。 静置三分钟 镜下观察，计数板四大格细胞总数。公式为：细胞数/ml= 四大格细胞总数/4 ×104个
原理
活细胞的线粒体的乳酸脱氢酶可使MTT（黄绿色）分解， 产生兰紫色结晶状甲赞颗粒，积淤细胞内和细胞周围； 其量与细胞数成正比，也与细胞活力成正比。
注意
MTT法只能测定细胞相对数和相对活力, 不能测定细胞绝 对数.
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其它溶液的配制
95%到75%的酒精的配制比例为4:1，
例如,配制100ml75%的酒精,80ml 95%酒精加20ml三蒸水即可。
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冻存
1.把细胞培养瓶从培养箱中拿出，拧紧盖子； 2.观察瓶内培养基的颜色，是否浑浊等；放在 倒置显微镜下观察细胞生长状况。 3.放入超净工作台内，点燃酒精灯，拿培养瓶 口在酒精灯火焰上转两圈以上，至少三秒。 4.取下盖子，烧瓶口；倒掉培养基，烧瓶口； 5.拿出PBS瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将 塞子取出，烧瓶口（至少10圈）。
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RPMI1640培养基的配制：
1. 取一小袋1640培养粉，加高压过的三蒸水800ml，
在1000ml的烧杯中用玻璃棒搅拌溶解； 2. 加碳酸氢钠2.0g，再加三蒸水定容至1000ml； 3. 加青霉素(100U/ml) ，链霉素（100µg/ml）； 4. 在超净工作台内过滤除菌，分装成180ml，20℃备用。
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复苏
1. 取一敞口瓶，内装蒸馏水，放入电热恒温 水槽中，温度设置为39.0℃。 2. 等达到39.0℃30分钟后，用镊子将欲复苏 的细胞从液氮管中取出，快速放入敞口瓶 内，晃动，使冻存管内完全液化。 3. 用酒精擦拭冻存管，放入工作台内。 4. 用镊子将封口膜夹掉，轻烧管口； 5. 用吸管吸出冻存管内的细胞悬液，打入已 装有5ml新鲜培养基的培入培养瓶内。烧培养瓶口， 来回晃动PBS100次后到掉PBS。重复此操作一次。 7.拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取出， 烧瓶口（至少10圈）。 8.用吸管吸取5ml-8ml的培养基打入培养瓶内，烧瓶口， 镊子和盖子； 9.盖上盖子，倒置显微镜下观察，之后标明名称和日期， 酒精棉球擦瓶口和瓶身，放入培养箱内即可。
注意
镜下见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算; 若细胞团数量占10%以上，重新制备细胞悬液。 计数时，计左侧和上方的压线细胞，右侧和下方的压线细 胞不应该计在本方格之内。
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血清灭活
把血清置于56℃的水浴锅里待完全溶解后 开始计时，30分钟后分装成20ml的小瓶， 放-20℃备用。
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实验用品的洗涤
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11.盖上96孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微镜下 观察，用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养4 小时。 12.取出96孔板，倒掉孔内的液体，每孔加 DMSO150µl，放入酶标仪内，振荡600秒， 读数即可。
注意：
• • • •
本实验以CHL细胞为例. 加DMSO时，带口罩和手套。 放入酶标仪内时，96孔板勿盖盖子。 多重复几次。
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6. 用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养24小时。 7. 从培养箱中取出，镜下观察，拿到工作台内， 用200µl的枪将孔内的培养基吸出； 8. 加入不同浓度的药物的无血清培养基,每孔200µl。 9. 盖上96孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微镜下 观察，用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养24 小时。 10.从培养箱中取出，镜下观察，拿到工作台内， 每孔加MTT液20µl。
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玻璃器皿
1. 用自来水冲洗三遍，用蒸馏水洗三遍，放
入烤箱下层烘干， 2. 放入清洗缸即酸缸内，让整个器皿没入清 洗液中 ,时间为过夜或者至少8个小时以上. 3. 取出器皿，用自来水冲洗十遍，再用蒸馏 水冲洗三遍后，放入烤箱上层烘干 。 4. 取出器皿，高压后，放烤箱上层，再次烘 干即可使用。
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溶液的配制
PBS RPMI1640培养基 消化液 冻存液 清洁液 MTT 其它溶液
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PBS配制
名称 质量(单位:克)
NaCl KCl Na2HPO4.12H2O KH2PO4
8.00 0.20 3.49 0.20
之后，加1000ml三蒸水,调节PH值在 7.2-7.4之间,高压121 ℃ ,30分钟,4℃备用。
注意：
保护自己； 先将重铬酸钾完全溶解于水中（必要时可加热帮 助溶解），然后缓慢加入浓硫酸，以免产生热量 太多，使容器破裂。
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方法
1.
噻唑蓝MTT液配制
称取25mgMTT, 加入5ml PBS液, 混匀, 即成5mg/ml的 MTT液； 2. 用0.22µm的微孔滤器除菌, 避光, 4℃保存一周内使用.
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10.在倒置显微镜下观察细胞的消化情况。若 细胞变成单个圆形，则可进行传代。 11.拿到工作台内，烧瓶口，取下盖子，烧瓶 口。用吸管吸出胰酶，烧瓶口。 12.拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子 将塞子取出，烧瓶口（至少10圈）。 13.用吸管吸取5ml的培养基打入培养瓶内， 用吸管吹打成单个细胞悬液。计数，分装 即可。
要用酒精棉球擦拭台面,除了酒精灯,镊子,试管架 等物品外,其他都要拿出工作台外. 紫外灯照射30分钟.
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换液
1. 把细胞培养瓶从培养箱中拿出, 拧紧盖子;
2. 观察瓶内培养基的颜色, 是否浑浊等;
放在倒置显微镜下观察细胞生长状况。 3. 放入超净工作台内,点燃酒精灯,拿培养瓶 口在酒精灯火焰上转两圈以上,至少三秒. 4. 取下盖子,烧瓶口;倒掉培养基,烧瓶口; 5. 拿出PBS液瓶子,烧瓶口和镊子;用镊子将 塞子取出,烧瓶口（至少10圈）。
细胞培养
1
一
原代培养（略）
2
二. 传 代 培 养
准备及注意事项 换液 传代 冻存 复苏 MTT
3
准备事项
1. 紫外灯照射细胞室30分钟,风机运行10分
2.
3. 4. 5. 6.
钟后方可进入实验室. 穿专用的口罩,帽子,拖鞋,工作衣等. 带手套,并用酒精擦拭之. 准备好实验必需用品. 超净工作台内操作前用酒精棉球擦拭台面. 超净工作台内操作完成后，
橡胶，塑料用品 玻璃器皿
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橡胶，塑料用品
1. 用自来水冲洗后放入专用烧杯内,加入蒸馏水，
2.
3. 4. 5.
使之淹没物品稍许，放在电炉上加热； 等水开时开始记时，三十分钟后取下，倒掉烧杯 内的水，自来水冲洗3遍，蒸馏水冲洗2遍，放 烤箱下层中烘干； 烘干后浸泡在５％盐酸中，至少30分钟； 将盐酸倒掉，用自来水冲洗十遍，蒸馏水冲洗三 遍，放入烤箱上层烘干． 烘干后放入饭盒内高压，之后放烤箱上层再次烘 干即可使用．
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6. 烧瓶口，镊子和盖子；盖上盖子， 在倒置显微镜下观察。 7. 用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内. 注意： 步骤2中，蒸馏水不要没过冻存管口 所有步骤结束过24小时后一定要换液；
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MTT法
1.实验开始前，96孔板应在超净台紫外灯下照 射2个小时以上。 2.从培养箱中拿出培养瓶，观察，加PBS，加 胰酶消化，加培养基，计数。 （方法及步骤同传代1-13步。） 3.加培养基，调整细胞浓度为10000个/200µl. 4.加到96孔板内,每板6行8列共48孔,每孔 200µl. 5.盖上96孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微 镜下观察，标明名称，序号和日期。
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6.用吸管吸取3ml的PBS，打入培养瓶内。烧培养 瓶口，来回晃动PBS100次后到掉PBS。重复此 操作一次。 7.拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取 出，烧瓶口（至少10圈）。 8.用吸管吸取1ml的胰酶，打入培养瓶内，烧培养 瓶口和盖子，盖上盖子； 9.拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然后 用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；5分钟 后取出；