噬菌体的污染防治方法

QUALITY MANAGEMENT 质量管理酸奶生产中噬菌体的危害及控制□ 任江红 光明乳业股份有限公司光明乳业研究院秦立虎 西安市奶牛育种中心随着乳制品工业的迅速发展，酸奶以其良好的风味、组织质地、营养价值及独特的保健功能，得到人们越来越多的重视，新品开发层出不穷。

如果操作不当，有可能出现各种质量问题。

现从生产实践和研究结果出发对噬菌体的防治进行探讨。

噬菌体的特性1.繁殖速度快，繁殖量大噬菌体在菌体内增殖过程不同，分为烈性噬菌体（溶菌性）和温和噬菌体（溶源性）两种，前者感染并可迅速在菌体内大量繁殖并最终裂解释放出新的噬菌体再感染其它细菌；后者指可以将自身DNA整合到宿主染色体上并稳定遗传的噬菌体。

噬菌体浸染乳酸菌的过程相当快，噬菌体的溶菌周期从噬菌体附着宿主开始，到复制新的噬菌体颗粒完成，这个溶菌周期仅需要45min并且能生成100个新的噬菌体颗粒，同时宿主细胞也将破裂，释放出的成熟噬菌体又去侵袭新的宿主细胞，最终感染一大片，阻碍了酸奶的正常发酵过程。

2．耐热程度高噬菌体能抵抗恶劣的环境，在短时间煮沸和冷冻条件下，都不能杀灭噬菌体，脱水干燥也不能杀死乳和乳清中的噬菌体，噬菌体耐热程度高:70℃只下降3log～4log，在90℃下降大于6log，一般牛奶在85℃下热处理20min才能够确保杀死噬菌体。

3．对多种消毒剂的高耐受力有人曾结合生产实际通过使用不同浓度比例、型号的灭菌处理液，对噬菌体进行杀死，同时又不影响乳酸菌发酵进行了试验，结果发现灭菌处理液使用不当不仅影响噬菌体的杀死同时也会抑制乳酸菌的生长繁殖。

噬菌侵染酸奶发酵症状（1）酸奶发酵时间与正常发酵时间相比明显延长。

由于噬菌体的侵入破坏了发酵剂的活力，导致发酵时间缓慢。

（2）具有及强的传染性一天内会有几缸酸奶发生时间延长现象。

（3）酸奶产品中乳酸菌活菌数下降。

噬菌体刚侵染后，活性乳酸球菌数和乳酸杆菌数量下降非常明显，数量都不到原来的十分之一，噬菌体侵染25天以后，活性乳酸杆菌数量都不及正常产品中的千分之一。

噬菌体的污染防治方法修订稿噬菌体（phage）是一种寄生于细菌的病毒，可以通过感染细菌并破坏其细胞壁来进行复制繁殖。

噬菌体在许多领域具有广泛的应用，包括基因工程、生物技术和医学疗法。

然而，在许多情况下，噬菌体的污染可能会对实验室操作或工业生产带来不利影响。

因此，有必要制定有效的噬菌体污染防治方法。

首先，应加强实验室和生产设施的清洁和消毒措施。

定期进行设备和操作表面的清洁，可以减少噬菌体的积累和传播。

使用含有消毒剂的清洁剂对实验室和生产设施进行彻底清洁，并确保其符合卫生标准。

在实验室操作结束后，及时清洁操作台及其周围区域，以减少噬菌体的存活和传播。

其次，严格控制操作环境中的细菌污染，并定期监测和检测噬菌体的存在。

减少细菌污染可以降低噬菌体的复制和传播。

实验室和生产操作中，应遵循无菌操作的原则，确保所有使用的培养基、培养容器和试剂都是无菌的。

定期对操作区域进行表面采样，并使用特定的培养基或PCR方法检测细菌和噬菌体污染。

第三，使用有效的防护措施和个人防护装备。

实验室和生产人员应配备适当的防护装备，包括实验服、手套和面具等，以防止可能的噬菌体污染。

在处理潜在带菌样品或噬菌体悬液时，确保在安全柜下操作，以避免呼吸或皮肤接触。

此外，进行操作前后，应充分洗手，并使用适当的消毒剂对工作区域进行处理。

第四，加强对实验室和生产操作人员的培训和教育。

操作人员应接受噬菌体防治的培训，了解噬菌体的特性、传播途径和防控方法。

他们应该掌握正确的实验室操作技术和个人防护装备的使用方法，并能够合理安排实验室和生产设施的清洁工作。

第五，建立健全的噬菌体污染事故应急预案。

及时制定噬菌体污染事故的应急预案，明确责任人和应急处理流程。

一旦发生噬菌体污染事故，应立即采取有效的控制措施，尽快隔离感染源，并进行全面的消毒和清洁工作。

同时，对可能受到污染的实验室设备和物品进行彻底检测和处理，以防止进一步传播。

综上所述，噬菌体污染的防治是实验室安全和生产质量控制的关键环节。

氨基酸发酵生产噬菌体的防治噬菌体是病毒的一种, 是一种极微小的生物, 体积是细菌的1/1000左右, 它可以通过细菌过滤器, 只有在电子显微镜下才能看到.氨基酸生产菌的噬菌体, 一般在25~35℃、pH5～9时较为稳定,但易受热变性(60～70℃,10～15min),对氧化物敏感,可被酸碱致死.此外,凡能引起蛋白质变性的化学药品(如0.5%甲醛、1%新洁尔灭、0.5%苯酚或漂白粉等)都可使噬菌体失活.需要值得注意的是:噬菌体在干燥状态比湿润状态稳定, 能长时间(有的可达半年以上)以活性状态浮游于空气中, 这是氨基酸发酵生产受噬菌体污染的一个重要原因.噬菌体的防止是一项系统工程, 从原料与原辅材料、消毒灭菌、种子检查、空气净化系统、严格活菌体排放、环境卫生、设备管路有无死角、车间布局及职工责任心等诸多方面,都必须分段检查把关,才能做到根治噬菌体的危害.1.严格活菌体排放,切断噬菌的“粮源”：噬菌体是专一性的活菌寄生体,具有严格的寄生范围.噬菌体没有细胞结构,缺乏独立代谢的酶体系,不能脱离寄主而自行生长繁殖.噬菌体只能在活的、正处于生长繁殖阶段的细胞中进行繁殖,而在死的、老的或休眠状态的细胞中以及代谢产物上都不能繁殖.因此,如果我们能够不让活的氨基酸(丝氨酸)生产菌在环境中生长蔓延, 也就切断了噬菌体的食物来源, 破坏了噬菌体的滋生场地和繁殖条件.(1) 摇瓶液、测样后废液、洗罐后所废弃的菌体、种子及带菌器皿洗涤水等,应集中起来灭菌后再俳放,严防不加任何处理的随意排放,以杜绝隐患.(2) 取样液、试验后的废弃菌液或发酵液,要密闭、集中起来,灭菌后再经管道或阴沟向远处排放.切忌取样时连个接的桶也没有,菌液四处飞溅,污染环境.(3) 排气、发酵跑液要经管道集中于楼外的密闭水封池中,或通入贮有药剂的容器设备中经灭菌后通过管道或密闭阴沟向远处排放(与空压车间相反的方向和下风方向送出100~200米远后再排放), 这一点很重要, 必须引起高度重视.(4) 噬菌体不耐热, 对甲醛敏感, 感染噬菌体的发酵罐或种子罐, 放罐前须加热至80~100℃,杀死噬菌体后再往远处排放或送往提取车间.放罐后, 空罐及各路管道消毒时加甲醛熏蒸. 有时还要煮罐, 用pH11~13稀碱液搅拌煮沸4~6小时, 消除死角后, 再用甲醛熏蒸.2.环境卫生, 消灭噬菌体与杂菌：噬菌体的最初来源, 一种是菌体本身带有噬菌体, 一种是生产环境的自然条件中存有噬菌体, 或由相近噬菌体经过变异而侵染. 因此, 采取以环境净化为中心的综合性防治方法, 建立工厂环境卫生制度, 消灭或减少环境中的噬菌体与杂菌, 清除噬菌体赖以生存的发展的条件, 是防止噬菌体的基本措施之一.(1)建立工厂环境卫生制度(以发酵车间为中心, 包括空压车间), 定期清扫, 定期消毒, 定期简查. 对车间四周有严重污染噬菌体的地点, 应及时利用药剂或其它方法处理.(2) 定期(每1~2周一次) 用消毒灭菌剂喷雾, 消灭空气中的噬菌体与杂菌. 如用次氯酸钙烟雾剂、新洁尔灭、漂白粉液或氯化苄叉毒芹稀释液喷雾等.喷雾地点除发酵车间室内外之外,也应包括空压机房内外及进风口周围等.(3)车间四周、角落及楼周围要保持清洁,定期清扫、冲刷,撒漂白粉或石灰等.(4)车间周围要尽量扩大混凝土地面,以利冲洗和消毒.并且,通往车间的路面应尽量采用水泥等光滑路面.3.严防噬菌体进入种子罐或发酵罐内：(1) 不使用本身带有噬菌体的菌种.种子纯化时, 应以确保不带噬菌体为选种的主要依据, 不能只看产酸高低. 经确认不是溶源菌的生产用菌, 要经常用双层琼脂平板检查, 保护生产用菌不受噬菌体感染.(2) 要经常性的对菌种进行平板分离, 挑选一定数量的单菌落传斜面进行培养, 而后进行摇瓶发酵初筛和复筛, 挑选没有被噬菌体污染且产酸较高的斜面单菌株制成安瓿管保藏. 并传子斜面作为母斜面准备上罐用. 并且,1~2月应再开一支安瓿管传斜面作为母斜面,之后传子斜面并摇瓶考察;或再次分离经摇瓶考察后传母斜面和子斜面准备上罐用.(3) 种子室与发酵车间分开、远离,使种子工作不处于有噬菌体和杂菌污染的环境中,以确保种子进行的第一环不染噬菌体.(4)严格无菌操作:①加强种子室灭菌、无菌操作及安全卫生措施.感染噬菌体的培养物不得带入无菌室、摇瓶间(因噬菌体可透过纱布棉塞飞扬),种子室应尽量减少与外界接触.②消灭设备死角.③认真进行培养液、发酵设备、空气净化系统及管路的灭菌工作.(5)较好的空气净化系统:高空采风(高20～40米、背向采风,并且上面有冒子,下面有放水阀)------预过滤(金属丝、玻璃纤维棉和无纺布三道粗滤)------空压机------管道加热(150℃以上)------保温管道输送------大贮气罐保温(100～200T罐)------冷却器------油水分离------冷冻水冷却------油水分离------去雾器------贮气罐------预热器(预热空气60～70℃)------总过滤器(二只并联、轮换使用,每10～15天蒸汽灭菌一次)------分过滤器(用一次灭菌一次)。

噬菌体与发酵工业噬菌体对实践的关系主要体现在对发酵工业的危害上。

当发酵液受噬菌体严重污染时，会出现：①发酵周期明显延长；②碳源消耗缓慢；③发酵液变清，镜检时，有大量异常菌体出现；④发酵产物的形成缓慢或根本不形成；⑤用敏感菌作平板检查时，出现大量噬菌斑；⑥用电子显微镜观察时，可见到有无数噬菌体粒子存在。

当出现以上现象时，轻则延长发酵周期、影响产品的产量和质量，重则引起倒罐甚至使工厂被迫停产。

这种情况在谷氨酸发酵、细菌淀粉酶或蛋白酶发酵、丙酮丁醇发酵以及各种抗生素发酵中是司空见惯的，应严加防范。

要防治噬菌体的危害，首先是提高有关工作人员的思想认识，建立“防重于治”的观念。

预防噬菌体污染的措施主要有：（1）决不使用可疑菌种认真检查斜面、摇瓶及种子罐所使用的菌种，坚决废弃任何可疑菌种。

（2）严格保持环境卫生。

（3）决不排放或随便丢弃活菌液环境中存在活菌，就意味着存在噬菌体赖以增殖的大量宿主，其后果将是极其严重的。

为此，摇瓶菌液、种子液、检验液和发酵后的菌液绝对不能随便丢弃或排放；正常发酵液或污染噬菌体后的发酵液均应严格灭菌后才能排放；发酵罐的排气或逃液均须经消毒、灭菌后才能排放。

（4）注意通气质量空气过滤器要保证质量并经常进行严格灭菌，空气压缩机的取风口应设在30～40米高空。

（5）加强管道及发酵罐的灭菌。

（6）不断筛选抗性菌种，并经常轮换生产菌种。

（7）严格执行会客制度。

如果预防不成，一旦发现噬菌体污染时，要及时采取合理措施。

例如，①尽快提取产品，如果发现污染时发酵液中的代谢产物含量已较高，即应及时提取或补加营养并接种抗噬菌体菌种后再继续发酵，以挽回损失；②使用药物抑制，目前防治噬菌体污染的药物还很有限，在谷氨酸发酵中，加入某些金属螯合剂（如0.3～0.5％草酸盐、柠檬酸铵）可抑制噬菌体的吸附和侵入；加入1～2μg／ml 金霉素、四环素或氯霉素等抗生素或0.1～0.2％的“吐温60”、“吐温20”或聚氧乙烯烷基醚等表面活性剂均可抑制噬菌体的增殖或吸附；③及时改用抗噬菌体生产菌株。

如何去除预防以及杀灭噬菌体，去除噬菌体污染？噬菌体是什么？它具有怎样的危害？噬菌体是一种病毒，是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒总称，形体极其微小，没有完整的细胞结构，由核酸与蛋白质构成，不能够脱离寄主而自行生长繁殖，因而一定要在活体细胞中生长，且对于寄主细胞有严格的专一性，能够在宿主细胞内快速增殖，在宿主菌内裂殖能导致宿主细胞的破裂而衰亡。

一般一种细菌往往可以被多种噬菌体感染，但一种噬菌体只能感染一种细菌及与其他相近的菌。

如果生产菌株被噬菌体侵染，那么它会很快地在菌体内得到增殖，改变宿主性质，使之成为制造噬菌体的“工厂”，大量繁殖噬菌体，最后导致生产菌菌体的裂解死亡，而由于其体积小，无法通过一般细菌学手段进行检测，污染后不能及时判断，因此在发酵生产中应以防范为主。

噬菌体的模样噬菌体的传播途径有哪些？噬菌体的生存、生长、繁殖过程离不开寄主菌体，且噬菌体对于寄生菌有高度专一性。

它由6面体的头部和尾部组成，头部直径约20-100nm，尾部由无尾至约350nm不等，产生谷氨酸的细菌，每个细胞平均可以释放出10-100多个噬菌体。

由于噬菌体的个体极其微小，目前各工厂普遍采用的棉花活性炭过滤器、超细玻璃纤维过滤器等都还不能有效地将其去除。

因此当环境中存在有噬菌体时，是一件极其危险的事情，它随时可能跟随者空气进入发酵液、种子中，进而造成污染，影响生产。

噬菌体对生产过程的危害：在酸奶生产过程中，噬菌体污染常有出现。

噬菌体对发酵微生物的影响还不太为人们所熟悉，虽然在使用翻代菌种生产酸奶过程中，随着生产的不断延续，常出现发酵时间过程、产品出现不良风味、口感变差等异常现象，但由于盲目怀疑原料奶的无抗检测、菌种翻代的操作、酸奶发酵的工艺控制等因素而忽视了对问题根源的挖掘。

在发酵工业中，菌种制作或生产过程中遭受噬菌体污染将导致发酵微生物敏感菌株的裂解或破坏，轻则产物收率低、重则倒罐，因而被认为是生产的关键环节。

噬菌体快速检测方法一、目的要求1.定期检测生产车间空气中和二级种子罐培养液中的噬菌体污染度，观察噬菌斑的形态和大小。

2.学会快速检查发酵液中是否被噬菌体污染的方法。

二、基本原理噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物细胞的病毒，某种噬菌体往往只能感染一种或与它相近的某种细菌。

按其感染细菌的过程分两类：大多数烈性噬菌体侵染细菌后迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，因而可在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的噬菌斑如图1。

温和噬菌体侵染细菌后呈原噬菌体（或称前噬菌体）状态，一般不引起细菌裂解，使宿主成为溶源性细菌。

在肉膏蛋白胨双层琼脂平板上产生透明噬菌斑中心的菌落，即为溶源性细菌。

了解噬菌体的特性，快速检查噬菌体，在生产和科研工作中防止噬菌体污染具有重要作用。

图1 敏感细菌的平板上出现肉眼可见的噬菌斑空气中和二级种子罐培养液中的噬菌体污染度是预防噬菌体的一个措施。

在连续使用特定菌株进行赖氨酸发酵时，首先是空气中的噬菌体浓度增加，数月后种子罐的噬菌体浓度也急剧增加，随之主发酵罐发酵液中的噬菌体检出浓度也就增加；当空气中的噬菌体浓度上升到每个平板达10～20PFU/ml（噬菌斑生成单位）时，二级种子罐的噬菌体浓度为40～50 PFU/ml；之后迅速增加，达到102 PFU/ml的程度，终于在主发酵罐发生溶菌。

经常检测赖氨酸分厂环境中，特别是空气中与种子罐二级种子液中的噬菌体数，就能知道环境的噬菌体污染程度，也就能预知主发酵罐中会不会发生噬菌体的污染。

噬菌体是病毒的一种，是一种极其微小的生物，体积是细菌的1/1000左右，它可以通过细菌过滤器，只有在电子显微镜下才能看到。

噬菌体具有非常专一的寄生性，只能在特异性寄主细胞中增殖。

由于噬菌体缺乏独立代谢的酶体系，不能脱离寄生而自行生长繁殖，因而噬菌体的繁殖必须依存于寄生菌的繁殖，只能在活的正在繁殖阶段的细胞中进行增殖。

在死的、衰老的、处于休眠状态的细胞中以及在代谢产物或培养基上都无法繁殖。

噬菌体的污染和防治在许多发酵生产中，如氨基酸发酵、丙酮-丁醇发酵和抗生素发酵中常常遇到噬菌体（b acteriaphage）污染，引起溶菌，并随之出现发酵迟缓或停止发酵等异常现象。

本节主要介绍噬菌体污染的特征，检查方法及防治措施。

一噬菌体污染的特征1 发酵液光密度上升缓慢，甚至下降，肉眼可见发酵液逐渐变清；2 耗糖速度缓慢或停止，产物生成量少或不增加，发酵液中残糖高；3产生大量泡末，发酵液呈粘稠状；4 菌体不规则，甚至出现畸形。

二噬菌体的检查方法1．双层琼脂平板法（1）双层琼脂平板的制备：先用7~8mL 2%的琼脂培养基作底层，凝固后，加入3~4mL 冷至45℃的1%琼脂上层培养基（其中含0.2mL发酵菌种悬液和0.1mL待检发酵液），让其平整凝固；（2）在发酵菌的适宜温度下培养，若是细菌，一般培养16~20小时。

（3）检查有无透明的噬菌斑。

2．液体培养检查法将培养基、发酵菌种及待检发酵液三者混合，培养后观察培养液是否变清。

3．斑点试验法先制备好涂布有发酵菌种的平板，再用接种环或无菌吸管取少许发酵液在平板上点种，培养后，观察是否有噬菌斑。

4．玻片快速法将发酵菌种、发酵液和少量琼脂培养基（含0.5~0.8%的琼脂）混匀后涂布于无菌载玻片上，经短期培养后，在低倍镜下观察是否有噬菌斑。

三噬菌体的防治发酵液中污染噬菌体，不外乎有两种原因。

1 菌种本身带噬菌体，特别是溶源性噬菌体，对这种菌种，一经发现，应立即弃去。

2 生产的环境中有噬菌体。

因此，可采取相应的预防措施：1 决不使用可疑菌种；2 清除周围环境中存在的噬菌体。

能灭菌的灭菌，能消毒的消毒，搞好清洁卫生工作；3 选育抗噬菌体菌株4 轮换使用菌株。

因为一个菌株用的时间一长，就有可能出现该菌种的噬菌体。

5 注意通气质量。

取风口应设在30~40米的高空，空气过滤器要保证质量；四发酵液污染噬菌体后的抢救措施如果一旦发现噬菌体污染，应及时采取补救措施1．若在发酵前期污染了噬菌体，因为此时耗糖还不多，常用以下措施（1）补加抗性种子，并根据发酵液中的营养多少，适当补加营养物质；（2）补加约50%的已培养至对数期的正常的发酵液，再进行发酵；（3）若噬菌体轻度污染，菌体仍能较正常地生长，并积累代谢产物，则可照常进行发酵，若污染严重，则用加热法（70~80℃）灭活噬菌体，放罐后重消毒。