水通道蛋白四抗体再认识培训课件

血清水通道蛋白4抗体测定对视神经脊髓炎的诊断及预后判断价值厉向;童巧文;柯建明;叶莉萍;戚飞腾;万真;夏君慧【摘要】目的:探讨血清水通道蛋白4(AQP4)抗体检测对视神经脊髓炎(NMO)诊断及预后判断的临床价值.方法:收集2010年1月至2013年12月在温州医科大学附属第一医院神经内科住院或门诊就诊的48例NMO、33例脊髓炎(TM)[包括26例长节段脊髓炎(LETM)和7例复发性脊髓炎(rLETM)]、30例视神经炎(ON)[包括25例双眼视神经炎(BON)和5例复发性视神经炎(RION)]、52例多发性硬化(MS)及16例其它神经系统疾病(OND)的患者血清及相关临床资料.采用细胞免疫荧光法检测血清AQP4抗体.分析各组患者血清AQP4抗体的阳性率及抗体滴度,比较AQP4抗体阳性NMO患者与AQP4抗体阴性患者的临床特征.通过绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线),评价AQP4对NMO诊断的敏感性和特异性.应用Kaplan-Meier曲线分析血清AQP4抗体阳性患者进展为NMO的累计概率.结果:NMO组AQP4抗体阳性率最高(87.50％),其后依次为rLETM组(85.71％)、RION组(80.00％)、LETM组(30.70％)、BON组(8.00％)和MS组(3.85％),OND组抗体检测为阴性.NMO组中血清AQP4抗体阳性患者在性别构成比、确诊为NMO时间及伴有严重神经炎的比例等方面,与抗体阴性患者相比差异有统计学意义(P＜0.05).ROC曲线提示血清AQP4抗体对诊断NMO的敏感性为87.5％,特异性为85.4％.KaplanMeier曲线提示AQP4抗体阳性患者进展为NMO的累积概率明显高于抗体阴性的患者(P＜0.05).结论:血清AQP4抗体检测对诊断NMO具有较高的敏感性及特异性,且有助于NMO预后和转归的判断.【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2014(030)011【总页数】6页(P1974-1979)【关键词】视神经脊髓炎;水通道蛋白4抗体;多发性硬化【作者】厉向;童巧文;柯建明;叶莉萍;戚飞腾;万真;夏君慧【作者单位】温州医科大学附属第一医院神经内科,浙江温州325000;温州医科大学第三临床学院神经内科,浙江温州325000;温州医科大学附属第一医院神经内科,浙江温州325000;烟台市毓璜顶医院重症监护室,山东烟台264000;温州医科大学附属第一医院神经内科,浙江温州325000;温州医科大学附属第一医院神经内科,浙江温州325000;温州医科大学附属第一医院神经内科,浙江温州325000【正文语种】中文【中图分类】R446.62视神经脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)是一种特发性炎性脱髓鞘疾病，病变主要侵犯视神经和脊髓，导致严重的视神经炎和横贯性脊髓炎[1]。

本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断人（Human）水通道蛋白4抗体（AQP4-Ab）ELISA检测试剂盒使用说明书检测原理试剂盒采用双抗一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。

往预先包被抗原的包被微孔中，依次加入标本、HRP标记的检测抗原，经过温育并彻底洗涤。

用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD 值），与CUTOFF值相比较，从而判定标本中人水通道蛋白4抗体（AQP4-Ab）的存在与否。

样品收集、处理及保存方法1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。

3000转离心30分钟取上清。

3. 细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。

3000转离心10分钟取上清。

5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品1.酶标仪（450nm）2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL3.37℃恒温箱操作注意事项1. 试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。

从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。

2. 实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。

3. 预处理后的样本无需稀释，直接取50μL加样即可。

4. 严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

5. 所有液体组分使用前充分摇匀。

试剂盒组成名称96孔配置48孔配置备注微孔酶标板12孔×8条12孔×4条无阴性对照0.5mL 0.5mL 无阳性对照0.5mL 0.5mL 无检测抗原-HRP 10mL 5mL 无20×洗涤缓冲液25mL 15mL 按说明书进行稀释底物A 6mL 3mL 无底物B 6mL 3mL 无终止液6mL 3mL 无封板膜2张2张无说明书1份1份无自封袋1个1个无试剂的准备20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。

水通道蛋白-4毕业论文1 白家族,分布于高等脊椎动物上皮细胞或内皮细胞.结构上由28-KDa亚单位组成4聚体,每个亚单位构成孔径约0.38nm的水孔通道,在渗透压驱动下实现水双向跨膜转运【1】.目前11种亚型已经在哺乳动物中被确定(AQP0-10),各种亚型的体内分布具有组织特异性,其中水通道蛋白-4 (Aquaporin 4,AQP4)以极化形式集中分布于中枢神经系统脑毛细血管周边的星形胶质细胞足突或室管膜细胞【2】.血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)为脑内另1调控水平衡的复合体,由无窗孔的脑毛细血管内皮细胞及细胞间紧密连接,基底膜,星形胶质细胞等组成,介于血液和中枢神经系统(central nervous system,CNS)之间,限制血液中某些离子,大分子物质转移到脑实质,此屏障作用为维持CNS内环境稳定,保障脑功能正常行使提供了重要保障.BBB分化发育过程中脑毛细血管内皮细胞间紧密连接的形成虽被认为是其成熟的标志,但BBB生理功能的实现有赖于各组成成分间的相互作用.近来对星形胶质细胞调控BBB物质交换和脑内水平衡方面的作用日益受到重视,并认为与AQP4表达有关.本文就AQP4与血脑屏障发育及其完整性关系的研究进展作1 中华麻醉在线 https:// 2022年9月2综述.1.BBB分化发育过程中AQP4的表达目前由于对鸡胚视顶盖中血管及BBB分化的研究已较完善,因此常被用于BBB的研究模型.Nico及其同事【3】采用免疫细胞化学, 分子生物学技术研究了鸡胚视顶盖AQP4在BBB分化发育过程的动态表达.免疫电镜显示鸡胚视顶盖发育第9 d,BBB仅由不规则的内皮细胞组成,内皮细胞间紧密连接尚未形成,AQP4未见表达.待发育至第14 d,Western blot 技术首次在约30 kDa链附近检测出AQP4 的免疫活性,电镜下显示短的内皮细胞间紧密连接已形成,并串联构成BBB的微血管,星形胶质细胞间断黏附于血管壁,AQP4不连续地表达于血管周边,血管周围仍然存在小空隙.发育第20 d BBB成熟,内皮细胞间紧密连接形成,BBB微血管被星形胶质细胞紧紧包被,血管周边星形胶质细胞足突上的AQP4呈现强阳性表达,且冷冻断裂研究显示AQP4的正交排列阵也同步形成.而在啮齿类动物,BBB分化发育发生于出生后,AQP4表达与BBB发育也表现出1定的同步性.大鼠出生后脑毛细血管呈最大速率增殖,BBB逐步发育完全,脑内AQP4的首次检出也恰在出生后(生后第7 d的小脑内),且随BBB分化发育逐渐增加【4】.以上证据显示不论BBB于胚胎期发育完全的禽类还是出生后发育完全的啮齿类动物,AQP4表达与BBB分化发育都表现出1定意义的同步性,说明脑内水调控与血脑屏障关系密切.2.AQP4在BBB发育过程中的作用3水通道蛋白的表达与BBB生理功能间的联系在胚脑发育过程中得到了很好地体现.啮齿类动物胚脑发育之初,巨大的细胞外间隙(ECS)容纳着大量水和离子,仅通过简单扩散将其转移入血液,ECS 容积改变不明显.随着BBB分化发育,胶质细胞在脑毛细血管外层被膜形成,AQP4表达增多,待到脑发育后期BBB分化发育成熟时,ECS 内水及离子得以高效转运,ECS容积迅速减小,完成了脑的最后发育【4】.为进1步揭示AQP4在BBB发育过程中的作用,研究者【3】采用脂多糖(LPS)破坏发育20 d的鸡胚视顶盖(即发育成熟的BBB)以模拟脑膜脑炎时的病理病变.受LPS影响电镜下BBB形态发生明显改变,内皮细胞间紧密连接被分开,血管周边星形胶质细胞足突明显水肿,AQP4免疫反应活性变微弱且呈间断分布,表明BBB受损时AQP4 也发生相应改变,AQP4是脑水肿发生的关键因素,且BBB与调控水流的AQP4关系密切.3.mdx和mdx3cv模型中BBB结构和AQP4表达的变化mdx模型模拟了人类Duchenne型肌营养不良症(DMD).此病为X性连锁隐性遗传性肌病,由于编码抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的DMD基因缺陷(缺失或突变),肌细胞内缺乏dystrophin,导致肌纤维膜细胞骨架功能缺失,产生对称性肌无力,肌萎缩为主要特征的临床症状【5】.近年来该病的细胞膜学说得到多数学者的认同,即肌细胞遗传性某种代谢缺陷使肌纤维膜结构和功能发生改变,因此细胞膜尤其是膜蛋白的研究成为DMD膜假说的重要手段.研究显示mdx小鼠4肌纤维膜上AQP4蛋白呈年龄相关性下调,1岁龄成年mdx小鼠较年龄相仿的野生型小鼠AQP4表达下调90%以上【6】,脑内AQP4的表达也呈现与年龄相关的下调,同时DMD患者的肌组织活检也显示AQP4表达下调的结果【7】,因此目前认为AQP4表达的改变涉及DMD的发病, mdx模型也因此被用于AQP4的研究.Nico等【2】研究显示dystrophin 表达缺陷的18-20个月龄的mdx 小鼠BBB形态改变明显,内皮细胞间紧密连接断裂,细胞旁及细胞间转运增加,血管周围星形胶质细胞水肿,AQP4表达下调,BBB渗透性增加,血管源性水肿形成.进1步研究显示BBB改变始于mdx小鼠出生前,即肌肉病理特征尚未表现时,表达于内皮细胞胞膜的细胞间紧密连接相关蛋白ZO-1下调并移位至胞浆,影响细胞间紧密连接的形成,GFAP(星形胶质细胞表面的1种标志物)下调,星形胶质细胞减少,AQP4表达也下调,血管渗透性增加【8】.mdx模型说明BBB完整性和星形胶质细胞调控水转运的作用密切相关,同时也说明脑内AQP4的定位有赖于dystrophin蛋白.脑内dystrophin蛋白包括DP140,DP71及长链dystrophin DP427,以DP71为主.由于mdx模型并不影响DP71表达,遂采用敲除DP71的mdx3cv模型进1步研究.mdx3cv模型中2月龄小鼠即出现AQP4表达下调,较mdx小鼠提前出现.免疫组化显示mdx3cv小鼠脑皮质血管周围的大量星形胶质细胞足突甚至没有AQP4染色,免疫金结果进1步明确显示肿胀的星形胶质细胞足突出现极少的AQP4金颗粒,且少量AQP4金颗粒移位至神经纤维周边的星形胶质细胞膜.AQP4在mdx3cv小鼠模型的表达改5变也说明DP71对其在脑内的准确,稳定定位起关键作用.4.AQP4与BBB完整性的关系DMD,颅脑机械损伤,神经系统损伤,化脓性脑病,颅脑肿瘤,永久性脑缺血或短暂性脑缺血再灌注损伤等病变多伴有BBB损伤,脑血管渗透性增加及血管源性水肿,而AQP4在其中的上调或下调表达不1【9,10,11,12】,以致难以明确AQP4上调或下调与水肿形成或消退的关系.AQP4上调是引起水肿的早期原因抑或是水肿发生后促进水肿液排出的反应,AQP4下调阻止了水肿液清除而致水肿抑或是AQP4下调是抑制水肿恶化的机体防御反应mdx,mdx3cv小鼠AQP4表达下调同时血管周边星形胶质细胞水肿【13】,说明生理情况下AQP4下调可能促进水肿形成.水中毒情况下, 敲除AQP4基因模型及mdx模型较野生型动物更易抑制脑水肿形成【13,14,15】,说明水中毒病理情况下AQP4下调可能抑制脑水肿形成.病理和生理情况下渗透梯度的改变或许可以解释AQP4此截然相反的作用.生理情况下,由于AQP4与内在整流性K+通道(Kir 4.1)共定位, 使脑实质内水及神经元放电活动释放出的K+被及时清除入血流,确保神经信号的正常传导和脑内环境的渗透平衡【13,16】,因此认为生理情况下水通过AQP4从脑实质流向血液,而AQP4缺乏或减少则阻碍水正常清除导致脑水肿.相反,在脑水平衡失调的病理情况下,脑内水从血流反向流入脑实质,AQP4上调则促进脑水肿形成,抑制其表达则抑制水肿形成.5. AQP4在星形胶质细胞-血管内皮细胞混合培养体系中的表达6细胞培养是胶质细胞-内皮细胞间相互作用体外研究的良好工具【17,18】.免疫荧光分析显示AQP4主要表达于星形胶质细胞离体培养系中的质膜,不同于在体脑内星形胶质细胞足突上的极化分布,提示BBB可能调控AQP4的分布【19】.大量研究已经证明星形胶质细胞和血管内皮细胞间具有相互调控作用【20,21,22】,而多数研究仅针对星形胶质细胞对内皮细胞的影响,为证实内皮细胞会影响星形胶质细胞单细胞培养系中AQP4的分布,研究者将小鼠脑毛细血管内皮细胞bEnd3平置于取自小鼠或大鼠的星形胶质细胞单细胞培养体系中,使两类细胞直接接触以混合培养.和bEnd3内皮细胞共培养7-14d后,星形胶质细胞和内皮细胞形态都发生明显改变.星形胶质细胞由扁平,单1的融合层转变成由延伸的多细胞柱和肥厚的足突构成的岛屿状,内皮细胞形成毛细血管样结构.而bEnd3内皮细胞单细胞系培养时并无上述改变,证明内皮细胞和星形胶质细胞间的确存在信息交流.免疫荧光分析技术进1步显示,与星形胶质细胞单细胞培养系相比,混合培养体系中AQP4免疫染色增强,且极化分布于靠近内皮细胞,GFAP阳性的星形胶质细胞足突,极少或没有表达于质膜或细胞内【23】,进1步从体外形象地说明内皮细胞是影响了AQP4在星形胶质细胞足突极化表达,同时从另1侧面说明AQP4表达与BBB发育相互关联.至于影响AQP4在混合培养体系中再分布的具体分子机制目前仍处于研究中. 综上所述, AQP4表达变化与BBB分化发育过程具有同步性,两者在调控脑内水平衡方面相互作用,相互影响.研究两者在调控脑内水平衡方面的具体关关系将有助于脑水肿的研究,必将为寻找脑水肿的7治疗手段开辟新途径.。

抗水通道蛋白抗体测定原理今天来聊聊抗水通道蛋白抗体测定原理的事儿吧。

你看啊，我们的身体就像一个超级复杂的城堡，里面各个部分有着不同的分工，细胞就像城堡里的一个个小房间。

而水通道蛋白呢，就像是小房间墙上特制的“水门”，它可以控制水在细胞内外的进出。

那要是这个“水门”出了毛病可不得了，有时候身体会针对这个出问题的“水门”产生一些“守卫”，这就是抗水通道蛋白抗体。

那我们怎么知道这些“守卫”的情况呢？这就涉及到抗水通道蛋白抗体测定原理了。

打个比方吧，这个测定过程有点像在城堡里找特定的“守卫”。

科学家们会准备一些特殊的“诱饵”，这个“诱饵”其实就是水通道蛋白或者是跟水通道蛋白相关的一些成分，这些诱饵就放在一个特定的“检测池”里。

然后我们从身体里取来可能含有抗水通道蛋白抗体的样本，像是血液之类的。

如果血液里有抗水通道蛋白抗体，它们就像是饥饿的野兽看到了食物，会和这些“诱饵”紧紧结合在一起。

说到这里，你可能会问，那怎么知道它们结合上了呢？这就需要一些特殊的标记啦。

就像给我们寻找的“野兽”身上做了个记号。

这个记号可能会发出某种信号，或是有特殊的颜色改变，这样我们就能轻松检测到结合的情况，从而知道抗水通道蛋白抗体的量是多少啦。

实际应用案例可不少呢。

在一些自身免疫性疾病的检查当中，这个抗水通道蛋白抗体测定就特别重要。

比如说在干燥综合征的诊断中，如果这个抗水通道蛋白抗体的值有异常，就可以成为医生判断病情的重要依据之一。

老实说，我一开始也不明白这么微妙的抗体怎么就能测定出来呢。

后来经过学习才知道，这里面还涉及到很多精细的化学和生物学知识。

过程中我也有困惑的地方，好比那些信号怎么就能那么精准地代表抗体和诱饵结合了呢？但随着不断深入学习，也就慢慢理解了。

这个检测原理它最大的实用价值在于能帮助医生早期发现疾病的一些线索，更早地做出诊断和进行干预。

延伸思考一下，随着科技的发展，这个测定原理会不会有更进一步的改进呢？会不会更简便、更精准呢？希望读者朋友们也能一起思考和讨论这个问题呀。

水通道蛋白质4
水通道蛋白4是一种小的完整膜蛋白，在大脑中强烈表达。

它在围绕脑血管系统的星形细胞尾足的近腔侧具有高度极化的表达，并且还在软膜下和室管膜下星形胶质细胞突起以及室管膜细胞的基底外侧膜上表达。

水通道蛋白4主要参与双向水通量，但也具有多种作用，例如Ca²⁺信号传导、K⁺缓冲、神经炎症和废物清除。

水通道蛋白4诱导的星形胶质细胞水运动已被证明是促进血管旁间隙清除如淀粉样蛋白β的驱动力。

来自英国利物浦大学的Adjanie Patabendige团队认为，在缺血性卒中的早期阶段使用水通道蛋白4抑制剂会导致癫痫发作，因为水通道蛋白4依赖性神经兴奋涉及脑细胞外液中的K⁺/水偶联，因此限制了水通道蛋白4调节剂在癫痫患者中的使用。

需要注意的是，水通道蛋白4的调节需要进一步的研究来更好地理解其潜在的分子机制，这将有利于开发减少细胞毒性水肿的有效治疗策略。

如果成功，可能会创造一个有利于神经保护和神经再生的环境，从而减少与缺血性卒中相关的神经损伤。

血清水通道蛋白4抗体检测在视神经脊髓炎患者中的应用价值目的：探讨血清水通道蛋白4（AQP-4）抗体检测在视神经脊髓炎患者中的应用价值。

方法：选取2016年8月-2017年8月本院收治的视神经脊髓炎患者84例为研究A组、多发性硬化患者84例为研究B组、体检正常人84例为对照组。

三组均进行血清AQP-4抗体水平检测。

比较三组AQP-4阳性率，比较研究组首发受累部位、不同性别患者AQP-4抗体阳性率。

结果：研究组AQP-4阳性率高于对照组，且研究A组高于研究B组，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；研究A组各首发受累部位例数均多于研究B组（P＜0.05）；女性AQP-4抗体阳性率高于男性（P＜0.05）。

结论：血清AQP-4抗体水平与视神经脊髓炎紧密相关，是区分神经脊髓炎与多发性硬化的重要物质，临床利用价值与推广价值较高。

視神经脊髓炎属于中枢神经系统疾病的一种，主要会对患者的脊髓、视神经造成一定的影响，其症状主要为有选择性地累及人体脊髓与神经，引发神经炎症与脊髓炎症，引发的病理因素主要是形成了坏死空洞、硬化斑、脱髓鞘等，同时伴有血管附近炎性细胞被浸润的现象[1]。

血清水通道蛋白4（AQP-4）抗体在视神经脊髓炎患者体内的水平较高，在大部分视神经脊髓炎患者体内均能检测到[2]。

AQP-4抗体的高度特异性为临床诊断视神经脊髓炎提供了一定的线索。

本院在视神经脊髓炎患者AQP-4抗体水平与临床特征的相关性研究过程中，发现患者病情越严重，AQP-4抗体水平越高，现报道如下。

1 资料与方法1.1 一般资料选取2016年8月-2017年8月本院收治的视神经脊髓炎患者84例为研究A组、多发性硬化患者84例为研究B组，本院体检正常人84例为对照组。

纳入标准：患者均符合其诊断标准，且为首次发病；临床资料均比较完整；研究对象均知晓同意此次研究。

排除标准：伴随有其他神经系统疾病的患者；有脊髓外伤、脑部手术史的患者；心肝肾功能不全的患者。

大鼠水通道蛋白4（AQP4）酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定大鼠血清，血浆及相关液体样本中水通道蛋白4（AQP4）的含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠水通道蛋白4（AQP4）水平。

用纯化的大鼠水通道蛋白4（AQP4）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入水通道蛋白4（AQP4），再与HRP标记的AQP4抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的水通道蛋白4（AQP4）呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠水通道蛋白4（AQP4）浓度。

样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清。

检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。

通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清。

保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5. 组织标本：切割标本后，称取重量。

加入一定量的PBS，PH7.4。

用液氮迅速冷冻保存备用。

标本融化后仍然保持2-8℃的温度。