薄层色谱和柱色谱分离法

加样
待洗脱剂即将流干时，立即沿柱内壁加入约10滴已配好的混合物。当此溶液即将全部浸 入吸附剂时，再用少量洗脱剂冲洗下沾在内壁上的有色物质，如此反复2~3次，至洗净 为止。
洗脱与分离，样品收集 加样完毕后，即可小心加入洗脱剂（注意一定要待有色物质全部吸附于吸附剂上之后才
可以加入大量的洗脱剂）。保持流出速度约1滴/s，随着洗脱剂的洗脱，可以明显看到层 析柱上出现两个色带。待第一各色带快流出时，换一干净接受瓶接收这一组分的样品（哪 一组分？）。
薄层色谱和柱色谱分离法
一、 实验目的
１．了解色谱分离的原理及其应用。
2．初步掌握薄层色谱和柱色谱的操作技能。
二、 实验原理
色谱法的基本原理是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（即分配）的不同， 使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组份分开。 流动的液体称为流动相，流动相可以是气体，也可以是液体；固定不动的物质称为固定相，可 以是固体也可以是液体（需吸附在支持剂上）。根据组分在固定相中的作用不同，分为吸附色 谱、分配色谱、离子交换色谱等。按操作条件可分为柱色谱、薄层色谱、纸色谱、气相色谱和 液相色谱等。
柱色谱是利用各组分在固定相上的吸附能力和流动相的解析能力不同，使混合物随流动相 流过固定相，发生反复多次的吸附和解析过程，从而使混合物各组分分离开。所用仪器为色谱 柱。纸色谱、气相色谱和液相色谱看教材。
薄层层析是一种微量、快速和简便的色谱方法。其分离原理是利用薄层板上的吸附剂在展 开剂中所具有的毛细作用，使样品混合物随展开剂向上爬升，由于各种组分在吸附剂上受吸附 的程度不同以及在展开剂中的溶解度的差异使其在爬升过程中得到分离。一种化合物在一定的 层析条件下，其上升高度与展开剂上市高度之比是一个定值，称为比移值。其大小只与化合物 本身的结构有关，即Rf值是化合物的物理常数，因此可以根据Rf值鉴别化合物。化合物的吸附 能力与它们的极性成正比，具有较大极性的化合物吸附较强，因此Rf值较小。
根据原点至斑点中心及展开剂前沿的距离，计算比移值（Ｒf）：
Rf = 溶质的最高浓度中心至原点中心的距离/溶剂前沿至原点中心的距离
薄层层析可适用小量样品（几到几十微克甚至0.01μg）的分离：也可用于多达５００mg样 品的分离，是近代有机化学中用于定性，定量的一种重要手段。
三、 仪器及试剂
硅胶薄板、展开缸、苏丹红乙醇溶液、间硝基苯胺乙醇溶液、苏丹红间硝基苯胺混合溶液、 乙酸乙酯：石油醚（5:95）
六、思考题
1. 展开和剂的高度超过点样线，对薄层色谱有什么影响？ 2. 为什么极性大的组分要用极性较大的溶剂洗脱？
（二）柱色谱分离法
柱色谱：也叫柱层析，将混合物的溶液通过装有吸附剂的层析柱，利用吸附剂对 各组分吸附能力的不同，经过洗脱剂的洗脱，将各组分分开的过程。
柱色谱的操作步骤： 装来自百度文库→ → 加样→ →洗脱和分离 → → 收集各组分
层析缸
层析板 试样点
展开剂
展开版
四、 操作要点和说明
１． 铺板 本实验直接使用购买的薄层硅胶板，每人一块
２． 点样 用毛细管点样，样点距玻璃板１cm，样点直径不超过２mm，三个样点间距５-６mm。
３． 展开 薄层色谱的展开，需要在展开缸中进行如图。展开方式采用倾斜上行法。
４． 计算Rf值 准确地找出原点，溶剂前沿以及三个样品展开后斑点的中心，分别测量溶剂前沿和样点 在薄层板上移动的距离（如图），求出其Ｒf值。
五、 说明及注意事项
１．本实验原理及某个广泛的用途可以详细介绍，例如，根据组份在固定相中的作用原理 不同，可分为吸附色谱，分配色谱，离子交换色谱等；根据操作条件不同，又可分为 柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱及高效液相色谱等。使学生以通过该实验对其 它方法也有一定认识。
２．本实验操作比较简单，需要的是有耐心、细心。 3． 点样时几个样点要在一条直线上，大小要合适（点样要快，保证斑点不大）。 4． 点样用的毛细管不能交叉使用。 5． 放板时手要平稳，否则走出斜线，实验失败。 6． 试样点一定要高于展开剂液面。 7． 实验完成后，展开缸盖好即可，不要水洗。
柱色谱分离示意图
本次柱色谱实验 样品：苏丹红和间硝基苯胺混合溶液混合物 10 滴，洗脱剂（流动相）：石油醚 : 乙 酸乙酯=95: 5（体积比）
湿法装柱
（1） 取色谱柱一根, 垂直装置，用锥形瓶作接收瓶。 （2） 关闭活塞，向柱中慢慢倒入洗脱剂和吸附剂，打开活塞，用吸耳球轻轻敲打柱身
下部，使其填装紧密，控制流速约1滴/s，装至3/4时停止加吸附剂。 （3） 待洗脱剂将干时，轻轻将滤纸放到吸附剂的上方。
思考题
层析柱中若有气泡或装填不均匀，将给分离造成什么样的结果？如何避免？