生化分析仪常用分析方法—课件
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了解生化分析仪基本参数的原理,有利于仪器、试剂的正确使用,有助于正确分析和处理测定数据。
但是,配套系统的原装分析参数不宜 更改;采用非仪器配套的试剂及校准品体系时,参数修改要慎重,对于不同仪器、不同类型的反应分析程序,所显示的人机对话分析参数 信息有所不同。
一、反应监测时间对于终点法来说,读取反应达到平衡时的吸光度计算样品中待测物的浓度。
对于连续监测法来说,要注意观察反应进程曲线,从而确定反 应的预孵育期,延迟时间、连续监测的时段。
对于一级或伪一级反应来说,连续监测的时间是一级反应的动态期的吸光度;对于基于零级 反应的酶催化活性浓度速率法测定,连续监测的是零级线性反应期的吸光度。
对于连续监测法来说,动态反应期的时间越长,越适用于临 床应用,对于以酶为工具的代谢物酶促动力测定法,要增加动态反应期,即延长反应达到平衡的时间,可在反应体系中加入竞争性抑制剂 ,这样还可以提高测定的线性范围,对于酶催化活性浓度连续监测法来说,一定要注意线性反应时间,有的酶,例如,以硫代丁酰胆碱为 底物的血清假性胆碱酯酶速率测定法,线性反应时间只有90秒。
对于连续监测法来说,在监测期至少应读4个点(3个△A)。
多数全自动生化分析仪可以在整个测定反应周期连续监测(如HITACHI 7170常规测定周期10分钟、监测34点,OLYMPUS AU 600固定周期8分15秒、监测27点),但反应监测时间是指该时间内的测定读数要用于结果计算。
它的设置与加样点、加试剂点( 包括R1、R2……)、监测时间(读数点)、读数间隔时间及试剂样品比例等有关,要结合方法学,兼顾权衡。
1.反应时间(Reaction Time) 指仪器的一个分析周期中,试剂和样品混合最末一点测定读数时间。
它对终点法尤其重要,是终点法的瓶颈。
有的仪器多个反应时间可选 L如Hl¡ªTACHI 7170),须预先选定。
多数仪器10分钟左右,这对试剂提出了较高要求。
生化分析仪常用分析方法共有三大类,分别为终点法、固定时间法和动力学法。
终点法:指经过一段时间的反应,反应达到平衡,由于反应的平衡常数很大,可认为全部底物(被测物)转变成产物,反应液的吸光度不再变化,只与被测物的浓度有关。
这类方法通常称为“终点”法,更确切地说应称“平衡”法。
单试剂单波长终点法:t1时刻加入试剂(体积为V),t2刻加入样本(体积为S),然后搅拌并反应,之后开始测量反应液的吸光度,在t3时刻反应达到终点,t3-t2为测定时间。
反应度R=At3-At2-1×V/(V+S),或R=At3-ARBLK。
其中:Ati为i时刻的吸光度,ARBLK为试剂空白吸光度。
单试剂双波长终点法:基本上同“单试剂单波长终点法”,只是对于每一个测定周期,其实际吸光度等于Aλ1-Aλ2。
双试剂单波长终点法:t1时刻加入第一试剂(体积为V1),t2时刻加入样本(体积为S)之后立即搅拌,t3时刻加入第二试剂(体积为V2)并立即搅拌,t4时刻反应达到终点。
t3-t2为孵育时间,t4-t3为测定时间。
在项目参数中,如果反应起始时间设为0,则反应度R=A时刻吸光度-双试剂空白吸光度。
如果反应起始时间小于0,则反应度R=At4 -双试剂空白吸光度-t3到t2间设定点的吸光度×(V1+S)/(V1+S+V2)。
双试剂双波长终点法:基本上同“双试剂单波长终点法”,只是对于每一个测定周期,其实际吸光度等于Aλ1-Aλ2。
固定时间法:又称为一级动力学法、二点动力学法等,指在一定的反应时间内,反应速度与底物浓度的一次方成正比,即v=k[S]。
由于底物在不断的消耗,因此整个反应速度在不断的减小,表现为吸光度的变化越来越小。
这类反应达到平衡的时间很长,理论上可以在任意时间段进行监测,但由于血清成份复杂,反应刚启动时反应较复杂,杂反应较多,必需经过一段延迟时间才能进入稳定反应期。
t1时刻加入试剂(体积为V),之后测量试剂空白的吸光度,t2时刻加入样本(体积为S),t3时刻反应稳定,t4时刻停止对反应进行监测;t2-t3为延迟时间,t3-t4为测定时间。