鸡源金黄色葡萄球菌耐药性分析王桂琴;邢智华;魏永智【摘要】采用药敏纸片扩散法,测定48株鸡源金黄色葡萄球菌对常用的19种抗菌药物的耐药性,检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA).结果表明:所有菌株除对万古霉素、头孢西丁和头孢唑啉100%敏感以外,对其他16种药物均产生不同程度的耐药性,其中耐药率较高的有四环素、强力霉素、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星及克林霉素,耐药率最低的为头孢噻肟、阿米卡星、复方新诺明及利福平.100%的菌株呈多重耐药,分离菌株最少耐受4种药物,最多耐受12种药物,未检测出耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌.【期刊名称】《农业科学研究》【年(卷),期】2011(032)001【总页数】4页(P43-45,49)【关键词】纸片扩散法;金黄色葡萄球菌;耐药性;耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)【作者】王桂琴;邢智华;魏永智【作者单位】宁夏大学农学院,宁夏,银川,750021;宁夏大学农学院,宁夏,银川,750021;银川市动物卫生监督所,宁夏,银川,750001【正文语种】中文【中图分类】Q935金黄色葡萄球菌是引起食物中毒的重要致病菌,也是造成人和动物感染的主要病原菌之一,可引起鼻腔、口腔黏膜以及皮肤和上皮组织感染,严重的可导致肺炎、败血症甚至死亡.根据对甲氧西林的耐药性,金黄色葡萄球菌被分成对甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌(MRSA)和对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA).青霉素的问世曾使金黄色葡萄球菌感染得到强有效的控制,但随之产生的对抗菌药物的耐药问题,尤其是MRSA的出现,对临床治疗提出了新的挑战.M RSA不但对甲氧西林耐药,而且通常对所有β-内酰胺类抗菌药物及其他多种抗菌药物耐药[1],导致临床可选用的药物非常有限,由金黄色葡萄球菌和MRSA引起的疾病和死亡大大增加[2].因此,开展对MRSA的检测,对于控制其感染流行,指导临床治疗有十分重要的意义.本实验对宁夏某鸡场金黄色葡萄球菌进行分离、鉴定,并对分离出的48株金黄色葡萄球菌进行药物敏感性测定及MRSA检测,分析其对19种常用抗菌药物的耐药率和耐药谱,以期为临床合理用药提供参考,并为耐药机制研究提供必要的实验依据.1 实验1.1 材料金黄色葡萄球菌质控菌株ATCC25923由宁夏大学农学院药理实验室提供;高盐甘露醇培养基、M-H琼脂培养基和葡萄球菌属细菌生化鉴定管均购自杭州天和微生物试剂有限公司;M-H肉汤培养基购自北京奥博星生物技术有限公司;药敏纸片:青霉素(10 IU/片)、氨苄西林(10μg/片)、头孢唑啉(30μg/片)、头孢西丁(30μg/片)、环丙沙星(5μg/片)、氧氟沙星(5μg/片)、诺氟沙星(10μg/片)、红霉素(15μg/片)、克林霉素(2μg/片)、庆大霉素(10μg/片)、阿米卡星(30μg/片)、四环素(30μg/片)、氯霉素(30μg/片)、万古霉素(30μg/片)、头孢噻肟(30μg/片)、利福平(30μg/片)、卡那霉素(30μg/片)、强力霉素(30μg/片)、复方新诺明(1.25μg/片)、苯唑西林(1μg/片),购自中国北京天坛药品与生物制品股份有限公司.1.2 方法1.2.1 金黄色葡萄球菌的分离、鉴定将采集的鸡鼻拭子涂于高盐甘露醇培养基上,37℃培养24 h后观察其菌落形态特征,挑取黄色的较小菌落于肉汤培养液中培养24 h后进行生化鉴定.生化鉴定按照杭州天和微生物试剂有限公司葡萄球菌属生化鉴定管使用说明操作及判定结果.1.2.2 金黄色葡萄球菌体外抑菌实验按WHO推荐的纸片法[3]进行,使用ATCC25923作为质控菌.实验结果判定标准按照美国临床检验标准委员会制定的标准(CLSI,即NCCLS的2005年版本)执行,分别以敏感、中介、耐药3种形式记录结果,最后对数据进行统计、处理.1.2.3 MRSA菌株的检测1 )培养基的准备.在M-H琼脂培养基中加入质量浓度为40 g/L的氯化钠,调节pH 值,置于121℃灭菌20min.待培养基的温度降到50℃时倾注于培养皿中,使琼脂平板的厚度达到4mm.2 )实验方法.用无菌棉签蘸取稀释菌液,涂布整个M-H琼脂-氯化钠培养基表面,反复几次,保证涂布均匀.待平板上的水分被琼脂完全吸收后再贴苯唑西林药敏片,置于37℃培养16～24 h.3 )MRSA表型检测的判定标准.苯唑西林的含量为1μg/片,如抑菌环≤10mm为耐药,≥13mm为敏感,11～12mm为中介耐药.2 结果与分析2.1 实验结果本次实验共采集812份鼻腔拭子,经过生化实验,共鉴定出48株金黄色葡萄球菌,细菌分离率为6%.2.2 金黄色葡萄球菌对19种抗菌药物的敏感性48株金黄色葡萄球菌对临床常用的19种抗菌药物的耐药率见表1.分离菌对万古霉素、头孢唑啉及头孢西丁的敏感性都达到100%,对阿米卡星、复方新诺明、利福平的敏感性都在90%以上.而对庆大霉素、卡那霉素的耐药率在55%以上,对青霉素、氨苄西林、氯霉素的耐药率也达到75%以上.耐药率最高的是四环素、强力霉素、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星及克林霉素.2.3 金黄色葡萄球菌多重耐药分析此次临床分离的金黄色葡萄球菌多药耐药情况严重,无对19种药物都敏感的菌株和单药耐药菌株.其中4耐的菌株只有1株,9耐菌株所占比例最大,占所有菌株的20.83%,其次为10耐、7耐及11耐的菌株,所占比例分别为 18.75%、16.67%、14.58%.所有分离菌株最多达到12耐,最少4耐,多药耐药情况见图1.7耐以上的菌株占90%,若同时耐3种药物即可归为多药耐药,那么48株金黄色葡萄球菌的多药耐药率为100%.表1 48株金黄色葡萄球菌对19种抗菌药物的耐药率药物名称耐药菌株数中介菌株数敏感菌株数耐药率/%敏感率/%青霉素 36 0 12 75.00 25.00氨苄西林 37 0 11 77.08 22.92头孢唑啉 0 0 48 0 100.00头孢西丁 0 0 48 0 100.00头孢噻肟 0 5 43 10.42 89.58万古霉素 0 0 48 0 100.00庆大霉素 15 12 21 56.25 43.75卡那霉素 28 0 20 58.33 41.67阿米卡星 1 1 46 4.17 95.83红霉素 46 2 0 100.00 0四环素 46 1 1 97.92 2.08强力霉素 45 1 2 95.83 4.17环丙沙星 46 1 1 97.92 2.08氧氟沙星 33 14 1 97.92 2.08诺氟沙星 47 0 1 97.92 2.08克林霉素 36 11 1 97.92 2.08复方新诺明 0 1 47 2.08 97.92氯霉素 16 20 10 75.00 25.00利福平0 1 47 2.08 97.92图1 鸡源金黄色葡萄球菌对19种抗菌药物的多药耐药情况2.4 MRSA耐药表型鉴定结果采用纸片扩散法对48株金黄色葡萄球菌进行MRSA检测,以CLSI标准判读,本次实验未筛选出耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌.3 结论与讨论3.1 结论1 )48株金黄色葡萄球菌对万古霉素、头孢西丁和头孢唑啉100%敏感,对阿米卡星、复方新诺明、利福平的敏感率也都在90%以上.而对青霉素、氨苄西林、氯霉素的耐药率较高,对四环素、强力霉素、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星及克林霉素耐药率最高.2 )此次临床分离的金黄色葡萄球菌多药耐药情况严重,无对19种药物都敏感的菌株和单药耐药菌株,所有分离菌株最多达到12耐,最少4耐.48株金黄色葡萄球菌的多药耐药率为100%.3 )本次实验未筛选出耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌.3.2 讨论1 )随着抗菌药物的广泛使用,尤其是在畜牧养殖业中,大量抗菌药物被用于治疗感染疾病和为促进动物生长而添加于饲料当中,使得临床中病原菌的耐药现象也日趋严重.在不同国家均有金黄色葡萄球菌耐药菌株的报道,尤其对大环内酯类、四环素类、β-内酰胺类抗菌药物耐药现象最为严重[4],而这些药物是治疗金黄色葡萄球菌感染的传统有效药物.本次实验结果也表明,从临床分离的金黄色葡萄球菌对以上药物均表现出严重的耐药性,这就提醒我们在使用抗生素时要加强对用药的管理.2 )青霉素类和头孢菌素类均属于β-内酰胺类抗生素,本次实验选用的青霉素类药为青霉素和氨苄西林.其中对青霉素产生耐药的有36株菌,占总菌株数的75%,对氨苄西林产生耐药的菌株数为37株,占总菌株数的77.08%.这与关文锦[5]报道的金黄色葡萄球菌对青霉素和氨苄西林的耐药率分别为80.6%和82%接近.实验菌株对头孢类药物的耐药率如下:对头孢唑啉和头孢西丁的敏感率均为100%,对头孢噻肟的耐药率为10.42%.这是由于第1代头孢类药物(头孢唑啉),它们对革兰阳性菌具有良好的抗菌作用,对革兰阴性菌的作用稍差;第2代头孢(头孢西丁)的抗菌谱比1代头孢广些,对革兰阳性菌的作用与1代头孢大致相当,而对革兰阴性菌的抗菌范围比1代头孢广,抗菌作用也强;3代头孢(头孢噻肟)主要是对革兰阴性菌有很强的杀菌作用,但对革兰阳性菌的作用却不如一二代头孢.这和本次实验结果是一致的.3 )本次实验结果显示,菌株对庆大霉素耐药率为56.25%,该结果与孙民等[6]报道的金黄色葡萄球菌对庆大霉素的耐药率为47.4%比较接近;菌株对阿米卡星的耐药率为4.17%,这与王冰等[7]人报道的牛性金黄色葡萄球菌对该药物的耐药率为20.8%有一定出入,这可能是由于动物异源性和临床用药差异造成的.4 )本次实验中对环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星的耐药率均达到90%以上,这与杜锐等[8]的研究结果有较大差距.这可能是因为宁夏在鸡的疾病治疗中,氟喹诺酮类药物使用得较频繁,导致这类药物的耐药率明显高于其他地区.5 )本次实验中,金黄色葡萄球菌对红霉素产生了很强的耐药性,耐药率高达100%,这与陈林等[9]报道的金黄色葡萄球菌对大环内酯类药物红霉素的耐药率为93.9%的结果十分接近.6 )PCR法可直接检测 mecA基因来确定菌株是否为MRSA,不受药敏实验条件的影响,而特异性高,被公认为是MRSA检测的金标准.但此方法需进行细菌 DNA提取、基因扩增及凝胶电泳等多个步骤,用时相对较长且需要一些仪器设备.一般临床实验室不用于常规检测.琼脂筛选法作为美国临床实验室标准化委员会(CLSI)推荐鉴定M RSA的常用方法,检测的是MRSA的表现型,也有较高的灵敏度和特异性.但在实验中常受培养基成分、细菌接种量、孵育温度和时间等多种因素的影响,致使其结果特异性低于其他方法,存在部分漏检情况.参考文献:【相关文献】[1]欧阳范献.M RSA的SCCmec分子分型及其耐药性研究[D].海南:华南热带农业大学,2007.[2]黄怡.细菌耐药机制的研究现状[J].国外医学徽生物学分册,2000,23(1):24-26.[3]戴自英.临床抗菌药物学[M].北京:人民卫生出版社,1995.[4]沈建忠,谢联金.兽医药理学[M].北京:中国农业大学出版社,2000.[5]关文锦.355株金黄色葡萄球菌药敏试验结果分析[J].现代医药卫生,2009(2):182-183.[6]孙民,吴玲,范冬耀,等.1 069株葡萄球菌耐药状况分析[J].中国医学检验杂志,2006,7(4):258-260.[7]王冰,刘明春,吴聪明,等.呼和浩特地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的耐药性调查[J].中国兽医杂志,2007, 43(3):30-32.[8]杜锐,韩文瑜,雷连成.动物源性金黄色葡萄球菌耐药性的检测[J].中国兽医科技,2005,35(3):230-232.[9]陈林,王其南,刘鸿渝,等.重庆地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的研究[J].中华传染病杂志,1993,11 (4):210.。
