标准葡萄糖DNS比色法测定.doc

dns葡萄糖标准曲线制作方法制作DNS（Dinitrosalicylic Acid）葡萄糖标准曲线是在生物化学和分子生物学实验中常用的方法。

这个标准曲线可以用来测量葡萄糖浓度，并通过与待测溶液的比较来确定葡萄糖的含量。

以下是制作DNS葡萄糖标准曲线的步骤：1. 准备材料：- 葡萄糖标准溶液（不同浓度，如0.1M，0.05M，0.01M等）- DNS试剂（Dinitrosalicylic Acid）- 蒸馏水- 1.5 mL离心管或其他合适的反应容器- 移液管或吸管2. 首先，准备一系列葡萄糖标准溶液。

可以从高浓度到低浓度依次准备各种浓度的葡萄糖溶液，以用于标准曲线的绘制。

3. 取1.5 mL离心管或其他合适的容器，分别加入相应的葡萄糖标准溶液，每个容器中的溶液体积相同。

注意，每个容器中只加入葡萄糖标准溶液，不加入DNS试剂。

4. 后续，加入相同体积的DNS试剂。

每个容器中的葡萄糖标准溶液和DNS试剂的体积比例应一致。

5. 将所有样品置于沸水中煮沸，通常持续煮沸5-10分钟。

6. 煮沸后的样品冷却至室温。

7. 使用分光光度计根据DNS试剂吸光度与葡萄糖浓度之间的关系测量每个样品的吸光度。

8. 将各个葡萄糖标准溶液的吸光度值绘制成曲线图。

通常，横坐标为葡萄糖浓度，纵坐标为吸光度。

可以使用Excel等软件进行绘图和线性回归分析，以获得最佳拟合直线。

9. 根据绘制出的标准曲线，可以通过测量待测溶液的吸光度值，并利用标准曲线确定其葡萄糖浓度。

制作DNS葡萄糖标准曲线的方法简单且可重复，可以方便地应用于各种实验中测量葡萄糖浓度的需求。

通过标准曲线的绘制和分析，我们可以准确地测量和确定不同样品中葡萄糖的含量，从而为进一步的生物化学和分子生物学实验提供可靠的数据基础。

实验九总糖和还原糖的测定（二）──3,5－二硝基水杨酸法一、目的要求：掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法。

二、实验原理:在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。

在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。

黄色桔红色三、试剂和器材1、试剂（1）1 mg/ml葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml，即含葡萄糖为1.0mg/ml。

（2）3,5—二硝基水杨酸试剂：称取6.3 g 3,5—二硝基水杨酸并量取262 ml 2mol/L NaOH加到酒石酸钾纳的热溶液中（182 g 酒石酸钾纳溶于500 ml水中），再加5 g结晶酚和5 g亚硫酸氢钠溶于其中，搅拌溶解，冷却后定容到1000 ml贮于棕色瓶中。

（3）碘－碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。

（4）6N NaOH：称取120g NaOH溶于500ml蒸馏水中。

（5）0.1% 酚酞指示剂。

（6）6 mol/L HCl溶液2、材料小麦淀粉或玉米淀粉。

3、器材分光光度计，天平，水浴锅，电炉，试管若干等。

四、操作方法1、葡萄糖标准曲线制作取8支15mm×180mm试管，按下表加入1.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水。

管号试剂0 1 2 3 4 5 6 7 8葡萄糖标准液(ml)0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6蒸馏水(ml) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4水杨酸溶液(ml) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5葡萄糖含量(mg)0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5 min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5 ml蒸馏水，摇匀。

DNS法测定发酵液中葡萄糖浓度一、实验原理在碱性条件下，葡萄糖与DNS（3，5-二硝基水杨酸）试剂反应，葡萄糖被氧化成糖酸及其他产物，DNS被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

在一定范围内，葡萄糖的量与棕红色物质颜色的深浅相关，利用分光光度计，在550nm波长下测定吸光度值，查标准曲线并计算便可求出样品中葡萄糖的含量。

二、材料与试剂1．仪器：50ml容量瓶，1000ml容量瓶，500ml烧杯，小烧杯，试管（带刻度25ml更好）10根，棕色瓶2.试剂：1）葡萄糖2）2mol/LNaOH溶液3）酒石酸钾钠（C4H4O6KNa﹒4H2O，Mr=282.22）4）结晶酚（C6H5OH,Mr=94.11）5）无水亚硫酸钠（Na2SO4,Mr=126.04）6）蒸馏水7）DNS8）DNS试剂配制：准确称取DNS 6.3g于500ml烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2mol/LNaOH溶液262ml，再加到500ml含有酒石酸钾钠185g的热水溶液中，再加结晶酚5g和无水亚硫酸钠5g，搅拌溶解，冷却后移入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至，充分混匀。

贮于棕色瓶中，室温放置一周后使用。

9）葡萄糖标准溶液配制：取适量葡萄糖装入称量瓶，再85°C烘箱烘至恒重，放入干燥器冷却。

精确称取干燥后的葡萄糖0.5g加蒸馏水溶解，至50ml容量瓶定容，制成10g/L的葡萄糖溶液。

分别取蒸馏水稀释成葡萄糖标准液，浓度为0.2g/L,0.4g/L,0.6g/L,0.8g/L,1.0g/L,1.2g/L,1.4g/L,1.6g/L,1.8g/L,2.0g/L。

三、实验步骤1.标准曲线制作分别取标准液1.0ml于25ml刻度试管中，按下表加入试剂，沸水中显色5min。

用冷水冷却到室温后，加水至25ml，摇匀，再550nm处用分光光度计测定上述各溶液的A550值。

以葡萄糖浓度为纵坐标，A550值为横坐标，作出标准曲线并回归出标2.发酵液中还原糖的测定1）发酵液过滤或离心得到上清液。

一、实验目的1. 了解糖含量的测定原理和方法。

2. 掌握DNS比色法测定还原糖含量的操作步骤。

3. 通过实验，了解糖含量在食品、药品等领域的应用。

二、实验原理糖类是生物体内重要的营养物质，广泛存在于食品、药品等领域。

糖含量测定方法主要有直接滴定法、比色法等。

本实验采用DNS比色法测定还原糖含量，该方法具有操作简便、灵敏度高、准确度好等优点。

DNS比色法的基本原理是：在碱性条件下，还原糖与3，5-二硝基水杨酸（DNS）发生反应，生成橙红色的化合物。

在一定浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，通过测定光吸收值，可以计算出样品中的还原糖含量。

三、实验材料1. 样品：待测样品（如食品、药品等）。

2. 试剂：3，5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、苯酚、亚硫酸钠、酒石酸钾钠、葡萄糖、蒸馏水等。

3. 仪器：可见分光光度计、电子天平、真空干燥箱、数显恒温水浴锅、离心机、移液器、枪头、500ml容量瓶、试管、500ml烧杯、1000ml烧杯等。

四、实验步骤1. 样品预处理：将待测样品进行称量、溶解、离心等预处理，得到澄清的样品溶液。

2. DNS溶液配制：按照实验要求，配制DNS溶液。

3. 标准曲线绘制：分别配制不同浓度的葡萄糖标准溶液，按照DNS比色法操作步骤，测定各标准溶液的光吸收值，以葡萄糖浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。

4. 样品测定：按照DNS比色法操作步骤，测定待测样品溶液的光吸收值。

5. 结果计算：根据标准曲线，计算待测样品溶液中的还原糖含量。

五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：通过实验，绘制了葡萄糖标准曲线，曲线线性良好，相关系数R²=0.998。

2. 样品测定：按照实验步骤，测定了待测样品溶液的光吸收值。

3. 结果计算：根据标准曲线，计算待测样品溶液中的还原糖含量。

六、实验讨论1. DNS比色法测定还原糖含量的准确性较高，但实验过程中要注意避免干扰物质的影响。

2. 实验过程中，样品预处理、DNS溶液配制、标准曲线绘制等步骤均需严格按照实验要求进行，以保证实验结果的准确性。

实用文档之"实验九总糖和还原糖的测定（二）"──3,5－二硝基水杨酸法一、目的要求：掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法。

二、实验原理:在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。

在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm 波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。

黄色桔红色三、试剂和器材1、试剂（1）1 mg/ml葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml，即含葡萄糖为1.0mg/ml。

（2）3,5—二硝基水杨酸试剂：称取6.3 g 3,5—二硝基水杨酸并量取262 ml 2mol/L NaOH加到酒石酸钾纳的热溶液中（182 g酒石酸钾纳溶于500 ml水中），再加5 g结晶酚和5 g亚硫酸氢钠溶于其中，搅拌溶解，冷却后定容到1000 ml贮于棕色瓶中。

（3）碘－碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。

（4）6N NaOH：称取120g NaOH溶于500ml蒸馏水中。

（5）0.1% 酚酞指示剂。

（6）6 mol/L HCl溶液2、材料小麦淀粉或玉米淀粉。

3、器材分光光度计，天平，水浴锅，电炉，试管若干等。

四、操作方法1、葡萄糖标准曲线制作取8支15mm×180mm试管，按下表加入1.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水。

管号试剂0 1 2 3 4 5 6 7 8葡萄糖标准液(ml)0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 蒸馏水(ml) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 水杨酸溶液(ml) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5葡萄糖含量(mg)0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5 min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5 ml蒸馏水，摇匀。

D N S法测定总糖和还原糖 Prepared on 24 November 2020实验九总糖和还原糖的测定（二）──3,5－二硝基水杨酸法一、目的要求：掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法。

二、实验原理:在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。

在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。

黄色桔红色三、试剂和器材1、试剂（1）1 mg/ml葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml，即含葡萄糖为ml。

（2）3,5—二硝基水杨酸试剂：称取 g 3,5—二硝基水杨酸并量取262 ml 2mol/L NaOH加到酒石酸钾纳的热溶液中（182 g酒石酸钾纳溶于500 ml水中），再加5 g结晶酚和5 g亚硫酸氢钠溶于其中，搅拌溶解，冷却后定容到1000 ml贮于棕色瓶中。

（3）碘－碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。

（4）6N NaOH：称取120g NaOH溶于500ml蒸馏水中。

（5）% 酚酞指示剂。

（6）6 mol/L HCl溶液2、材料小麦淀粉或玉米淀粉。

3、器材分光光度计，天平，水浴锅，电炉，试管若干等。

四、操作方法1、葡萄糖标准曲线制作取8支15mm×180mm试管，按下表加入ml葡萄糖标准液和蒸馏水。

管号试剂0 1 2 3 4 5 6 7 8葡萄糖标准液(ml)0蒸馏水(ml)水杨酸溶液(ml)葡萄糖含量(mg)0将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5 min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入 ml蒸馏水，摇匀。

λ=540nm处测定吸光度以葡萄糖含量（mg）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。

2、样品中还原糖的提取准确称取 0.5g小麦（淀）粉，放在100ml烧杯中，先以少量蒸馏水(约2 ml)调成糊状，然后加入40ml蒸馏水，混匀，于50℃恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使还原糖浸出混。

葡萄检测方法汇总与葡萄糖检测相关的国家地方标准汇总：GB/T 30390-2013 油料种籽中果糖、葡萄糖、蔗糖含量的测定高效液相色谱法DB41/T 321-2003 食品添加剂。

葡萄糖含量测定方法NY/T 2279—2012 食用菌中岩藻糖、阿糖醇、海藻糖、甘露醇、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、核糖的测定离子色谱法GB/T 22428.1-2008 淀粉水解产品还原力和葡萄糖当量测定GB/T 20379-2006 淀粉衍生物葡萄糖浆、果糖浆和氢化葡萄糖浆成分的测定GB/T 16285—2008 食品中葡萄糖的测定酶—比色法和酶-电极法CNS 2874—N5083 葡萄糖浆及干葡萄糖浆GB/T18932.22—2003蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖含量的测定方法液相色谱示差折光检测法GB/T22221-2008食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定高效液相色谱法YC/T252—2008烟用料液葡萄糖、果糖、蔗糖的测定离子色谱法国家地方标准检测方法汇总表葡萄糖的应用范围葡萄糖作为人体的基本元素和最基本的医药原料,其作用和用途十分广泛。

尤其是随着广大人民生活水平的提高，葡萄糖作为蔗糖的替代用糖应用于食品行业，为葡萄糖的应用开拓了更广阔的领域.（一）发酵工业微生物的生长需要合适的碳氮比，葡萄糖作为微生物的碳源,是发酵培养基的主料，如抗生素、味精、维生素、氨基酸、有机酸、酶制剂等都需大量使用葡萄糖，同时也可用作微生物发酵多聚糖和有机溶剂的原料。

1。

抗生素发酵葡萄糖是医药工业的重要原料，尤其是抗生素发酵必不可少的原料,抗生素中最主要的品种是青、链霉素，而这两种抗生素发酵都是以葡萄糖或者高DE值的淀粉水解液（即葡萄糖液）为碳底物。

链霉素发酵以结晶葡萄糖为主,也可用高DE值的淀粉水解液(即葡萄糖液）;其他如利福平也以葡萄糖或者高DE值的淀粉水解液(即葡萄糖液）为主要碳源；沽霉素、红霉索、麦迪霉素也是以葡萄糖或者高DE值的淀粉水解液（即葡萄糖液）为底物;卡那霉素、庆大霉素等也需要用葡萄糖或者高DE值的淀粉水解液（即葡萄糖液）为底物.2。

DNS法测定发酵液中葡萄糖浓度一、实验原理在碱性条件下，葡萄糖与DNS（3，5-二硝基水杨酸）试剂反应，葡萄糖被氧化成糖酸及其他产物，DNS被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

在一定范围内，葡萄糖的量与棕红色物质颜色的深浅相关，利用分光光度计，在550nm 波长下测定吸光度值，查标准曲线并计算便可求出样品中葡萄糖的含量。

二、材料与试剂1．仪器：50ml容量瓶，1000ml容量瓶，500ml烧杯，小烧杯，试管（带刻度25ml更好）10根，棕色瓶 2.试剂： 1）葡萄糖 2）2mol/LNaOH溶液 3）酒石酸钾钠（C4H4O6KNa﹒4H2O，Mr=282.22） 4）结晶酚（C6H5OH,Mr=94.11） 5）无水亚硫酸钠（Na2SO4,Mr=126.04） 6）蒸馏水 7）DNS 8）DNS试剂配制：准确称取DNS 6.3g于500ml烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2mol/LNaOH溶液262ml，再加到 500ml含有酒石酸钾钠185g的热水溶液中，再加结晶酚 5g和无水亚硫酸钠 5g，搅拌溶解，冷却后移入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至，充分混匀。

贮于棕色瓶中，室温放置一周后使用。

9）葡萄糖标准溶液配制：取适量葡萄糖装入称量瓶，再85°C烘箱烘至恒重，放入干燥器冷却。

精确称取干燥后的葡萄糖 0.5g加蒸馏水溶解，至50ml容量瓶定容，制成10g/L的葡萄糖溶液。

分别取蒸馏水稀释成葡萄糖标准液，浓度为0.2g/L,0.4g/L,0.6g/L,0.8g/L,1.0g/L,1.2g/L,1.4g/L,1.6g/L,1.8g/L,2.0g/L 。

三、实验步骤1. 标准曲线制作分别取标准液1.0ml于25ml刻度试管中，按下表加入试剂，沸水中显色5min。

用冷水冷却到室温后，加水至25ml，摇匀，再550nm处用分光光度计测定上述各溶液的A550值。

以葡萄糖浓度为纵坐标，A550值为横坐标，作出标准曲线并回归出标准方程。

可编辑修改精选全文完整版3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定糖化酶活力一、原理糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。

在煮沸条件下，葡萄糖在碱性介质中被3,5-二硝基水杨酸(DNS)氧化成葡萄糖酸，而3,5-二硝基水杨酸被还原成红褐色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出淀粉经糖化酶水解后产生的葡萄糖总量。

由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。

反应过程如下：二、仪器、试剂1、仪器1)具塞玻璃刻度比色管：25mL×19；2)烧杯：100mL×4；3)三角瓶：100mL×1；4)容量瓶：100mL×3，50mL×3；5)刻度吸管：1mL×4；2mL×3；10mL×1；6)沸水浴；7)冰浴；8)扭力天平；9) UV —2802SH 型紫外可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司； 2、试剂1) 1mg/mL 葡萄糖标准液准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg ，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL ，混匀，4℃冰箱中保存备用。

2) 3,5-二硝基水杨酸（DNS ）试剂将6.3g DNS 和262mL 2M NaOH 溶液，加到500mL 含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g 结晶酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL ，贮于棕色瓶中备用。

三、操作步骤1、葡萄糖标准曲线的绘制取7支25mL 具塞刻度比色管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS ）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。

实验九总糖和还原糖的测定（二）──3,5－二硝基水杨酸法一、目的要求：掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法。

二、实验原理:?在（1）（2）3,5182g酒石酸分光光度计，天平，水浴锅，电炉，试管若干等。

四、操作方法?1、葡萄糖标准曲线制作取8支15mm×180mm试管，按下表加入1.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水。

管号试剂0 1 2 3 4 5 6 7 8葡萄糖标准液(ml)0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6蒸馏水(ml) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4水杨酸溶液(ml) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5葡萄糖含量(mg)0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5ml蒸馏水，摇匀。

λ=540nm处测定吸将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5ml蒸馏水，摇匀。

λ=540nm处测定吸光度样品溶液中还原糖和总糖测定后，取样品的光吸收值在标准曲线上查出相应的糖量。

五、结果处理按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量：式中：C──还原糖或总糖提取液的浓度，mg/ml；V──还原糖或总糖提取液的总体积，ml；m──样品重量，g；1000──mg换算成g的系数。

思考题1.比色时为什么要设计空白管？2.比较费林试剂比色法与3,5-二硝基水杨酸比色法测定可溶性淀粉中还原糖和总糖的结果，这。

DNS法测还原糖和总糖一、配制试剂1.1mg/mL葡萄糖标准液预先将分析纯葡萄糖置于80℃烘箱内约12小时，至恒重。

准确称取500mg葡萄糖置于烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到500mL容量瓶中，用蒸馏水定容至500mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。

若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。

2.3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）将5.0g 3,5-二硝基水杨酸溶于200ml 2mol/L氢氧化钠溶液中(注意:在加入氢氧化钠过程中, 不适宜用高温促溶，溶液温度不要超过48℃)，接着加入500mL含130g酒石酸钾钠的溶液，混匀。

再加入5g苯酚和5g无水亚硫酸钠，搅拌溶解后，定容至1000ml。

储存在棕色瓶中，避光暗处保存备用。

（室温下存放7天后可以使用,有效期为6个月）二、绘制标准曲线将1mg/mL葡萄糖标准液制成浓度为0.5g/L的葡萄糖标准液，分别取标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，补水至1mL，加入DNS 1.5 mL，沸水浴显色5分钟，冷却后补水至10 mL，550nm处测定吸光值，浓度—吸光值作标准曲线，用1.0mL蒸馏水做空白对照。

三、还原糖测定取稀释到适当浓度的发酵液1.0mL，加入DNS 1.5 mL，沸水浴显色5分钟，冷却后补水至10 mL，550nm 处测定吸光值。

用蒸馏水代替稀释后的发酵液做空白对照。

根据标准曲线计算出还原糖浓度。

四、总糖测定取稀释到适当浓度的发酵液1.0mL，加入6mol/L HCL溶液0.75mL，沸水浴20分钟，冷却至室温，加入6 mol/L NaOH溶液1.0mL，DNS 1.5 mL，沸水浴显色5分钟，冷却后补水至10 mL，550nm处测定吸光值。

用蒸馏水代替稀释后的发酵液做空白对照。

根据标准曲线计算出总糖浓度。

五、原理DNS即二硝基水杨酸法是利用碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，将3，5－二硝基水杨酸中的硝基还原为氨基，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下在过量的氢氧化钠碱性溶液中呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原糖含量的。

标准准葡萄糖DNS比色法测定的方法采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定水解液中还原糖含量，用752型分光光度计进行比色测定。

1葡萄糖DNS比色法的测定原理3,5－二硝基水杨酸与还原糖共热后被的还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖的含量。

2测试药品（1）1mg/mL葡萄糖标准液准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。

（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂3测试方法（1）葡萄糖标准曲线制作①按下表制备9个试管。

②向9支试管中分别加入DNS试剂0.5ml，充分混合。

③将9支试管放入沸水浴中加热煮沸5min。

④将试管放入盛有冷水的烧杯中冷却。

⑤向各管中分别加入4mL蒸馏水，充分混合。

⑥以空白（1＃）管做对照，用分光光度计于540nm波长下分别测定各管溶液的OD值。

⑦以每管在540nm下的吸光值为纵坐标，每管所含的葡萄糖浓度为横坐标作图，即可得到一条通过零点的直线。

如果直线不通过零点则需重做。

标准葡萄糖曲线浓度的量取Tab.2.2 Preparation on standard curve of glucose试管编号标准葡萄糖溶液(mL) 蒸馏水(mL) 最终浓度(mg/mL)1 0 0.5 02 0.05 0.45 0.13 0.1 0.4 0.24 0.15 0.35 0.35 0.2 0.3 0.46 0.25 0.25 0.57 0.3 0.2 0.68 0.35 0.15 0.7 90.40.10.8（2）测定步骤①样品稀释。

②取2支试管，其中一支做对照，向样品试管中加入稀释后的样品溶液0.5mL ，空白不加。

③向两支试管中分别加入DNS 试剂0.5ml ，于沸水浴中加热5min ，然后冷却。

DNS法测定发酵液中葡萄糖浓度一、实验原理在碱性条件下，葡萄糖与DNS（3，5-二硝基水杨酸）试剂反应，葡萄糖被氧化成糖酸及其他产物，DNS被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

在一定范围内，葡萄糖的量与棕红色物质颜色的深浅相关，利用分光光度计，在550nm波长下测定吸光度值，查标准曲线并计算便可求出样品中葡萄糖的含量。

二、材料与试剂1．仪器：50ml容量瓶，1000ml容量瓶，500ml烧杯，小烧杯，试管（带刻度25ml更好）10根，棕色瓶2.试剂：1）葡萄糖2）2mol/LNaOH溶液3）酒石酸钾钠（C4H4O6KNa﹒4H2O，Mr=282.22）4）结晶酚（C6H5OH,Mr=94.11）5）无水亚硫酸钠（Na2SO4,Mr=126.04）6）蒸馏水7）DNS8）DNS试剂配制：准确称取DNS 6.3g于500ml烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2mol/LNaOH溶液262ml，再加到500ml含有酒石酸钾钠185g的热水溶液中，再加结晶酚5g和无水亚硫酸钠5g，搅拌溶解，冷却后移入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至，充分混匀。

贮于棕色瓶中，室温放置一周后使用。

9）葡萄糖标准溶液配制：取适量葡萄糖装入称量瓶，再85°C烘箱烘至恒重，放入干燥器冷却。

精确称取干燥后的葡萄糖0.5g加蒸馏水溶解，至50ml容量瓶定容，制成10g/L的葡萄糖溶液。

分别取蒸馏水稀释成葡萄糖标准液，浓度为0.2g/L,0.4g/L,0.6g/L,0.8g/L,1.0g/L,1.2g/L,1.4g/L,1.6g/L,1.8g/L,2.0g/L。

三、实验步骤1.标准曲线制作分别取标准液1.0ml于25ml刻度试管中，按下表加入试剂，沸水中显色5min。

用冷水冷却到室温后，加水至25ml，摇匀，再550nm处用分光光度计测定上述各溶液的A550值。

以葡萄糖浓度为纵坐标，A550值为横坐标，作出标准曲线并回归出标2.发酵液中还原糖的测定1）发酵液过滤或离心得到上清液。

1、分析试剂
DNS显色剂每1000mlDNS溶液含有酒石酸钾钠182g，无水亚硫酸钠3g，氢氧化钠20g，3，5－二硝基水杨酸6.3g，重蒸馏酚4g。

配后过滤放置半月后使用。

1%葡萄糖标准溶液：准确称取100mg葡萄糖，用少量蒸馏水溶解后定容至100ml，冰箱保存备用.
10%ZnSO4溶液.
2、器材
分光光度计，定糖管，移液管，容量瓶，烧杯，电炉等。

[方法步骤]
（一）葡萄糖标准曲线的绘制
取9只定糖管（有盖子，且用绳子系住），分别按照下表1的顺序加入各种试剂，沸水浴中加热5min，后立即流动水冷却。

管内溶液混匀，用空白管溶液调零点，520nm测定光密度值(O.D.)，以葡萄糖含量为横坐标，光密度值为纵坐标绘制葡萄糖溶液标准曲线。

表1 制作葡萄糖标准曲线时各试剂用量
样品液适当稀释，使糖浓度为0.1-1.0mg/ml，取稀释后的糖液1.0ml于15ml刻度试管中，加DNS试剂2.0ml，沸水煮沸2min，冷却后用水补足到15ml刻度，在540nm波长下测定吸光度。

从标准曲线查出葡萄糖mg/ml数。

求出样品中糖含量。