ELISA稀释液配制

Elisa溶液配制或封闭液（1 % BSA）：每100 mL的PBST中加入1 g牛血清白蛋白（BSA），4℃保存首先摸索PCV2抗原包被的最佳浓度，将PCV2抗原按照1/50、1/100、1/200、1/400、1/800、1/1600稀释，一抗用强阳性血清、弱阳性血清、阴性血清按照1/100稀释，于37 ℃孵育1.5 h，二抗用羊抗猪的酶标二抗，于37 ℃孵育1 h，加入TMB显色，测其OD450 nm值，选择阳性血清OD450 nm大于0.8，而阴性血清小于0.1的临界稀释度即为抗原的最佳包被浓度。

然后按照最佳的浓度包被96孔酶标板，每孔加入100 µL，于4℃包被过夜；次日用PBST（0.15M PBS＋0.05% Tween 20）洗涤3次，每次5 min 洗涤；用PBST溶解的1% BSA于37℃湿盒中封闭1-2 h，洗涤方法同上一步骤；然后向孔中加入起始浓度为300 μg/μL，按照1/5、1/10、1/20、1/40、1/80、1/160、1/320、1/640八个稀释梯度的VHHs，置于37 ℃湿盒中孵育2 h，此为反应的一抗；用PBST洗涤5次，每次5 min；加入100 µL抗His标签的HRP标记的鼠源单抗（1:2000稀释）作为反应的二抗，置于37℃湿盒中孵育1 h；再用PBST洗涤5次，每次5 min；最后每孔加入100 µL TMB显色液，室温避光显色10-15 min；显色结束后每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4终止显色，在A450 nm波长处读数。

同时用武汉科前生物有限公司提供的阳性血清（按照上述稀释梯度进行稀释）作为本实验的阳性对照，分别用BSA 和未接种病毒的PD3细胞裂解液包被酶标板，作为本实验的阴性对照1和2。

阳性对照组二抗反应时加入100 µL抗猪-HRP标记的酶标二抗，其余操作方法同上。

ELISA试剂配制及实验流程一、试剂配制1.缓冲液的配制：a.底物缓冲液（底物缓冲液是用于底物变色的溶液）：将适量的底物（如4-氨基甲酸盐柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液等）与酶底物底物溶液（DAB、TMB等）按一定比例混合，并加入适量的过氧化氢。

具体的配制比例和操作方法可以根据试剂盒的说明书调整。

b.洗涤缓冲液：配制聚丙烯酰胺和洗涤缓冲液的稀释液（一般是10倍浓度的磷酸盐缓冲液，pH7.4左右）按一定比例混合，具体比例可根据实验要求进行调整。

c.混合浓缩液：根据试剂盒的说明书配制混合浓缩液，一般是将浓缩液和酶标标记液按照一定比例混合。

2.抗体和抗原的配制：a.抗体：根据试剂盒的说明书，按照建议的浓度和稀释液进行抗体的配制。

b.抗原：根据需要的浓度和稀释液，将抗原溶解在适当的缓冲液中。

二、实验流程1.样本处理：a.收集样本，并根据实验要求进行处理，如去除沉淀、离心处理等。

b.如果需要，还可以将样本进行稀释，以适应检测的要求。

2.化学处理：a.将样本加入ELISA板的孔中。

b.加入适量的底物缓冲液，使样本与抗体或抗原发生特异性的反应。

c.在适当的温度下，通过震荡或孵育等方法，与底物缓冲液中的底物相互作用，产生颜色反应。

3.洗涤步骤：a.使用洗涤缓冲液对孔进行洗涤，以去除未结合的底物和其他杂质。

b.每次洗涤后，将孔内的液体彻底排空，并将ELISA板反复轻轻敲打，以确保孔内的液体完全排出。

4.酶连染色：a.加入适当浓度的混合浓缩液，使底物缓冲液中的底物与酶连染色液中的酶标标记物反应。

b.在适当的温度下，通过震荡或孵育等方法，与底物缓冲液中的底物相互作用，产生颜色反应。

5.反应停止：a.加入适当的反应停止溶液或稀释液，停止底物变色的反应。

6.读取结果：a.使用ELISA检测仪器，根据指定的波长测量样本的吸光度。

b.根据实验的要求和标准曲线，计算样本中的抗原或抗体的浓度。

总结：以上是ELISA试剂的配制及实验流程的简要介绍。

E L I S A试剂配制及实验流程—B D YThe document was finally revised on 2021ELISA试剂配制及实验流程ELISA是酶联接免疫吸附剂测定(( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。

以双抗体夹心法举例说明。

试剂配制：(1) 包被缓冲液 + 碳酸盐缓冲液)：Na2CO3NaHCO3加蒸馏水至1000ml。

（用时稀释成1x，加%BSA）(2) 洗涤缓冲液 0.15M PBST)：%Tween-20加在PBS缓冲液1000ml中。

PBS缓冲液：KH2PO40.27gNa2HPO4·12H2O 3.58gNaCl 8gKCl加蒸馏水至1000ml。

(3) 封闭缓冲液：牛血清白蛋白(BSA) 2% 2g（或5%脱脂奶粉）加洗涤缓冲液100ml。

(4) 稀释液：牛血清白蛋白 %加PBS 缓冲液100ml。

(5) 底物缓冲液：Na2HPO4(无水L，带12结晶水L) 取柠檬酸(无水L，带1结晶水L) 取加蒸馏水至100ml。

(或Na2HPO4·12H2O 1.84g柠檬酸·H2O 0.51g加蒸馏水至100ml)(6) TMB(四甲基联苯胺)显色液（显蓝色）：HRP-TMB(2mg/ml水)底物缓冲液30% H2O 2总体积1ml。

TMB, 1mg/ml-DMSO溶解(7) 或配OPD(邻苯二胺)显色液（显黄棕色）（现配避光）：OPD（干粉） 0.004g底物缓冲液 10ml30% H2O2总体积10ml。

(8) 终止液(2M H2SO4)：在水中，逐滴加入浓硫酸(18M，约98%)，边加边摇。

操作步骤：1. 包被：用包被液将抗体（一抗）稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。

在每板的反应孔中加，4℃过夜（或37℃温育2~3小时）。

次日，弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗3次，中间振荡。

(简称洗涤，下同)。

ELISA 试剂及溶液配制①包被液： 0.05mol/L 碳酸盐缓冲液 (pH9.6)0.75g 碳酸钠 ,1.46g 碳酸氢钠 , 加去离子水定容至 500ml。

②0.02mol/L 磷酸盐缓冲液 (pH7.4)0.2g 磷酸二氢钾， 2.90g 磷酸氢二钠， 8g氯化钠，加去离子水定容到1000ml。

③抗体稀释液： 0.02mol/L PBS(pH7.4)+0.2%BSA0.2gBSA加配好的 0.02mol/L 磷酸盐缓冲液溶解定量至100g。

④封闭液： 0.05mol/L 碳酸盐缓冲液 (pH9.6)+2.0%BSA2.0gBSA加配好的 0.05mol/L 碳酸盐缓冲液溶解定量至100g。

⑤洗涤液： 0.02mol/L PBS(pH7.4)+0.05%Tween-20将 50ulTween-20溶入 100ml0.02mol/L 磷酸盐缓冲液中，震荡混匀。

⑥显色液： TMB-过氧化氢尿素溶液A 液(3 ，3’， 5，5’- 四甲基联苯胺， TMB):称取 TMB20mg溶于 10ml 无水乙醇中，完全溶解后，加双蒸水至 100ml。

B 液(0.1mol/L 柠檬酸 -0.2mol/L 磷酸氢二钠缓冲液， pH5.0-5.4): 称取 Na2HPO4·12HO14.34g，柠檬酸 1.87g 溶于 180ml 双蒸水，加 0.75% 过氧化氢尿素 1.28ml ，定容至 200ml，调 pH至 5.0-5.4 。

将 A 液和 B 液按 1：l 混合后即成 TMB-过氧化氢尿素应用液。

⑦终止液： 2mol/L H 2SO4溶液10ml98%浓硫酸加入60ml 双蒸水中，定容至100ml，室温保存。

⑧酶标二抗：HRP标记的羊抗兔IgG ，应用时用抗体稀释液稀释3000 倍。

2.2.6抗血清的分离采集血液后，去掉针头，缓慢注入已经灭菌的三角烧瓶中，待凝固后用灭菌滴管将血液沿边缘剥离，室温放置 1 小时，再放入 4℃冰箱过夜 ( 不能冰冻，否则产生溶血 ) ，使血清充分析出。

1溶液配制1.1PBS：磷酸盐缓冲呀（10X）加入双蒸水900ml左右，调节PH7.4，定容至1000ml。

1.2PBST：磷酸盐吐温缓冲液Tween-20为一种非离子表面活性剂，一种去污剂，能够在不破坏蛋白质的情况下，洗脱非特异性结合的抗体。

Tween-20既含亲水基团，也含疏水基团，其在洗涤中的作用机理是：借助其疏水基团与经疏水性相互作用被动吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基团形成疏水键，从而削弱蛋白与固相的吸附，同时在其亲水基团与液相中水分子的结合作用下，促使蛋白质脱离固相而进入液相，这样就可达到去掉非特异吸附物的目的。

洗涤缓冲液：含0.05% Tween-20 的中性PBS（即1*PBST）配置：100ml 10*PBS; 2.5ml 20% Tween-20，定容至1L调节PH7.41.320% Tween-2010g Tween-20, 加蒸馏水约30ml, 可4℃过夜，溶解均匀后定容至50ml。

1.4包被缓冲液0.05mol/L碳酸缓冲液（PH9.6）配制：碳酸钠0.75g，碳酸氢钠1.46g，定容至500ml，测PH9.6.1.5封闭液要求：用4℃预冷的1*PBST配置成2%的BSA溶液配制：10ml 2%BSA封闭液：0.2g BSA粉末，溶解于10ml PBST中，摇晃溶解，后放入4℃冰箱（最好提前一天配制，防止泡沫过多）。

保存：4℃1.6Tris稀释液1.7血样稀释液A.小肽标签稀释液母液：60mg/ml（-80℃保存）配制：1ml 60ug/ml的小肽：1ml 4℃2% BSA 1*PBST+1ul小肽母液，混匀，4℃保存B.血清稀释液血清稀释液：5ug/ml（溶质是小肽，溶剂是封闭液）一块96孔板需要12ml血清稀释液，即11ml的封闭液，1ml 60ug/ml的小肽1.8显色液TMB，是辣根过氧化物酶的常用底物。

在辣根过氧化物酶或其他适当过氧化物酶的催化下，TMB会产生蓝色产物。

ELISA试剂配制及实验流程—BDY1.ELISA试剂配制：1.1.酶标板涂布液的制备：将目标分子（如蛋白质、抗原）按照一定浓度加入到合适的涂布液中，充分混合后于酶标板孔中加入一定量，放置4℃过夜，或37℃下2小时孵育。

1.2.标准品制备：将已知浓度的标准品(如纯化蛋白)按照一定比例逐步稀释至一系列浓度，以供后续实验使用。

1.3.洗涤缓冲液的制备：一般可使用PBS洗涤缓冲液或TBS洗涤缓冲液，也可根据实验需求添加0.05%Tween-20增强洗涤效果。

1.4.酶标替位液的制备：ELISA实验常用底物，如TMB （Tetramethylbenzidine），其制备方法是将TMB粉末按照一定比例溶于柠檬酸-酒石酸缓冲液中。

2.实验流程：2.1.样品处理：将待测试的样品（如血清、细胞上清液等）与相应的稀释缓冲液按照一定比例混合，使其浓度处于合适的线性范围内。

2.2.酶标板涂布：取出孵育好的酶标板，将酶标板涂布液尽量去除，加入洗涤缓冲液洗涤1-3次，将样品和标准品按照一定体积（一般为50-100μl）加入到相应的孔中。

2.3.孵育：将酶标板盖好，放置在37℃下孵育1-2小时，促使样品中目标分子与酶标板表面的特异抗体结合形成复合物。

2.4.洗涤：将孔中液体倾倒出来，使用洗涤缓冲液反复洗涤孔中3-5次，每次洗涤2-3分钟。

2.5.检测：将检测抗体加入每个孔中，促使其与复合物结合，形成预期分子叠加结构。

一般分为一抗和二抗，其中一抗是与目标抗原结合的抗体，二抗是标定一抗的抗体，被标记了一个荧光物质或酶，如辣根过氧化物酶（HRP）。

2.6.洗涤：同样使用洗涤缓冲液洗涤，移除未结合抗体。

2.7.显色：在孔中加入酶标替位液，观察发色反应的时间，可以根据实验需要进行反应停止。

2.8.测量：使用酶标仪检测孔中的吸光度或荧光强度，根据标准曲线计算目标分子的浓度。

以上就是ELISA试剂配制及实验流程的详细介绍。

在实验中需要严格按照步骤操作，注意控制实验条件，如温度、时间、洗涤次数等，以保证实验结果的可靠性和准确性。

一、做ＥLISA确定抗原最佳包被浓度,做方阵滴定具体怎么做呢?选择好一份已知为阳性与阴性背景得标本,将您得抗原用1＊CＢ PH=9、6或1＊PB ＰＨ＝7、4进行倍比稀释(8个条件)后加入９6孔板每孔1０0ul。

(一般包被浓度100ng抗原或抗体／孔,最优包被条件需进行试验选择)4度过夜取出后甩干,加入20％NBS封闭每孔２０0ul、３７度2h热封,甩去后拍干即可。

将您HＲP或ＡP标记得抗原或二抗用酶标稀释液进行稀释(倍比稀释4个梯度)即可。

棋盘滴定就就是板酶交叉,同时带上阳性、阴性通过试验确定最佳P/N得包被搭配E得试验2。

抗原与抗体最佳工作浓度得确定抗原抗体反应要求在最适比例条件下进行,EＬＩSＡ反应试剂多,其工作浓度不同对结果影响较大,因此必须对包被抗原(抗体)与酶标抗体(抗原)进行最佳工作浓度得滴定与选择,以达到最佳得测定条件。

1)方阵(棋盘)滴定法选择包被抗原得工作浓度用包被液将抗原作一系列稀释(1:5０~l:800)后,按行进行包被、洗涤。

按列分别加入用稀释液１:１00稀释得强阳性、弱阳性、阴性参考血清及稀释液(作空白对照),保温,洗涤。

加工作浓度酶标抗体,洗涤,加底物显色,加酸终止反应后读取Ａ值、选择强阳性参考血清A值;为０.8左右,阴性参考血清Ａ值<０.1得包被抗原稀释度为工作浓度。

方阵(棋盘)法选择包被抗体与酶标抗体得工作浓度将抗体用包被液稀释为１0mg／L、lmｇ/L、0、1mg／Ｌ三个浓度按行包被,每一个浓度包被三行(每行3孔),分别在每个浓度包被得第一、二、三行中分别加入强阳性抗原,弱阳性抗原与阴性对照,将酶标抗抗体用稀释液稀释为1:l ００0、l:500０、l:1000０三个浓度,分别加入每个浓度包被得第一、二、三列中、加底物显色,加酸终止反应,分别读取A值。

以强阳性抗原液A值在0.8左右,阴性参考Ａ值〈０.１得条件为最适条件。

据此选择包被抗体与酶标抗体得最佳工作浓度、二、ELISA最适工作浓度得选择及标准化操作1最适工作浓度得选择ﻫ1。

北京雷根生物技术有限公司 ELISA 包被缓冲液(10×)简介：平衡盐溶液(Balanced Salt Solution ，BSS)与细胞生长状态下的pH 值、渗透压等环境状态一致，具有维持渗透压、控制酸碱平衡、供给细胞生存代谢所必需的能量和无机盐成分等作用，可满足体外实验中细胞生存并维持一定的代谢的基本需要。

Leagene ELISA 包被缓冲液(10×)主要由碳酸钠、碳酸氢钠、防腐剂等组成，pH 值为9.6，主要用于ELISA 实验中包被96孔板的孔。

该试剂为10×工作液，稀释至1×后使用。

组成：操作步骤(仅供参考)：1、 用超纯水稀释ELISA 包被缓冲液(10×)至1×。

2、 在实验前一天，用BSA 或其他包被用物质溶解于ELISA 包被缓冲液(1×)，包被96孔板。

3、 注意不要包被用作空白对照的孔，用塑料膜包裹平板，4℃温育过夜。

注意事项：1、 注意密闭保存，避免挥发。

2、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期：12个月有效。

亦可短期内室温存储。

相关：编号 名称 IT0021 IT0021 Storage ELISA 包被缓冲液(10×) 100ml 500ml 4℃ 使用说明书 1份编号 名称 CC0005 磷酸缓冲盐溶液(1×PBS,无钙镁) CS0001 ACK 红细胞裂解液(ACK Lysis Buffer) DF0111中性福尔马林固定液(10%) DM0007瑞氏-姬姆萨复合染色液 IH0143PBS 磷酸盐缓冲液(0.1mol/L,pH7.2-7.4) TC0699葡植物总糖和还原糖检测试剂盒(硝基水杨酸法) TC1167 尿素(Urea)检测试剂盒(脲酶波氏比色法)。

【检验方法】1.试验前准备（1）缓冲液使用前用蒸馏水或去离子水5倍稀释每瓶样本浓缩缓冲液，最终稀释体积为100ml。

冷藏存储：配好的溶液在2-8℃放置，30天内有效，或标签标注的有效期。

（2）洗液使用前用蒸馏水或去离子水50倍稀释每瓶洗板浓缩缓冲液，最终稀释体积为1000ml。

冷藏存储：配好的溶液在2-8℃放置，30天内有效，或标签标注的有效期。

（3）样本检测前，将所有病人的样本用样本缓冲液1:100稀释。

因此在聚苯乙烯板上应混有10μl的样品和990μl的样品缓冲液。

质控品不需要稀释。

2.试验步骤（1）按需要准备好足够微孔反应板条。

（2）用100μl移液器把质控品和稀释后的病人样本加入到微孔中。

（3）在室温（20-28℃）温育30分钟。

（4）吸取300μl洗液冲洗微孔物质，冲洗3次。

（5）吸取100μl每份酶结合物分加到微孔中。

（6）在室温下温育15分钟。

（7）吸取300μl洗液冲洗微孔物质，冲洗3次。

（8）吸取100μl TMB底物溶液加入到微孔当中。

（9）在室温下温育15分钟。

（10）在每个微孔中加入100μl终止液，在室温下温育5分钟。

（如果酶标仪为读数之前震荡方式可不经5分钟温育后直接进行读数）（11）在450nm波长读取光密度读数并计算结果，如果采用双波长测定，参考波长为600-690nm。

3.程序注意事项（1）试剂的组分应在有效期内使用。

（2）试剂盒各组分不能互换。

（3）所有的实验材料应在室温（20-28℃）下操作。

（4）为了得到稳定和连续性的结果，在测试之前要准备好所有的检测样本，一旦测试开始就不要中断。

（5）严格按标准检测顺序进行检测分析。

（6）使用刚稀释的新鲜样本。

（7）所有的试剂和样本都要加入到微孔底部。

（8）不同样品和不同试剂之间要更换枪头以避免污染。

（9）彻底清洗微孔、除去最后的洗涤缓冲液对得到一个良好结果是非常重要的。

（10）所有的温育过程必须精确计时。

（11）质控品要定期进行检测以保证试剂和检测结果的可信性。