组织切片制作
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① 取材:采集组织速度要快,以免组织发生死后变化。采取的组织不宜太大,最好不要超过0.5cm,因过大的组织块在固定式药液尽头不充分。采取组织材料动作要轻,以免挤压造成内部结构发生变化若组织上附有过多血液或其他物质应漂洗干净。神经、肌腱等应先平摊于吸水纸上。
② 固定:紧张切开皮肤,钝性分离,采集样品后在滤纸上吸干后迅速放入10%甲醛溶液中固定24h,固定液甲醛的用量应是被固定组织块容积的30~50倍。使组织、细胞的蛋白质变性凝固,以防止细胞死后的自溶或细菌的分解,从而保持细胞本来的形态结构。
③ 洗涤:瓶口罩上纱布,用皮筋封牢,若组织较多则可用纱布将个组织块包好仪器放入广口瓶中,自来水接橡皮管插入瓶底,调节流量是使水从瓶底缓慢流出。
④ 脱水:在就进内浸泡时间是组织大小而定,一般为4~12h,无水酒精中要更短些:30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇→90%乙醇→95%乙醇→100%乙醇。注意:①脱水必须是在有盖的瓶内进行,尤其是高浓度酒精,易吸水降低浓度(同时应注意天气);②组织进入高一级酒精中应吸干水分后进入。
⑤ 透明:二甲苯透明,目的是将组织块中的无水酒精置换出来,为浸蜡做准备。透明前先以1:1的二甲苯-无水酒精过度防止二甲苯对组织引起收缩,再用二甲苯透明,时间一般为2~3h。
⑥ 包埋:透明后的组织块先经1:1的二甲苯-石蜡过渡,再进入蜡杯,每个蜡杯中停留时间不超过30min,以上步骤均在石蜡融化状态下进行,严格控制温度,低于56℃。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋——将已溶化的石蜡倒入小纸盒中,迅速夹取放入冷水中冷却,凝固成块即成。
⑦切片:将包埋好的蜡块固定于切片机上,切成薄片,一般为5μm,放到加热的水中烫平,使之粘附到沾有黏附剂(少许鸡蛋清与甘油等量混合制成)的载玻片上,放45℃恒温箱中烘干。
⑧脱蜡:贴好的切片因有石蜡不能直接染色,必须先在二甲苯中脱去石蜡。
⑨染色:1:1二甲苯-无水酒精2min→无水酒精2min→95%乙醇2min→90%乙醇2min→80%乙醇2min→70%乙醇2min→50%乙醇2min→30%乙醇2min→苏木精15~20min→蒸馏水水洗→0.25%~0.5%HCl分化(即分色)→蒸馏水→自来水→蒸馏水→30%乙醇2~3min→50%乙醇2~3min→70%乙醇2~3min→80%乙醇2~3min→90%乙醇2~3min→95%乙醇2~3min→0.5%~1%伊红复染2~3min→95%乙醇2~3min→100%乙醇2~3min→100%乙醇2~3min→1:1二甲苯-无水乙醇2~3min→二甲苯10~15min,每次出瓶后在滤纸上沥一下。 ⑩封藏:将完成的切片加适量的封片树胶,立即将清洁的盖玻片盖上,停至烘箱中38℃烘干,如自然晾干需时间较长。封藏后贴上标签备用。