origin绘制标准曲线

标准曲线绘制

calfstone

任何科学实践必须有科学理论的支撑。在这个意义上讲，经验有时候是一种误导。在寻求某个困扰自己的问题答案的时候，我提倡用理论支撑的观点来表达自己和说服自己。任何的盲从和权威都是不可取的。标准曲线的做法问题也是如此。

1、标准曲线的本质。标准曲线是标准物质的物理/化学属性跟仪器响应之间的函数关系。建立标准曲线的目的是推导待测物质的理化属性。如果有不需要标准曲线的方法，比如绝对校正，我想大家都会高兴。

2、标准曲线的适用性。这是做标准曲线的重要前提，这个问题实际很简单，就是这样一个问题：我的样品的仪器响应能否用我们所建立的标准曲线来推导其理化属性？答案建立在仪器响应的特异性和标准系列和样品的匹配性上面。一方面我们总是力求仪器的响应对于标准和样品是一视同仁；同时我们也要求我的样本跟标准基体匹配。所以最好的标准是基体匹配标准，最好的标准曲线是工作曲线。这样，我们也很好理解为什么大多数分析要求标准曲线和样品同批测定（除非经过实验，标准曲线的变化不大），同样的道理也可以理解为什么我们在做大批量检测的时候要插入QC检验样本，以考察仪器的稳定性。即使在任何信息未知的情况下，我们还是要做我们的分析测试的（要不，我们都失业了），因为大家都是用同样的方法做，要错大家一起错；同时也因为我们相信伴随科学的进步，我们所测试的结果的准确性就越接近真理。

3、简单的标准曲线----单点校正。对于分析成本高的测试，单点校正是不得以的选择。现在应用最多的是色谱分析，很多国家标准或国际标准都采用单点校正，实际是建立在色谱分析的高选择性上面：我们的空白一般都很小，我们的线性一般都很好。在有这么多验前概率的支撑下，色谱分析中大量的单点校正不失为一个合理的选择。但单点校正要丢失很多的信息量，这个信息量就是不确定度。

4、标准曲线的点的分布。从不确定度理论推算样本的不确定度时，有二个重要的结论：一、标准曲线的重心点处，所查出来的样品不确定度最小。二、标准的点数越多，样品的不确定度越小。基于这两个结论的标准曲线的做法应该是：在样品浓度的附近尽量的多布标准点。点做多做少，点分布如何，影响的是标准曲线所查出来的样品的理化属性的不确定度。好的测量应该是不确定度小的测量，这在判断样品的结果是否超标或符合限值的时候至关重要。

将甲醛标准样品稀释成10 ug/ml，2~5℃贮存。

取7支25ml具塞比色管按下表绘制标准色列：

管号 0 1 2 3 4 5 6

甲醛（10ug/ml）,ml 0 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6 3.2

甲醛，ug 0 1 2 4 8 16 32

于上述标准系列中，用水稀释定容至10.0ml刻线，加0.25%乙酰丙酮溶液2.0ml，混匀，置于沸水浴中加热3min，取出冷却至室温，用1cm吸收池，以水为参比，于波长413nm处测定吸光度。将上述系列标准溶液测得的吸光度A值扣除试剂空白（零浓度）的吸光度A0值，便得到校准吸光度y值，以标准吸光度y为纵坐标，以甲醛含量x（ug）为横坐标，绘制标准曲线，或用最小二乘法计算其回归方程式。注意零浓度不参与计算。

y=bx+a

式中：a——校准曲线截距；

B——标准曲线斜率。

由斜率倒数求得校准因子：Ba=1//b

样品测定

将吸收后的样品溶液移入50ml或100ml容量瓶中，用水稀释定容，取少于10ml试样（吸取量视溶液浓度而定），于25ml比色管中，用水定容至10.0ml刻线，以下步骤按标准曲线的绘制过程进行分光光度测定。

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1 标准曲线绘制

在分析化学实验中，常用标准曲线法进行定量分析，通常情况下的标准工作曲线是一条直线。

标准曲线的横坐标(X)表示可以精确测量的变量(如标准溶液的浓度)，称为普通变量，纵坐标(Y)表示仪器的响应值(也称测量值，如吸光度、电极电位等)，称为随机变量。当X取值为X1, X2,…… Xn时，仪器测得的Y值分别为Y1, Y2, …… Yn。将这些测量点Xi, Yi描绘在坐标系中，用直尺绘出一条表示X与Y之间的直线线性关系，这就是常用的标准曲线法。用作绘制标准曲线的标准物质，它的含量范围应包括试祥中被测物质的含量，标准曲线不能任意延长。用作绘制标准曲线的绘图纸的横坐标和纵坐标的标度以及实验点的大小均不能太大或太小，应能近似地反映测量的精度。 由于误差不能完全避免，实验点完全落在工作曲线的的情况是极少的，尤其是在误差较大时，实验点比较分散，它们通常并不在同一条直线上，这样凭直觉很难判断怎样才能使所连接的直线对于所有实验点来说误差是最小的，目前较好的方法是对实验点(数据)进行回归分析。

研究随机现象中变量之间相关关系的数理统计方法称为回归分析，当自变量只有一个或X与Y在坐标图上的变化轨迹近似一直线时，称为一元线性回归。

一元线性回归方程的求法

确定回归直线的原则是使它与所有测量数据的误差的平方和达到极小值，设回归直线方法为

(2－15)

式中a表示截距，b表示斜率。

假设Xi和Yi (i=1,2,3,……,n)是变量X和Y的一组测量数据。对于每一个Xi值，在直线( )上都有一个确定的 值。但 值与X轴上Xi处的实际测定值Yi是不相等的， 与Yi之差为：

(2－16)

上式表示 与直线()的偏离程度，即直线的误差程度。如果全部n个测定引起的总偏差用 表示，则偏差平方和s为 v1.0 可编辑可修改

2 (2－17)

茚三酮比色法测定游离氨基酸含量

原理：

茚三酮与氨基酸的反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生二氧化碳､氨和醛，而水合

茚三酮被还原成还原性茚三酮；第二步是所生成的还原性茚三酮与另一个水合茚三酮分子和

氨缩合生成成为蓝紫色化合物，该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比｡

磷酸缓冲液（pH.8.04）：

称磷酸二氢钾4.5350 g，定容500 ml。

称NAH2PO4·12H2O11.9380 g分别溶解定容500 ml。

取磷酸二氢钾10 ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液

2％茚三酮溶液：称取水合茚三酮 2 g，加水溶解后定容至 100 mL。储成于棕色瓶中，避光

保存。

0.25%抗坏血酸溶液：称取抗坏血酸 0.1 g，加水溶解后定容至 100 mL，现配现用，或者密

封，冻存于-20 oC。

茚三酮反应液：取50 ml 2% 茚三酮，加入5 ml 0.25%的Vc，使用蒸馏水稀释到100 ml，密封储存在棕色瓶中。

亮氨酸标准液:称取 100 mg 亮氨酸（纯度不低于 99%）溶于 100 mL 水中，作为母液，此

时亮氨酸的浓度为1 mg/mL。

茚三酮标准曲线制作

溶液中氨基酸的浓度如果低于20 g/ml，茚三酮显色反应将不能发生，故先配制不同浓度的氨基酸标准液，取十支试管，标号为

1，2，3……10，按照下表配制

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1000 g/ml

亮氨酸 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 超纯水 ml 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9 8.9 8.8 8.7 8.6 8.5

亮氨酸

终浓度g/ml 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150

使用螺旋盖（内垫）试管分别取上述浓度的氨基酸标准液1ml，空白对照使用1ml超纯水替