血管内皮生长因子(VEGF)测定试剂盒(化学发光法)总医院可行性论证报告书

用Elisa试剂盒检测人血清血浆中VEGF血管内皮生长因子的浓度引言VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor，血管内皮生长因子) 是一种重要的血管生成调节因子，在多种生理和病理状态下发挥着重要的作用。

测定血清血浆中VEGF的浓度可以为许多疾病的诊断和治疗提供有价值的参考依据。

本文将介绍如何使用Elisa试剂盒来定量检测人血清血浆中VEGF的浓度。

实验准备材料1.试剂盒：Elisa试剂盒 (VEGF检测)2.样本：人血清血浆样本3.校准曲线标准品：不同浓度的VEGF标准品仪器和设备1.Elisa酶标仪2.微量移液器和相应的移液枪尖3.微量离心机实验步骤1.将试剂盒中的标准品取出并溶解。

2.准备一系列不同浓度的标准品，包括0 pg/mL，10 pg/mL，20pg/mL，50 pg/mL，100 pg/mL，200 pg/mL和400 pg/mL。

标准品的浓度根据试剂盒的说明书进行稀释。

3.将标准品和待测样本加入已涂有VEGF抗体的微孔板中。

4.混合孔板中的标准品和样本，并在37°C的恒温孵育箱中孵育一段时间。

5.将孵育后的孔板倒置，用洗涤缓冲液洗涤孔板，去除未结合的物质。

6.加入带有酶标记的VEGF抗体，并在37°C的恒温孵育箱中孵育一段时间。

7.再次倒置孔板并洗涤，去除未结合的物质。

8.加入底物溶液，并在室温下孵育一段时间。

9.加入停止液，停止反应。

10.使用Elisa酶标仪测量各孔的吸光度。

11.利用标准曲线，根据各孔的吸光度读数来计算出样本中VEGF的浓度。

数据分析根据测得的吸光度读数，通过标准曲线可以计算出待测样本中VEGF的浓度。

将各样本的浓度数据进行统计分析，计算出平均值和标准差，以及样本之间的相关性。

通过使用Elisa试剂盒，我们可以方便、快速地检测人血清血浆中VEGF的浓度。

这对于疾病的诊断和治疗提供了有价值的参考依据，同时也为相关生物学研究提供了重要的数据支持。

本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断。

人血管内皮细胞生长因子（VEGF）定量检测试剂盒（ELISA）使用说明书【试剂盒名称】人血管内皮细胞生长因子（VEGF）定量检测试剂盒（ELISA）【试剂盒用途】定量检测人子血清、血浆及相关液体样本中血管内皮细胞生长因子（VEGF）的含量。

【检测原理】本试剂盒采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法（ELISA）。

将标准品、待测样本加入到预先包被人血管内皮细胞生长因子（VEGF））多克隆抗体透明酶标包被板中，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分，再加入酶标工作液，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分。

依次加入底物A、B，底物（TMB）在辣根过氧化物酶（HRP）催化下转化为蓝色产物，在酸的作用下变成黄色，颜色的深浅与样品中人血管内皮细胞生长因子（VEGF））浓度呈正相关，450nm波长下测定OD值，根据标准品和样品的OD值，计算样本中人血管内皮细胞生长因子（VEGF））含量。

【试剂盒组成】1 酶标包被板12孔×8条7 底物夜A6mL2 标准品：1600pg/ml0.6mL 8 底物夜B6mL3 20倍浓缩洗涤液20mL9 终止液6mL4 标准品稀释液6mL10 说明书1份5 样本稀释液6mL 11 封板膜1张6 酶标试剂6mL12 密封袋1个备注：标准品用标准品稀释液依次稀释为：1600、800、400、200、100、50pg/ml【需要而未提供的试剂和器材】1、37℃恒温箱2、标准规格酶标仪3、精密移液器及一次性吸头4、蒸馏水5、一次性试管6、吸水纸【操作步骤】1、准备：从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30分钟。

2、配液：用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。

3、加标准品和待测样本：取足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准品50μL；待测样本孔中先加入待测样本10μL，再加样本稀释液40μL（即样本稀释5倍）；空白对照孔不加。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911393099.5(22)申请日 2019.12.30(71)申请人 上海复星长征医学科学有限公司地址 200444 上海市宝山区城银路830号(72)发明人 郭健健　(74)专利代理机构 上海科盛知识产权代理有限公司 31225代理人 顾艳哲(51)Int.Cl.G01N 33/68(2006.01)G01N 33/577(2006.01)G01N 33/574(2006.01)G01N 33/543(2006.01)G01N 33/535(2006.01)(54)发明名称一种用于检测血管内皮生长因子的检测试剂盒及其制备方法和使用方法(57)摘要本发明涉及一种用于检测血管内皮生长因子的检测试剂盒及其制备方法和使用方法，本发明试剂盒包括生物素化VEGF单克隆抗体，碱性磷酸酶标记的VEGF单克隆抗体，链霉亲和素磁珠，试剂盒适用于全自动化学发光免疫分析仪Lumiart -II -1，相比传统的ELISA试剂盒，全自动化操作减少手工误差，反应时间更短，灵敏度更高，实现高通量快速化测定，准确度高，特异性强，精确度和检测效率有了较大的提升，试剂盒可用于早期癌症风险筛查，肿瘤病人治疗疗效评估监测以指导用药、复发监测和预后等，具有良好的应用前景。

权利要求书2页 说明书5页 附图2页CN 111044734 A 2020.04.21C N 111044734A1.一种用于检测血管内皮生长因子的检测试剂盒，其特征在于，包括生物素化VEGF单克隆抗体、碱性磷酸酶标记的VEGF单克隆抗体以及链霉亲和素磁珠。

2.根据权利要求1所述的一种用于检测血管内皮生长因子的检测试剂盒，其特征在于，所述的生物素化VEGF单克隆抗体中，VEGF单克隆抗体与生物素的摩尔质量比为1：45-55。

3.根据权利要求1所述的一种用于检测血管内皮生长因子的检测试剂盒，其特征在于，所述的碱性磷酸酶标记的VEGF单克隆抗体中，VEGF单克隆抗体与碱性磷酸酶标记物的质量比为1：1-2。

人血管内皮生长因子（VEGF)酶联免疫检测试剂盒使用说明书AE98006Hu使用前仔细阅读本说明书。

本酶联免疫试剂盒是基于双抗体夹心技术原理，来检测人血管内皮生长因子（VEGF)，只能用于研究用途，不得用于医学诊断。

用途：用于人血清、血浆及相关液体样本中血管内皮生长因子（VEGF)测定。

工作原理本试剂盒采用的是生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定样品中人血管内皮生长因子（VEGF)水平。

向预先包被了人血管内皮生长因子（VEGF)单克隆抗体的酶标孔中加入人血管内皮生长因子（VEGF)，温育；温育后，加入生物素标记的抗VEGF抗体。

再与链霉亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅与样品中人血管内皮生长因子（VEGF)的浓度呈正相关。

试剂盒组成试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品1200ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存链霉亲和素-HRP3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存生物素标记的抗0.5ml×1瓶1ml×1瓶2-8℃保存VEGF抗体显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存需要而未提供的试剂和器材1．37℃恒温箱。

2．标准规格酶标仪。

3．精密移液器及一次性吸头4．蒸馏水，5．一次性试管6．吸水纸注意事项1．从2-8℃取出的试剂盒，在开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。

人血管内皮生长因子A(VEGF-A)酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中血管内皮生长因子A(VEGF-A)的含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人血管内皮生长因子A(VEGF-A)水平。

用纯化的人血管内皮生长因子A(VEGF-A)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入血管内皮生长因子A(VEGF-A)，再与HRP标记的VEGF-A抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的血管内皮生长因子A(VEGF-A)呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人血管内皮生长因子A(VEGF-A)浓度。

样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清。

检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。

通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清。

保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5. 组织标本：切割标本后，称取重量。

㊃论 著㊃D O I :10.3969/j.i s s n .1672-9455.2024.05.002磁微粒化学发光法测定V E G F 的性能验证和临床应用效果评估*屠竞扬1,周 琰1,邵文琦1ә,潘柏申1,王蓓丽1,郭 玮1,2,3,41.复旦大学附属中山医院检验科,上海200032;2.上海市老年医学中心检验科,上海201104;3.上海市宝山区吴淞中心医院检验科,上海200940;4.复旦大学附属中山医院厦门医院检验科,福建厦门361015摘 要:目的 分析磁微粒化学发光法测定血管内皮生长因子(V E G F )的性能并评估临床应用效果㊂方法 选取2023年8月于复旦大学附属中山医院确诊为实体恶性肿瘤患者80例作为癌症组,良性病变患者80例作为良性疾病组,另选取于该院体检的表观健康者20例作为健康对照组㊂采用磁微粒化学发光法测定V E G F 的水平,并验证其正确度㊁重复性㊁中间精密度㊁线性范围㊁可报告范围㊁参考范围及抗干扰能力㊂比较3组患者V E G F 水平并绘制V E G F 诊断恶性肿瘤的受试者工作特征(R O C )曲线㊂结果 低值样本重复检测20次的变异系数(C V )为4.38%,高值样本重复检测20次的C V 为1.32%,符合国家卫生健康委员会临床检验中心室间质量评价标准中公布的肿瘤标志物不超过总允许误差(T E a )的1/4的要求(ɤ6.25%)㊂低值样本测量10次的C V 为2.38%,高值样本测量10次的C V 为1.92%,中间精密度符合不超过T E a 的1/3的要求(ɤ8.33%)㊂重复检测3次国际标准品Z 1㊁Z 2的偏差分别为1.43%和-1.45%,其绝对值均未超出目标偏差(ɤ15%)㊂线性范围为40~3200p g /m L ㊂可报告范围为40~16000p g/m L ㊂20例表观健康人群检测结果均在厂家声明参考范围内,参考范围验证通过㊂加入干扰物质后,检测结果偏差均符合产品说明书声明的偏差(ɤ15%),抗干扰验证通过㊂癌症组V E G F 水平高于健康对照和良性疾病组(P <0.05),以160p g /m L 为最佳截断值时,V E G F 诊断恶性肿瘤的曲线下面积为0.90,灵敏度为0.69,特异度为0.95㊂结论 磁微粒化学发光法测定V E G F 的重复性㊁中间精密度㊁正确度㊁线性范围㊁可报告范围㊁参考范围㊁抗干扰能力均符合实验室质量管理要求,能保证检测质量,满足临床使用需求,可用于恶性肿瘤的辅助诊断㊂关键词:血管内皮生长因子; 磁微粒化学发光法; 性能验证; 临床应用效果; 评估中图法分类号:R 466.11文献标志码:A文章编号:1672-9455(2024)05-0581-06P e r f o r m a n c e v e r i f i c a t i o n a n d c l i n i c a l a p p l i c a t i o n e f f e c t e v a l u a t i o n o f m a gn e t i s m p a r t i c u l a t e c h e m i s t r yl u m i n e s c e n c e m e t h o d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f V E G F *T U J i n g y a n g 1,Z H O U Y a n 1,S HA O W e n q i 1ә,P A N B a i s h e n 1,WA N G B e i l i 1,G U O W e i 1,2,3,41.D e p a r t m e n t o f L a b o r a t o r y M e d i c i n e ,Z h o n g s h a n H o s p i t a l A f f i l i a t e d t o F u d a n U n i v e r s i t y ,S h a n gh a i 200032,C h i n a ;2.D e p a r t m e n t o f L a b o r a t o r y M e d i c i n e ,S h a n gh a i G e r i a t r i c M e d i c a l C e n t e r ,S h a n g h a i 201104,C h i n a ;3.D e p a r t m e n t o f L a b o r a t o r y M e d i c i n e ,W u s o n g C e n t r a l H o s pi t a l ,B a o s h a n D i s t r i c t ,S h a n g h a i 200940,C h i n a ;4.D e p a r t m e n t o f L a b o r a t o r y Me d i c i n e ,X i a m e n B r a n c h ,Z h o n g s h a n H o s p i t a l ,F u d a n U n i v e r s i t y ,X i a m e n ,F u ji a n 361015,C h i n a A b s t r a c t :O b je c t i v e T o a n a l y z e t h e p e rf o r m a n c e a n d c l i n i c a l a p p l i c a t i o n e f f e c t o f m ag n e t i s m p a r t i c u l a t e ch e mi s t r y lu m i n e s c e n c e m e t h o d i n t h e d e t e r m i n a t i o n o f v a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r (V E G F ).M e t h o d s A t o t a l o f 80p a t i e n t s d i a g n o s e d w i t h s o l i d m a l i g n a n t t u m o r s i n Z h o n g s h a n H o s pi t a l A f f i l i a t e d t o F u d a n U n i v e r s i t y i n A u g u s t 2023w e r e s e l e c t e d a s t h e c a n c e r g r o u p ,80p a t i e n t s w i t h b e n i gn l e s i o n s w e r e s e -l e c t e d a s t h e b e n i g n d i s e a s e g r o u p ,a n d 20p a t i e n t s w i t h a p p a r e n t h e a l t h i n t h e h o s pi t a l w e r e s e l e c t e d a s t h e h e a l t h y c o n t r o l g r o u p .T h e l e v e l o f V E G F w a s m e a s u r e d b y m a g n e t i s m p a r t i c u l a t e c h e m i s t r y lu m i n e s c e n c e m e t h o d .T h e t r u e n e s s ,r e p e a t a b i l i t y ,i n t e r m e d i a t e p r e c i s i o n ,l i n e a r r a n g e a n d r e p o r t a b l e r a n ge ,r ef e r e n c e i n t e r -v a l a n d a n t i -i n t e r f e r e n c e a b i l i t y o f t h e p r o j e c t w e r e v e r i f i e d .T h e l e v e l s o f V E G F i n t h e t h r e eg r o u ps w e r e c o m -p a r e d ,a n d t h e r e c e i v e r o p e r a t i n g c h a r a c t e r i s t i c (R O C )c u r v e o f V E G F i n t h e d i a g n o s i s o f m a l i gn a n t t u m o r s w a s ㊃185㊃检验医学与临床2024年3月第21卷第5期 L a b M e d C l i n ,M a r c h 2024,V o l .21,N o .5*基金项目:国家科学自然基金面上项目(82172348);复旦大学附属中山医院临床研究专项基金(2020Z S L C 54);上海市临床重点专科建设项目(s h s l c z d z k 03302);上海市宝山区医学重点专科(B S Z K -2023-A 18);复旦大学附属中山医院科技创新基金(2021Z S C X 12)㊂ 作者简介:屠竞扬,男,技师,主要从事生化检验相关研究㊂ ә 通信作者,E -m a i l :s h a o .w e n q i @z s -h o s pi t a l .s h .c n ㊂d r a w n.Re s u l t s C o ef f i c i e n t o f v a r i a t i o n(C V)f o r l o w-v a l u e s a m p l e s w i t h20r e p e a t e d t e s t s w a s4.38%,a n d f o r h ig h-v a l u e s a m p l e s w i t h20r e p e a t e d t e s t s,C V w a s1.32%,whi c h m e t t h e r e q u i r e m e n t s o f t u m o r m a r k e r s p u b l i s h e d i n t h e i n t e r-l a b o r a t o r y q u a l i t y e v a l u a t i o n s t a n d a r d s o f C l i n i c a l L a b o r a t o r y C e n t e r o f t h e N a t i o n a l H e a l t h C o mm i s s i o n o f n o t e x c e e d i n g1/4t o t a l a l l o w a b l e e r r o r(T E a)(ɤ6.25%).T h e C V o f10m e a s u r e-m e n t s f o r l o w-v a l u e s a m p l e s w a s2.38%,a n d t h e C V o f10m e a s u r e m e n t s f o r h i g h-v a l u e s a m p l e s w a s1.92%. T h e i n t e r m e d i a t e p r e c i s i o n m e t t h e r e q u i r e m e n t s o f n o t e x c e e d i n g1/3T E a(ɤ8.33%).T h e d e v i a t i o n s o f t h e i n t e r n a t i o n a l s t a n d a r d Z1a n d Z2w e r e1.43%a n d-1.45%,r e s p e c t i v e l y,w h i c h d i d n o t e x c e e d t h e t a r g e t d e v i-a t i o n(ɤ15%).T h e l i n e a r r a n g e w a s40t o3200p g/m L.T h e r e p o r t a b l e r a n g e w a s40t o16000p g/m L.T h e t e s t r e s u l t s o f20a p p a r e n t h e a l t h y p e o p l e w e r e w i t h i n t h e r e f e r e n c e r a n g e d e c l a r e d b y t h e m a n u f a c t u r e r,a n d t h e r e f e r e n c e r a n g e w a s v e r i f i e d.A f t e r a d d i n g i n t e r f e r i n g s u b s t a n c e s,t h e d e v i a t i o n o f t h e t e s t r e s u l t s w a s i n l i n e w i t h t h e d e v i a t i o n s t a t e d i n t h e p r o d u c t i n s t r u c t i o n s(ɤ15%),a n d t h e a n t i-i n t e r f e r e n c e v e r i f i c a t i o n w a s p a s s e d.T h e l e v e l o f V E G F i n c a n c e r g r o u p w a s h i g h e r t h a n t h a t i n h e a l t h y c o n t r o l g r o u p a n d b e n i g n d i s e a s e g r o u p(P<0.05).W h e n160p g/m L w a s u s e d a s t h e b e s t c u t-o f f v a l u e,t h e a r e a u n d e r t h e c u r v e o f V E G F i n t h e d i a g n o s i s o f m a l i g n a n t t u m o r s w a s0.90,t h e s e n s i t i v i t y w a s0.69,a n d t h e s p e c i f i c i t y w a s0.95.C o n c l u s i o n T h e r e p e a t a b i l i t y,i n t e r m e d i a t e p r e c i s i o n,t r u e n e s s,l i n e a r i t y,r e p o r t a b l e r a n g e,r e f e r e n c e r a n g e,a n d a n t i-i n t e r f e r e n c e a b i l i t y o f t h e m a g n e t i s m p a r t i c u l a t e c h e m i s t r y l u m i n e s c e n c e m e t h o d f o r V E G F d e t e c t i o n m e e t t h e q u a l i t y m a n a g e m e n t r e-q u i r e m e n t s o f t h e l a b o r a t o r y,w h i c h c a n e n s u r e t h e q u a l i t y o f d e t e c t i o n a n d m e e t t h e n e e d s o f c l i n i c a l u s e f o r t h e a u x i l i a r y d i a g n o s i s o f m a l i g n a n t t u m o r s.K e y w o r d s:v a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r; m a g n e t i s m p a r t i c u l a t e c h e m i s t r y l u m i n e s c e n c e m e t h o d; p e r f o r m a n c e v e r i f i c a t i o n;c l i n i c a l a p p l i c a t i o n;e v a l u a t i o n近年来,肺癌㊁结直肠癌㊁胰腺癌㊁胃癌等恶性肿瘤的发病率和病死率呈逐年上升趋势,这对于人们的身心健康和生活质量产生了巨大的影响㊂很多恶性肿瘤患者由于初期症状不明显,而耽误了最佳治疗时机㊂因此,临床需要更多的早期肿瘤标志物对于各种恶性肿瘤患者进行早期筛查㊂血管内皮生长因子(V E G F)是一种相对分子质量为34~46ˑ103的高度糖基化的二聚体可溶性碱性糖蛋白,具有很强的促进血管内皮细胞分裂㊁繁殖及增强毛细血管通透性的能力,并且在许多病理生理过程中都有表达㊂在众多血管生成因子当中,V E G F是公认的主要诱导血管生成的物质,是肿瘤血管生成的最有效的刺激因子,与肿瘤的发生㊁发展具有密切的关系㊂V E G F虽作为一种新型肿瘤标志物备受临床关注,但目前国内对恶性肿瘤患者血清V E G F水平的检测尚处于初级阶段,临床普及率仍较低㊂使用磁微粒化学发光法检测V E G F 水平相较于目前临床上常用的直接化学发光法,其能通过磁场分离出V E G F,使检测的准确率更高㊂本研究拟对V E G F测定试剂盒(磁微粒化学发光法)做性能分析和初步临床应用效果评估㊂1资料与方法1.1一般资料选取2023年8月于复旦大学附属中山医院(以下简称本院)确诊为实体恶性肿瘤患者80例作为癌症组,其中肺部㊁结直肠㊁胰腺㊁胃部肿瘤患者各20例,良性病变患者80例作为良性疾病组,其中肺部㊁结直肠㊁胰腺㊁胃部疾病患者各20例㊂癌症组及良性疾病组入组排除并发风湿㊁类风湿关节炎㊁心肌梗死及其他心脏疾病㊁血管炎㊁系统性红斑狼疮㊁严重感染及严重内科疾病的患者㊂另选取于本院体检的表观健康者20例作为健康对照组㊂健康对照组平均(40.90ʃ12.14)岁,良性疾病组平均(56.25ʃ13.44)岁,癌症组平均(61.59ʃ12.69)岁,3组年龄比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性㊂本研究获得本院医学伦理委员会审核批准(B2018-099),所有研究对象均签署知情同意书㊂1.2样本采集与检测采用黄头采血管(含促凝剂惰性分离胶)采集所有研究对象静脉血5m L,室温静置30m i n,再置于4ħ环境下以1007ˑg离心10 m i n,分离血清后置于-20ħ冰箱中保存待测㊂排除有明显溶血㊁脂血㊁黄疸的样本㊂检测仪器为A u r o r a-1000i全自动化学发光免疫分析仪,购自山东康华生物医疗科技股份有限公司㊂V E G F测定试剂盒内含试剂1㊁试剂2及配套校准品和质控品㊂1.3方法学评价1.3.1重复性验证选取低值(V E G F<160 p g/m L)和高值(V E G F>950p g/m L)的血清样本,各取1m L血清,当日连续重复测定20次,计算其均值(x)㊁标准差(s)及变异系数(C V)㊂因V E G F暂无室间质量评价判断标准,重复性C V符合国家卫生健康委员会临床检验中心室间质量评价标准中公布的肿瘤标志物总允许误差(T E a)的1/4(ɤ6.25%)为符合要求㊂1.3.2中间精密度验证选取1个低值样本(V E G F<160p g/m L)和1个高值样本(V E G F>950㊃285㊃检验医学与临床2024年3月第21卷第5期 L a b M e d C l i n,M a r c h2024,V o l.21,N o.5p g/m L),各取1m L血清,每天重复测定2次,共连续测定5d,计算10次测量结果的x㊁s及C V㊂C V符合国家卫生健康委员会临床检验中心室间质量评价标准中公布的肿瘤标志物T E a的1/3(ɤ8.33%)为符合要求㊂1.3.3正确度验证使用低值和高值国际标准品作为正确度参考品Z1㊁Z2[1],分别平行测定3次,计算x,对检测结果进行分析㊂参考V E G F测定试剂盒说明书,以相对偏差ɤ15%为符合要求㊂1.3.4线性范围验证选用V E G F低浓度(L)样本(40p g/m L)和高浓度(H)样本(3200p g/m L)各1份,1份取2m L,并按5H㊁4Hʒ1L㊁3Hʒ2L㊁2Hʒ3L㊁1Hʒ4L㊁5L的比例混合成6个10m L的混合样本,编号分别为L6㊁L5㊁L4㊁L3㊁L2㊁L1,每个浓度样本重复检测2次㊂根据C N A S-G L037文件[2]规定,以实测值为Y,理论测定值为X,拟合线性回归方程Y= aˑX+b,线性相关系数rȡ0.99为符合要求㊂1.3.5可报告范围验证选取H样本,重复测定3次;将样本用厂家提供的稀释液手动稀释2.5倍㊁5.0倍㊁10.0倍,分别重复测定3次㊂分别计算在不同稀释比情况下的R(R=x/Xˑ100.00%)㊂以110.00%ȡRȡ90.00%,且偏差的绝对值小于的T E a的1/2(<12.5%)时最大的稀释倍数为该试剂盒的最大可信稀释倍数㊂该试剂盒可报告范围下限为线性下限,上限为线性上限ˑ最大可信稀释倍数㊂1.3.6参考范围验证厂家声明的V E G F参考范围为<160p g/m L㊂本实验室抽取20例表观健康人群㊂根据W S/T402-2012:‘临床实验室检验项目参考区间的制定“[3]中小样本验证的规定,所选取的20例样本落在参考限外的测定值不超过两个,可认为引用的参考区间适合本实验室㊂1.3.7干扰验证选取低值样本(V E G F水平为145 p g/m L)和高值样本(V E G F水平为1000p g/m L),各取200μL,分别加入10μL干扰物质(30m g/m L 甘油三酯㊁2m g/m L血红蛋白㊁350μm o l/L胆红素)为实验组,空白样本为对照组㊂同时测定对照组和实验组V E G F水平,依据产品说明书,加入干扰物质后低值样本阴阳性不变,高值样本测值偏差在15%以内为符合要求㊂1.4临床评估分别检测癌症组㊁良性疾病组㊁健康对照组V E G F水平,统计分析3组间水平差异,评估临床应用效果㊂1.5统计学处理采用S P S S24.0统计软件进行数据分析㊂符合正态分布的计量资料以xʃs表示,两组间比较采用t检验;不符合正态分布的计量资料以M(Q1~Q3)表示,多组间比较采用K r u s k a l-W a l l i s H检验㊂绘制V E G F诊断恶性肿瘤的受试者工作特征(R O C)曲线㊂以P<0.05为差异有统计学意义㊂2结果2.1重复性验证低值样本重复检测20次的结果为(133.381ʃ5.849)p g/m L,C V为4.38%;高值样本重复检测20次的结果为(972.146ʃ12.868) p g/m L,C V为1.32%,均满足目标C V(ɤ6.25%),重复性验证通过㊂见表1㊂表1重复性验证结果检测次数低值样本(p g/m L)高值样本(p g/m L)第1次141.43962.29第2次125.99993.21第3次143.19975.73第4次126.65978.48第5次139.49959.53第6次141.39975.32第7次126.74948.51第8次133.16974.59第9次128.67962.41第10次137.96960.87第11次133.50991.19第12次132.91987.31第13次140.82966.58第14次132.37955.75第15次131.90965.62第16次136.24987.44第17次125.69964.91第18次134.77977.74第19次127.33989.59第20次127.42965.85 2.2中间精密度验证低值样本测量10次的结果为(128.914ʃ3.062)p g/m L,C V为2.38%;高值样本测量10次的结果为(960.202ʃ18.142)p g/m L, C V为1.92%㊂均满足目标C V(ɤ8.33%)㊂可判断中间精密度验证通过㊂见表2㊂表2中间精密度验证结果(p g/m L)项目低值样本第1次第2次高值样本第1次第2次第1天127.33127.42962.29993.21第2天131.26132.83975.33953.10第3天131.30126.30937.93958.17第4天126.69132.15967.16965.11第5天130.32123.54927.05962.67 2.3正确度验证溯源到国际标准品的正确度参考品Z1㊁Z2重复检测3次的x分别为162.69p g/m L㊃385㊃检验医学与临床2024年3月第21卷第5期 L a b M e d C l i n,M a r c h2024,V o l.21,N o.5和1971.22p g/m L,与参考品偏差分别为1.43%和-1.45%㊂均在目标偏差范围内(相对偏差ɤ15%)㊂可判断正确度验证通过㊂见表3㊂表3正确度验证结果(p g/m L)编号靶值测值1测值2测值3x允许范围Z1160.39169.26156.69162.13162.69136.33~184.45 Z22000.241957.261985.121971.281971.221700.20~2300.282.4线性范围验证 6份样本的偏差分别为6.20%㊁7.16%㊁1.13%㊁1.40%㊁3.71%㊁2.40%㊂以x为Y,理论预期值为X,拟合一次方程为Y= 1.0238ˑX+5.6029㊂线性相关系数r=0.9996,满足rȡ0.99,见图1㊂磁微粒化学发光法测定V E G F为40~3200p g/m L时呈线性关系㊂见表4㊁图1㊂表4线性范围验证(p g/m L)编号X第1次测定第2次测定xL14041.1343.8242.48L2672718.11722.11720.11L313041323.921313.531318.73L419361980.571945.631963.10L525682643.732683.022663.38L632003256.583296.893276.742.5可报告范围验证稀释比为1.0ʒ5.0样本的偏差为-3.17%,是偏差绝对值<12.5%的样本中稀释倍数最大的,因此,V E G F测定试剂盒的最大可信稀释比为1.0ʒ5.0,可报告范围为40~16000 p g/m L㊂见表5㊂图1线性相关分析图表5不同稀释比下可报告范围验证稀释比靶值(p g/m L)测值1(p g/m L)测值2(p g/m L)测值3(p g/m L)x(p g/m L)R(%)偏差(%) 1.0ʒ1.03200.003148.343128.133111.203129.2297.79-2.21 1.0ʒ2.51280.001307.251340.401313.411320.35103.153.15 1.0ʒ5.0640.00629.77616.23613.21619.7496.83-3.171.0ʒ10.0320.00253.54237.90243.39244.9476.54-23.462.6参考区间验证20个表观健康人群V E G F水平均在说明书声明的参考范围内(<160p g/m L),项目符合率均大于90%,参考区间验证通过㊂2.7干扰验证干扰验证后,低值样本的V E G F水平均仍呈阴性结果(<160p g/m L),胆红素㊁血红蛋白㊁甘油三酯干扰物高值实验组的偏差分别为5.34%㊁2.59%㊁3.08%,小于产品说明书声明的15.0%,对检测结果未产生影响,干扰验证通过㊂见表6㊂表6在不同干扰物干扰下V E G F的测定结果(p g/m L)干扰物干扰低值对照组干扰低值实验组干扰高值对照组干扰低值实验组胆红素142.66128.311023.791079.82 144.49131.121042.471088.16续表6在不同干扰物干扰下V E G F的测定结果(p g/m L)干扰物干扰低值对照组干扰低值实验组干扰高值对照组干扰低值实验组138.91126.311032.971096.84血红蛋白140.34140.481023.031050.71143.96140.531044.061070.15142.38143.191034.071060.50甘油三酯143.06130.211022.091060.84138.29127.761041.811070.40141.65123.311041.741070.08 2.8临床评估癌症组中有55例患者的检测结果为阳性(V E G Fȡ160p g/m L),x为228.58p g/m L;良性疾病组中有5例患者的检测结果为阳性,x为㊃485㊃检验医学与临床2024年3月第21卷第5期 L a b M e d C l i n,M a r c h2024,V o l.21,N o.5102.65p g/m L;健康对照组的检测结果均为阴性,x 为115.73p g/m L㊂3组血清V E G F水平比较,差异有统计学意义(H=83.551,P<0.05),癌症组患者V E G F测定值[228.58(146.37~435.19)p g/m L]显著高于健康对照组[115.73(65.18~132.16)p g/m L]和良性疾病组[102.65(65.22~141.00)p g/m L],差异均有统计学意义(P<0.05)㊂以非癌症组为参照,血清V E G F诊断恶性肿瘤的曲线下面积(A U C)为0.90㊂以试剂盒说明书声明的160p g/m L为最佳截断值时,灵敏度为0.69,特异度为0.95㊂见图2㊂图2 V E G F诊断恶性肿瘤的R O C曲线3讨论V E G F是一种具有血管通透性的同型二聚体糖蛋白[4],在调控血管形成和发育中起关键作用[5]㊂人类V E G F家族包括V E G F-A㊁V E G F-B㊁V E G F-C㊁V E G F-D㊁V E G F-E㊁V E G F-F㊁胎盘生长因子(P L G F)及内分泌腺衍生的V E G F(E G-V E G F)㊂临床上通常所说的V E G F往往指V E G F-A,其在新生血管生成中发挥重要作用,可引起细胞增殖㊁抑制细胞凋亡㊁血管通透性增加㊁血管舒张㊁炎症细胞向损伤部位募集等[6]㊂而恶性肿瘤不断进展,生长到超出预先存在的脉管系统范围的器官组织,就会诱导新生血管形成以促进其进一步发生㊁发展㊂因此,血管异常被认为是恶性肿瘤的标志之一[7]㊂已有部分研究显示血清V E G F可作为恶性肿瘤的诊断和预测预后的指标[8-9],乳腺癌[10]㊁宫颈癌[11]㊁原发性肝癌[12]等恶性肿瘤患者均有V E G F水平升高的现象㊂目前对于V E G F的检测一般采用酶联免疫吸附实验㊁荧光层析法㊁化学发光法等,但这些方法都存在一定不足,如检测时间长㊁灵敏度低等问题㊂本研究采用磁微粒化学发光法检测V E G F水平,将双抗体夹心法免疫测定原理与超顺磁性纳米微球标记技术和化学发光免疫分析相结合,定量检测人血清样本中的V E G F水平㊂结果显示,磁微粒化学发光法检测血清V E G F的重复性㊁中间精密度㊁正确度㊁线性范围㊁可报告范围㊁参考区间㊁干扰物质影响下准确度均通过了验证㊂已有部分研究证明,血清V E G F诊断肺鳞癌[13]㊁结直肠癌[14]的灵敏度较高㊂本研究结果显示,相比于良性病变患者及健康人群,恶性肿瘤患者血清V E G F 水平显著升高,V E G F诊断恶性肿瘤的灵敏度为0.69,特异度为0.95,A U C为0.90,提示血清V E G F 对于恶性肿瘤有着较高的筛查价值㊂C H I N等[15]在2003年就提出血清V E G F水平升高是结直肠癌患者术后复发的独立危险因素,并且T K A C Z等[16]也提出在恶性肿瘤早期,V E G F水平在患者血清中升高㊂本研究结果也发现,癌症组患者V E G F水平显著高于健康对照组和良性疾病组(P<0.05),这初步提示可以将血清V E G F作为诊断恶性肿瘤的辅助指标,结合患者影像学及其他肿瘤标志物,将有助于进一步提高诊断恶性肿瘤的特异度和灵敏度㊂本研究也存在一定局限性㊂(1)入组样本数较少,尚需进一步入组更多临床样本,探讨V E G F在恶性肿瘤鉴别诊断中的价值;(2)未收集患者随访数据,在后续研究中笔者将补充癌症组临床资料,评价V E G F在预测疾病预后中的价值㊂综上所述,本研究所采用的磁微粒化学发光法检测V E G F水平不仅成本低㊁操作简单,且灵敏度高㊁稳定性好,适合临床常规工作,对于协助恶性肿瘤的诊断有一定价值㊂参考文献[1]R O B I N S O N C J,D A S R G,S T AMM E R S R,e t a l.T h ew o r l d h e a l t h o r g a n i z a t i o n r e f e r e n c e r e a g e n t f o r v a s c u l a re n d o t h e l i a l g r o w t hf a c t o r,V E G F165[J].G r o w t h F a c t o r s,2006,24(4):285-290.[2]中国合格评定国家认可委员会.临床化学定量检验程序性能验证指南:C N A S-G L037[S].北京:中国合格评定国家认可委员会,2019[3]中华人民共和国卫生部.临床实验室检验项目参考区间的制定:W 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兔血管内皮生长因子（VEGF)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定兔血清，血浆及相关液体样本中血管内皮生长因子（VEGF)的含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中兔血管内皮生长因子（VEGF)水平。

用纯化的血管内皮生长因子（VEGF)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中加入血管内皮生长因子（VEGF)，再与HRP标记的血管内皮生长因子（VEGF)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的血管内皮生长因子（VEGF)呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中兔血管内皮生长因子（VEGF)的含量试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：675ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

人血管内皮细胞生长因子D(VEGF-D)酶联免疫试剂盒使用说明书【产品编号】CSB-E04760h【预期应用】ELISA法定量测定人血清、血浆、组织裂解液中VEGF-D含量。

【产品性能指标】1、检测范围：31.25 pg/ml-2000 pg/ml2、灵敏度：7.81 pg/ml3、精密度：批内差CV%<8%，批间差CV%<10%4、特异性：本试剂盒特异性检测人VEGF-D，且与其他相关蛋白无交叉反应。

【实验原理】用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗VEGF-D抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗VEGF-D抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。

TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样本中的VEGF-D呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样本浓度。

【试剂盒组成成分】【存储条件及有效期】【所需试剂和器材】标准规格酶标仪；高速离心机；电热恒温培养箱；干净的试管和离心管；容量瓶；系列可调节移液器及吸头；多通道移液器；蒸馏水等【样本采集及保存】1、血清：全血标本请于室温放置2小时或4°C过夜后于2 - 8°C 1000 x g离心15分钟，取上清即可立即检测；或进行分装，并将标本放于-20°C或-80°C保存，但应避免反复冻融。

解冻后的样品应再次离心，然后检测。

2、血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8°C 1000 x g离心15分钟，取上清即可立即检测；或进行分装，并将标本放于-20°C或-80°C保存，但应避免反复冻融。

解冻后的样品应再次离心，然后检测。

3、组织裂解液：取100mg组织，用1X PBS洗去血污。

剪成小块放入组织研磨器（匀浆管）中，加入1 ml 1X PBS，制成匀浆，然后置于-20°C过夜。

大鼠血管内皮生长因子受体（VEGFR)酶联免疫分析试剂盒利用说明书本试剂盒仅供研究利用。

检测范围：48T70 ng/L -2400 ng/L利用目的：本试剂盒用于测定大鼠血清、血浆及相关液体样本中血管内皮生长因子受体（VEGFR)含量。

实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠血管内皮生长因子受体（VEGFR)水平。

用纯化的大鼠血管内皮生长因子受体（VEGFR)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入血管内皮生长因子受体（VEGFR)，再与HRP标记的血管内皮生长因子受体（VEGFR)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，通过完全洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的血管内皮生长因子受体（VEGFR)呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠血管内皮生长因子受体（VEGFR)浓度。

标本要求1．标本搜集后及早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。

假设不能马上进行实验，可将标本放于-20℃保留，但应幸免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可依照以下图表在小试管中进行稀释。

2.加样：别离设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。

在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。

加样将样品加于酶标板孔底部，尽可能不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用5.洗涤：警惕揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。