大肠杆菌病的实验室诊断之病料中细菌的分离培养.ppt

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3．结果 产酸产气时，可使培养基的指示 剂变色，并可在发酵管内顶端出现气泡； 只产酸时仅见发酵管内培养基颜色改变， 不见气泡；不分解者无反应。如大肠杆菌 分解乳糖产酸产气；用“㈩”表示，金黄 色葡萄球菌虽能分解乳糖，但产酸不产气， 用“+”表示；马流产沙门氏杆菌不能分解 乳糖，用“一”表示。
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实验三 肠道菌的分离培养与鉴定
目的要求： 1．熟悉选择和鉴别培养基的原理； 2．了解大肠杆菌的主要培养特性； 3．熟悉大肠杆菌和沙门氏菌的常规鉴定方
法；
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基本原理
肠道菌大多为革兰氏阴性小杆菌，
采用一般染色和分离培养难以鉴别，故须
采用鉴别和生化试验培养方能鉴定。不同
种类的肠道菌，产生的酶类及活性不同。
培养方法，其原则在于使被检材料充分分 散，以便经过培养后得到单个菌落，并可 对菌落的形态、颜色、溶血与否等进行观 察。
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术式
右手似持毛笔的姿势持接种棒的塑料柄处， 将接种环伸人酒精灯火焰中烧至通红，再 缓慢将接种棒其余金属部分均加以烧灼， 准备蘸取材料；左手取琼脂平板，琼脂面 与水平面成45°角，接种环同培养基平面 也成45°角。靠近酒精灯火焰操作。
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2．方法
将需要鉴别的肠道菌（大肠杆菌和沙门氏 菌）或含肠道菌的病料，在康凯琼脂培养 基上划线分离，37℃培养24h观察。使之得 到单个菌落。
3．结果 大肠杆菌在此培养基上形成红色 菌落，沙门氏菌形成无色或浅黄色菌落。
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（二）SS琼脂培养基分离培养
1．原理 此培养以中性红作批示剂，其中 还有胆盐硫代硫酸钠，构椽酸钠，煌绿等 等抑制G+的生长，对大肠杆菌了有一定的 抑制作用，只有少数生长。培养基中含有 乳糖，在大肠杆菌能分解乳糖，产酸，指 示剂显红色（5.0-7.4 红—黄），故大肠杆 菌呈红色菌落，而沙门氏菌不能分解乳糖， 没能使培养基变酸呈黄色菌落。

结果判定
鲜桃红色或微红色，菌 落中心呈深桃红色
圆形，扁平，边缘整齐， 表面光滑，湿润
二、药敏试验
方法：取一菌种，用灭 菌的接种环致密划线 于琼脂表面（可重复 来回划线），用无菌 镊子，将各种抗菌药 物圆纸片，分别贴于 培养基表面。各片距 离相等，370C，24h 后，观察结果。
药敏结果判定
结果：培养液不变色----无变化（—）
培养液变为黄色----产 酸（+） 培养液变黄并有气泡----产酸产气（+）
2 硫化氢试验
原理：某些细菌能分离蛋白质中的含硫氨基酸， 生成硫化氢，遇培养基中的铅盐或铁盐，形成黑 色的沉淀物。
方法：将需要鉴别的细菌纯培养物，分别接种在 硫化氢培养基中，370C温箱内培养24h
目的要求
熟悉鉴别培养基的原理 了解大肠杆菌的主要生理生化特性
一、鉴别培养
菌种 培养基类别 麦康凯培养基
大肠杆菌
红色菌落
沙门氏杆菌
无色或浅黄色菌落
SS琼脂培养基
红色菌落浅黄色菌落来自伊红美兰琼脂培养基三塘铁培养基
紫红色或紫黑色并带有金 粉红色菌落 属光泽菌落
斜面和深层均为红色
斜面为红色；深层为黄色； 若产生H2S，为黑色
分离鉴定---麦康凯培养基
原理：在培养基中含有胆盐，可抑制大部分革兰氏阳性菌 的生长，培养基含乳糖，大肠杆菌能分离乳糖，使pH下 降（中性指示剂5.5--7.5，红--黄）形成红色菌落，而沙 门氏菌和志贺氏菌，不能分解乳糖，菌落小且为无色
术式
两试管斜面移植时，左手斜持菌种管 和被接种管，管口相齐，管底放在拇指和食 指间，松动两管棉塞，将管口进行火焰灭菌， 使其靠近火焰，将接种环深入管内，先在无 菌生长的培养基上接触使之冷却，再挑取少 量的细菌后，拉出接种环，立即伸入另一管 斜面培养基上，勿碰到斜面和管壁，直达斜 面底部，从底部开始划曲线，向上到斜面顶 端，管口火焰灭菌，塞好棉塞，接种完毕。 接种环火焰灭菌后，放下接种棒最后在斜面 管壁上注明日期、接种者。置370C，温箱培 养

2、成分
水、碳源、氮源、 无机盐、生长因子
(生长因子即细菌生长必需，而自身不能合成的 化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)
不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方
调节pH
真菌：5～6 细菌：6.5 ～ 7.5
有时会加一定量的氯化钠以维持一定的渗透压
四、无菌操作
1.无菌操作的概念
无菌操作杂泛菌指在培养微生物的操作中，所有防止________污染的方法。
每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下 一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的 增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。
2、在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？ 为什么？
划线结束后灼烧接种环，及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和 感染操作者。
大肠杆菌在人体的_____中一肠般道对人体无害，但任何 大大肠肠杆杆菌菌如是_果_进__入_____工__程__中_被__广_泌都泛尿会采系对用统人的体工产具生。危害。
基因
质粒、 EcoRⅠ限制酶、
E.coli-DNA连接酶、
受体细胞
菌落的概念
菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量生长 繁殖时，所形成的肉眼可见的具有一定形态结构 的子细胞群体。
天然培养基：
天然培养基有血清、 血浆、和组织提取液 （如鸡胚和牛胚浸 液）。 优点：营养成分丰富， 培养效果好 缺点：来源受限;成分 复杂，影响对某些实 验产物的提取和实验 结果的分析;易发生支 原体污染;
人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和 繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。
主要包括：
_各__种__器__具__必须无菌、 __培__养__基___也必须要无菌、 ___________时不能带入其他杂菌

总结词
培养基是培养和繁殖微生物的重要物质，制备培养基的过程需要精确控制各种成 分的比例和条件。
详细描述
在制备培养基时，需要选择适合大肠杆菌生长的营养物质，如碳源、氮源、水、 无机盐等，按照规定的比例混合，调节pH值，并进行灭菌处理，以确保培养基 的质量和安全性。
大肠杆菌的接种和培养
总结词
将纯化后的大肠杆菌接种到培养基中，控制适当的温度和湿 度等条件，促进其生长繁殖。
在实验过程中，应严格控制实 验条件，确保无菌操作，避免
污染。
对于菌种的来源和纯度，应进 行质量检查，确保实验结果的
准确性和可靠性。
在培养过程中，应定期观察并 记录菌落的生长情况，以便更 好地了解大肠杆菌的生长特性
。
可以尝试采用不同的培养基和 培养条件，以获得更优质的大
肠杆菌培养物。
对大肠杆菌培养和分离的实际应用思考
详细描述
在接种大肠杆菌时，需要将纯化后的大肠杆菌稀释并接种到 培养基中，然后将其放置在恒温摇床或恒温箱中进行培养。 在培养过程中，需要控制温度、湿度、气体浓度等条件，以 确保大肠杆菌的正常生长繁殖。
大肠杆菌的分离纯化
总结词
通过特定的分离纯化技术，将大肠杆菌从其他杂菌和杂质中分离出来，获得纯度较高的 菌株。
数据分析
对实验过程中记录的数据进行整 理和分析，得出大肠杆菌的生长
曲线、生长速率等参数。
结果对比
将实验结果与理论值进行比较， 分析实验误差产生的原因，提高
实验的准确性和可靠性。
实验讨论
根据实验结果，讨论大肠杆菌的 培养和分离过程中可能存在的问 题和改进措施，为后续实验提供
参考。
05 结论与思考题
实验结论总结
培养基成分

一、微生物的基础知识
1、微生物
(1)定义 (2)种类 (3)用途
病毒 细菌 放线菌 真菌 原生动物
2、菌落
（1）概念 （2）菌落是鉴定菌种的重要依据。
菌落
细菌的菌 落特征因 种而异
3、培养基
（1）成分 细菌培养：蛋白胨、酵母提取液、氯化钠
霉菌培养：无机物或添加蔗糖的豆芽汁
（2）种类
凝固剂
作用
固体培养基
琼脂
分离(纯化)细菌、 保存菌种
液体培养基
扩大培养细菌
液体培养基：
表面生长
均匀混浊生长
沉淀生长
固体培养基：菌落，菌苔
4、生活环境
霉菌：中性偏酸 细菌：中性偏碱
二、无菌技术 1.无菌操作的目的
防止培养基被其他微生物污染 (及避免操作者被微生物感染)
2、无菌技术包括 (1)将实验器具和培养基：高压蒸汽灭菌
(2)接种环(针)、试管口: 灼烧 灭菌
(3)实验操作空间：酒精+紫外线 消毒 （接种室(箱)、超净工作台） (4) 双手: 酒精 消毒
(5) 实验操作应在 酒精灯火焰 旁进行 (6)避免已灭菌处理的材料用具与 周围物品 相接触。
(7)棉塞(封口膜):只让空气通过，而空 气中的微生物不能通过。
灼烧灭菌
1、划线分离法
2、涂布分离法
2、涂布分离法
四、大肠杆菌的培养和分离 1、大肠杆菌
(1)特性： 革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌
(2)用途： 基因工程技术中被广泛采用的工具
2、培养：在LB液体培养基上扩大培养
3、分离
灭菌 ↓
倒平板 ↓培养 ↓划线 Nhomakorabea离LB液体和固体培养基及培养皿高压 蒸汽灭菌

2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭 菌。如果需要，请选择合适的方法。
（1） 培养细菌用的培养基与培养皿 （2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3） 实验操作者的双手
答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。
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四、大肠杆菌的培养和分离
1、大肠杆菌 （1）特性：
革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌 （2）用途：
的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以
便得到单菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时
杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和
感染操作者。
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2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却 后再进行划线？
以免接种环温度太高，杀死菌种。
3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什 么总是从上一次划线的末端开始划线？
焰上灼烧，待刮刀冷却后，在酒精灯旁打开培养皿，
将菌液涂布到整个平面上。
4) 培养
将培养皿倒置，在37℃恒温箱中培养24~48h。
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1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物 被其他外来微生物污染外，还有什么目的？
答：无菌技术还能有效避免操作者自 身被微生物感染。
具体措施：牛奶在62.8摄氏度下30分钟。
优点：最大限度地保持了牛奶的品质，颜 色，味道和营养。
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(b)灭菌：
1）灼烧灭菌
接种环、玻璃刮刀 试管口
2）高压蒸气灭菌： 1kg/cm2压力、121℃、15min
培养皿、试管、三角瓶、取样器的头、移液管、 三角刮刀、接种环、镊子、无菌水、培养基
致病微生物的过程。

大肠杆菌病的实验室诊断
疑似病例病料中细菌的形态学检查 和分离培养
实验目标
• 病料中细菌的形态学检查实验目标： – 通过观察病料中是否有菌，从而初步判断病料是否 取自细菌感染病例。 – 若病料中有菌，根据细菌形态初步鉴定其种类
• 病料中细菌的分离培养实验目标： – 用鉴别培养基分离培养后，看是否得到菌落。若有 菌落生长，则根据菌落特征进一步鉴定细菌种类。
可能出现的镜检结果示例
若出现如右图所示 的镜检结果，则初 步诊断病料中细菌 可能是大肠杆菌：
菌体为中等大小直 杆菌，散在或成对 排列
病料中细菌的分离培养方法
1 无菌操作从病料中取菌 2 平板划线接种 3 培养
• 将烙刀灼烧灭菌，用其将病料表面 烧烙灭菌并切开一小口，然后用灭 菌接种环从切口插入组织中转动取 菌，烙刀和接种环用完需灼烧灭菌 后再放回原处。
病料中细菌的形态学检查方法
1 触片 2 干燥 3 固定 4 美兰染色
• 镊子、剪刀在酒精灯火焰上烧灼灭菌，用镊子夹持、剪刀剪取小块 病料组织，以其新鲜切面在玻片上轻触3~5个压迹。
病料中细菌的形态学检查方法
1 触片
2 干燥
3 固定
4 美兰染色
• 室温下自然干燥或将标本片 的涂面向上，置酒精灯火焰 高处微烤加热干燥，至涂面 上无水为止。
病料中细菌的分离培养方法
1 无菌操作从病料中取菌 2 平板划线接种 3 培养
• 倒置37℃温箱中，培养18～24h观察结果
可能出现的分离培养结果示例
伊红美兰培养基（大肠杆 菌：紫黑色带金属光落）
SS培养基（大肠杆菌：红 色菌落或不生长）
病料中细菌的形态学检查方法
1 触片 2 干燥 3 固定 4 美兰染色

菌落：
单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就 会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子 细胞群体，叫做菌落。
菌落是鉴定菌种的 重要依据。
大肠杆菌菌落
不 同 细 菌 菌 落 不 同
实验一 大肠杆菌的培养 与分离
实验内容：
1 细菌培养：将大肠杆菌接种到LB液体培 养基扩大培养。 2 细菌分离：将大肠杆菌从液体培养基中 接种到LB固体培养基，形成单菌落。目 的为了分离纯化。
使用步骤： 先加热排气 再达压力后灭菌15min 后关闭电源，冷却，待锅内外压 力相同时才能打开。
高压蒸汽灭菌法
高压蒸汽灭菌法为湿热灭菌法，其优点有三： 1、湿热灭菌时菌体蛋白容易变性； 2、湿热穿透力强； 3、水蒸汽变成水时可放出大量热增强杀菌效果， 因此，它是效果最好的灭菌方法。
灭菌的方法
1、高压蒸汽灭菌（最常用）
2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后 再进行划线？
答：以免接种环温度太高，杀死菌种。
3.在作第二次以及其后的划线操作时，为 什么总是从上一次划线的末端开始划线？
答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起 始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能 使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少， 最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
培养基冷却到60度时倒入
2 培养基的分装（试管，三角瓶，培养皿）
倒 入 三 角 瓶 和 试 管
（漏斗法）
1.培养基灭菌后，需要冷却到60 ℃左右时， 才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的 温度？
答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶， 感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可 以进行倒平板了。
搁置固体斜面培养基
菌种的保存
1、临时保藏： 接种到固体斜面培 养基，菌落长成后 置于4℃冰箱保存。