兔支气管败血波氏杆菌检测方法的建立及应用

兔支气管败血波氏杆菌病汇报人：日期:contents •引言•病原学•临床症状与诊断•预防与控制•治疗措施•案例分析•结论与展望目录引言01CATALOGUE疾病背景兔支气管败血波氏杆菌病是一种由支气管败血波氏杆菌引起的呼吸道疾病，是养兔业中常见的传染病之一。

该细菌是一种革兰氏阴性小杆菌，具有荚膜和芽孢，通过空气、飞沫和直接接触传播。

感染兔支气管败血波氏杆菌病的兔子可能会出现咳嗽、呼吸困难、打喷嚏、鼻腔流出脓性分泌物等症状。

病兔可能会出现食欲不振、精神萎靡、体重减轻等症状，严重时可能导致死亡。

疾病症状该病可通过空气传播，病兔咳嗽、打喷嚏时，病菌会随着飞沫和尘埃传播给其他兔子。

直接接触传播，如病兔与健康兔直接接触，或健康兔接触到病兔的排泄物、分泌物等也可能会被感染。

此外，该病菌还可以通过带菌兔、污染的饲料、饮水等媒介进行传播。

疾病传播途径病原学02CATALOGUE培养特性需氧型，营养要求严格，在普通培养基上不能生长，在添加了血清、卵黄和青绿霉素等的选择性培养基上生长良好。

抗原结构具有O、H和K三种抗原。

形态为革兰氏阴性小杆菌，大小为0.5-1.0μm×0.2-0.4μm。

病原特征致病物质主要产生毒素、酶和荚膜等致病物质。

感染途径通过呼吸道感染，也可通过消化道感染。

易感动物家兔最易感，其次为野兔和豚鼠。

细菌致病性030201对理化因素抵抗力不强，对常用消毒药敏感。

抵抗力可通过污染的饲料、饮水和用具等传播，也可通过带菌动物传播。

传播途径细菌对环境的适应性临床症状与诊断03CATALOGUE临床症状急性型病兔食欲不振，精神沉郁，呼吸困难，流黏液性鼻涕，有时出现咳嗽、喘气，有啰音。

多数病兔在出现症状后1-2天内死亡。

慢性型病兔食欲减退，精神不振，消瘦，流黏液性或脓性鼻涕。

病兔常常出现腹部膨胀，被毛粗乱，病程较长，可持续数月，有的甚至一年以上。

诊断方法临床诊断根据病兔的临床症状和病理变化可做出初步诊断，但需要注意与其他呼吸道疾病进行鉴别诊断。

兔支气管败血波氏杆菌fimN基因的克隆表达及快速检测方法的建立兔支气管败血波氏杆菌病是由支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)引起的一种家兔呼吸道传染病,常呈地方性流行,多为慢性,急性败血性死亡较少。

该病病程长,反复发生,难治愈,给养兔业带来了严重的的经济损失。

Bb的菌毛蛋白兼具毒力因子及免疫原的特性,其免疫原性已被证实。

对fimN基因进行克隆表达和免疫原性分析,以重组蛋白为检测抗原建立间接ELISA诊断方法,为兔波氏杆菌临床快速检测和研制高效疫苗奠定良好的基础。

本研究一共分为四部分内容,第一部分采用PCR技术扩增并克隆兔支气管败血波氏杆菌的fimN基因；第二部分以大肠杆菌原核pET-28a(+)为表达系统进行fimN 基因的表达、纯化及表达蛋白免疫原性分析；第三部分是兔支气管败血波氏杆菌PCR检测方法的建立；第四部分是兔支气管败血波氏杆菌间接ELISA诊断方法的建立。

根据兔支气管败血波氏杆菌菌毛蛋白的fimN基因序列,设计一对特异性引物,扩增出648bp的目的基因片段,将产物与pMD-19T载体连接,阳性质粒经双酶切和测序鉴定,结果表明,扩增的fimN基因与参考序列同源性可高达99%,成功构建了克隆载体。

对pMD19T-fimN以及表达载体pET-28a(+)双酶切,连接转化后,获得重组质粒pETBb-fimN,双酶切和序列鉴定结果表明目的基因的插入位置和方向正确,加入IPTG诱导后经SDS-PAGE检测得到的目的蛋白大小约为27KD, Western blot检测结果显示,表达的蛋白能与Bb全菌阳性血清发生特异性结合,为后续的以重组fimN蛋白为包被抗原来建立间接ELISA快速诊断方法奠定基础。

根据GenBank 中支气管败血波氏杆菌fimN基因的短片段序列设计了一对特反应,且检出最低浓度为10pg,说明该方法敏感性高,特异性强,可用于临床检测。

以表达并纯化的fimN蛋白为包被抗原,用fimN蛋白免疫实验兔制备血清作为阳性血清。

兔波氏杆菌病的实验室诊断作者：邵立岩来源：《现代畜牧科技》 2015年第11期邵立岩（辽宁省丹东市宽甸县八河川动物卫生监督管理所 118225）兔波氏杆菌病又称为支气管败血波氏杆菌病，引起兔的一种以慢性鼻炎、支气管肺炎及咽炎为特征的呼吸道传染病。

1 病原学诊断1.1 细菌培养样品采集：病兔，将灭菌棉拭子在无菌生理盐水中浸湿，插入病兔鼻腔内，深约10mm，小心转动，蘸取鼻汁；死亡兔或扑杀致死兔，取鼻腔、气管、肺部病变材料用于细菌分离培养。

细菌分离：将附着在棉拭上的黏液涂抹在麦康凯培养基或DHL培养基上，37℃培养48h。

肺部病变材料进行培养时，还可用血液琼脂培养基。

结果判定：在改良麦康凯培养基上，支气管败血波氏杆菌菌落直径约1~2mm，圆整、光滑、隆起、透明，略呈茶红色，较大菌落中心厚，呈茶黄色。

在DHL琼脂平皿上形成无色半透明，2mm左右菌落。

1.2 病原鉴定生化试验:不发酵碳水化合物，葡萄糖、荒糖、乳糖、甘露醇、果糖木糖呈碱性反应。

M.R.试验、靛基质试验、硫化氢产生阴性，V-P试验、枸橼酸盐利用、尿素酶产生、硝酸盐还原、运动力试验阳性。

动物接种试验:常选用幼兔或豚鼠，鼻内接种4h培养物0.1mL，应在几天内出现鼻炎和肺脓肿的典型症状和病理变化。

0.5mL剂量耳静脉接种家兔，应于24~48h内死亡。

从死亡兔的病变组织及扑杀的活兔的肺脏中均可分离到本菌。

血清平板凝集反应:在清洁的玻片上加一滴阳性血清（约0.3mL），充分混入一铂圈被检菌，轻轻晃动玻片，室温下放置2min。

液滴中出现大凝集块或小的粒状凝集物，液体透明，判为阳性。

每次试验应设有阴性血清对照和缓冲生理盐水对照。

结果判定：液滴中出现大凝集块或小的颗粒状凝集物，液体透明，判为阳性。

免疫荧光检测抗原:应用直接荧光抗体技术，检查鼻甲骨、气管、细支气管及肺脏上皮细胞，观察到颗粒样抗原者判为阳性。

该试验一般在感染后7~28天即可检出抗原。

2 血清学诊断2.1 凝集反应将Ⅰ相菌接种到胰蛋白酶大豆肉汤中，37℃培养24~48h，加福尔马林灭活，作为抗原。

兔支气管败血波氏杆菌的临床诊断作者：朴香丽尹洪哲董亮来源：《经济技术协作信息》 2017年第34期朴香丽尹洪哲董亮兔支气管败血波氏杆菌（Bordetellabornchispetica,Bb）也称支气管鲍特杆菌或博德特氏杆菌，属于波氏杆菌属。

波氏杆菌是由 Ferry 于１９１０年首次分离。

近些年来Ｂｂ在自然界中很广泛的分布着，其易感动物除了兔以外，啮齿类、家畜、人等多种哺乳动物上呼吸道也会寄生本病菌，并且相互可以传染。

由波氏杆菌引起的呼吸系统疾病一般在春秋两季气温多变的季节多发。

支气管败血波氏杆菌，革兰氏染色阴性，呈小球杆状，单在或成双排列。

无芽孢，最适生长温度３５－３７℃，需氧或兼性厌氧。

初分离有荚膜，有鞭毛。

营养要求不高，在普通琼脂平板、血液琼脂平板、麦康凯琼脂平板等培养基上均能生长。

兔支气管败血波氏杆菌病是家兔养殖中常见的呼吸道传染病，以引起哺乳仔兔和断奶仔兔的急性死亡，成年兔的鼻炎、支气管炎和脓疱性肺炎为主要特征。

仔幼兔患病多取急性经过，病初从鼻腔流出少量浆液性鼻液，很快发展成粘液性或脓性鼻液，继而出现呼吸困难，迅速死亡，病程仅２－３ｄ。

成年兔患病通常表现两种临床症状：一是鼻炎型，病兔鼻腔粘膜充血，鼻孔流出多量浆液性或粘液性鼻液，多不见脓性；二是支气管肺炎型，病兔鼻炎长期不愈，鼻腔经常流出粘液性或脓性分泌物，打喷嚏，呼吸急促，食欲不振，渐进性消瘦。

哺乳母兔患病主要表现咳嗽，呼吸困难，精神萎靡，食欲减退甚至废绝，以及被毛粗乱，发病３－４ｄ后，多以死亡告终。

该病通常会给养兔业带来很大的经济损失。

一、材料与方法１.实验动物。

2013 年 8 月龙井市来延边大学动物医院就诊的病例，四只病死兔。

２.试验用培养基及试验用药品。

普通琼脂培养基，麦康凯培养基、肉汤培养基，尿素酶培养基、枸橼酸盐培养基，糖（醇）类发酵管、蛋白胨水；细菌生化微量反应管；革兰氏染液、美兰染液及药敏纸片均购自青岛海博生物试剂有限公司。

兔多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌复合PCR方法的建立及临床应用范志宇;魏后军;胡波;宋艳华;王芳;薛家宾;徐为中;苏国清【摘要】根据GenBank中多杀性巴氏杆菌ATP合成酶基因(atpB)的保守序列设计特异性引物,建立巴氏杆菌PCR检测方法,并与已建立的支气管败血波氏杆菌PCR检测方法进行合并,经反应条件的优化,成功建立多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌复合PCR诊断方法.该方法检出的最小多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌菌数分别为40 CFU和4 CFU;对兔源产气荚膜梭菌、大肠杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪鼻支原体、链球菌的检测结果均为阴性,说明该方法具有良好的特异性.用该方法对中国4个省份采集的临床鼻拭子样本共712份进行检测,结果显示,多杀性巴氏杆菌阳性率为25.56％,支气管败血波氏杆菌阳性率为34.55％,双阳性率为13.20％.该复合PCR方法能快速、敏感地从家兔鼻拭子样品中检出多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌,为临床疾病检测和流行病学调查提供了技术保障.【期刊名称】《江苏农业学报》【年(卷),期】2015(031)002【总页数】6页(P376-381)【关键词】兔支气管败血波氏杆菌;多杀性巴氏杆菌;复合PCR【作者】范志宇;魏后军;胡波;宋艳华;王芳;薛家宾;徐为中;苏国清【作者单位】江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京210014【正文语种】中文【中图分类】S858.291.51+2兔多杀性巴氏杆菌病,又称兔出血性败血病,是由多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)引起的一种在家兔生产中广泛存在而且危害性较大的呼吸道传染病。

兔支气管败血波氏杆菌的分离鉴定及某些生物学特性研究支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica，Bb）是引起多种哺乳动物呼吸道隐性感染及急、慢性炎症的病原菌，病兔临床上以发生鼻炎，出现打喷嚏和呼吸困难，从鼻腔流出浆液、粘液性分泌物为特征。

支气管败血波氏杆菌与百日咳波氏杆菌（B．pertussis）、副百日咳波氏杆菌（B．parapertussis）列为一群，将包括禽波氏杆菌（B．avium）在内的其余四种归为另一群，列于革兰氏阴性好氧杆菌和球菌，博德特氏菌属（Bordetella Moreno-Lopez，1952）。

近年来，随着我国规模化养兔业的发展，支气管败血波氏杆菌感染明显增加，并常与多杀性巴氏杆菌、葡萄球菌等混合感染，已成为兔业养殖中发病率和死亡率增加的重要原因之一，给养兔业造成重大的经济损失。

本研究从Bb的分离和鉴定、病例的复制、菌相免疫学和粘附特性四个方面进行了系统的研究，结果如下：1、兔支气管败血波氏杆菌的分离与鉴定：2005年10月～2006年12月间，通过对江苏南京地区4家实验兔场和山东淄博1家商品兔场有鼻炎症状的患兔鼻腔分泌物进行兔支气管败血波氏杆菌的分离鉴定，了解支气管败血波氏杆菌在兔群中的感染情况，并对该菌的某些生物学特性进行研究。

共采集有明显鼻炎症状的194份患兔鼻腔分泌物，分离出56株支气管败血波氏杆菌，分离率为17.87％～39.39％，平均分离率28.86％，结果显示支气管败血波氏杆菌是引起家兔鼻炎的重要病原菌，分离率较高，该病的发生与季节具有一定的相关性，分离菌具有特定的生长特性、形态特性、生化反应特性和对抗生素的敏感特性。

2、支气管败血波氏杆菌人工感染动物模型的建立：对鉴定后的19株支气管败血波氏杆菌进行了ICR小鼠毒性比较研究，并以此为基础进行了分离菌对兔致病性差异研究；用BJL0504菌株（Ⅰ相菌）以不同攻毒途径对30～40日龄兔进行致病作用比较研究；用冻干保存的3株强毒力菌株以静脉注射途径攻毒家兔，根据致病性筛选毒力稳定的菌株作为疫苗候选株。