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分⼦标记介绍分⼦标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋⽩质。
即DNA⽚段即能反映⽣物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA ⽚段；能受基因控制并且能够稳定遗传的，能代表个体或群体的遗传特征，并可被⽤作遗传分析的物质。
它能够直接反映基因组间DNA间的差异。
常⽤的分⼦标记有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR、EST等。
RAPD、AFLP属于以PCR为基础的分⼦标记；RFLP属于以Southern为基础的分⼦标记；SSR、ISSR属于以重复序列为基础的分⼦标记；EST以mRNA为基础的分⼦标记。
1 主要的分⼦标记介绍1.1 限制性⽚段长度多态性（RFLP）RFLP是应⽤Southern杂交技术检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA⽚段的⼤⼩。
所以对于引起酶切位点变异的突变如点突变或部分DNA⽚段的缺失、插⼊、倒位⽽引起酶切位点缺失或获得等均可应⽤。
此⽅法的基本步骤包括：DNA的提取、⽤限制性内切酶酶切DNA、凝胶电泳分开DNA⽚段、把DNA⽚段转移到滤膜上、利⽤放射性标记的探针显⽰特定的DNA⽚段、分析结果。
探针⼀般选择单拷贝的。
其优点为共显性标记，稳定且可重复但耗时，昂贵且需应⽤同位素。
⽤该技术可作出植物的RFLP图谱，并应⽤于植物遗传和育种研究。
杨长红等采⽤PCR-RFLP技术，对库尔勒⾹梨等19个主要梨品种的cpDNA遗传多态性进⾏研究，其利⽤10对通⽤引物对总DNA进⾏扩增，并且采⽤7种限制性内切酶对PCR产物进⾏酶切，通过软件分析得出：7对引物（cp01、cp02、cp03、cp04、cp06、cp09、cp10）能在梨属植物上扩增出1条特异性谱带，cp09／MvaI，cp03／Hin6I的酶切位点有显著差异。
根据结果分析，库尔勒⾹梨与鸭梨、砀⼭梨、苹果梨、早酥、慈梨、⾦川雪梨、锦丰、新疆句句梨的平均距离系数较⼩，与其他梨的平均距离系数较⼤。
1.2 随机扩增多态性DNA(RAPD)RAPD是以8-10个碱基的随机寡聚核苷酸序列为引物，利⽤PCR技术⾮特异性扩增DNA⽚段，然后⽤凝胶电泳分开扩增⽚段，即得到⼀系列多态性DNA⽚段.染⾊后即可进⾏多态性分析。
遗传学中的分子标记技术遗传学是研究遗传现象的一门学科，而分子标记技术则是其中的一个重要领域。
它不仅可以帮助我们研究物种间的遗传联系，还可以应用于医学和农业领域，为人们的生活带来更多便利和进步。
本文将介绍遗传学中的分子标记技术，探讨其在实践中的应用以及未来的发展方向。
一、分子标记技术简介分子标记技术是利用分子水平的遗传标记对个体、品系或群体进行鉴别、分类、分子配对等分析的一种技术。
目前常用的几种分子标记技术包括限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性（RAPD）、序列标记位点（SSR）和单核苷酸多态性（SNP）等。
RFLP技术是一种基于DNA序列限制性切割位点的分析方法。
通过将基因组DNA切成不同的长度片段，然后对这些片段进行电泳分离，最后通过DNA探针的帮助确定特定位点的DNA序列。
RAPD技术则是一种无需事先知道DNA序列的技术，通过使用随机序列的寡核苷酸为引物进行PCR扩增，经过电泳分离后可以得到特定长度的DNA条带。
SSR技术则是利用序列中重复核苷酸序列的多态性，选取特定的序列扩增后进行电泳分离，得到条带后可以确定所研究物种基因组的遗传变异情况。
SNP技术则是一种最新的分子标记技术，它是基于单核苷酸变异位点的方法，通过测量单个碱基的点突变来分析遗传多样性。
二、分子标记技术的应用1.遗传分析分子标记技术在遗传学研究中可以用于基因型鉴定、亲缘关系分析、遗传多样性评估等方面。
例如，利用SSR技术可以分析豆科作物的遗传多样性，帮助育种学家定位有用的基因，并加速豆科作物的育种进程。
另外，RFLP技术还可以用于协助医学领域的DNA指纹分析，对于识别罪犯身份、证明亲子关系等方面都有巨大贡献。
2.病理学研究在病理学研究中，分子标记技术可以用于检测各种疾病的基因突变、表达谱的差异、重要调节基因的变化等。
例如，SNP技术可以用于筛查患有代谢性疾病的患者，SSR技术可以用于评价肿瘤的恶性程度。
3.农业领域分子标记技术在农业领域中的应用越来越普遍，可以用于作物品种鉴别、繁殖方式分析、作物改良等方面。
分子标记分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式,它以蛋白质、核酸分子的突变为基础,检测生物遗传结构与其变异。
分子标记技术从本质上讲,都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异。
每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围,但就一般意义而言,DNA 分子标记与形态标记和生化标记等相比,具有许多独特的优点: ①不受组织类别、发育阶段等影响。
植株的任何组织在任何发育时期均可用于分析。
②不受环境影响。
因为环境只影响基因表达(转录与翻译) ,而不改变基因结构即DNA 的核苷酸序列。
③标记数量多,遍及整个基因组。
④多态性高,自然存在许多等位变异。
⑤有许多标记表现为共显性,能够鉴别纯合基因型和杂合基因型, 提供完整的遗传信息。
⑥DNA 分子标记技术简单、快速、易于自动化。
⑦提取的DNA 样品,在适宜条件下可长期保存,这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利。
因此,DNA 分子标记可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题,因而在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景。
1. 1 第1 代分子标记1.1. 1 RFLP 标记技术。
1980 年Botesin提出的限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作为遗传标记,开创了直接应用DNA 多态性的新阶段,是最早应用的分子标记技术。
RFLP 是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小,反映DNA 分子上不同酶切位点的分布情况,因此DNA 序列上的微小变化,甚至1 个核苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生, 导致酶切片段长度的变化。
优点：RFLP 标记的等位基因具有共显性的特点,结果稳定可靠,重复性好,特别适应于构建遗传连锁图。
缺点：在进行RFLP 分析时,需要该位点的DNA片段做探针,用放射性同位素及核酸杂交技术,既不安全又不易自动化。
第八章分子标记及其应用第八章分子标记及其应用1) 分子标记的种类与特点1. 遗传标记的种类与特点遗传标记：指可以稳定遗传的、易于识别的特殊遗传多态性形式。
Minisatellites：小卫星序列遗传标记的种类与特点1）形态标记：肉眼可见的特征性状，简单实用，但数目少，受发育阶段与环境影响。
2）细胞标记：染色体核型与带型，受环境影响小，稳定可靠，但耗时耗力，信息量不足。
3）生化标记：贮藏蛋白、同工酶等，信息量较大，取材方便，但不能反映基因组非编码区信息，仍受发育阶段与环境影响。
4）DNA分子标记：基因组DNA 水平的变异，理想的遗传标记。
2. DNA分子标记DNA分子标记：简称分子标记，指基因组DNA 水平上的任何差异，来自缺失、插入、置换、颠换、重复等，通常以分子杂交或凝胶电泳图谱的形式体现。
2.1 分子标记的优点1）数量多，遍及整个基因组，理论上检测位点近乎无限；2）稳定遗传，不受环境、发育阶段和是否表达等限制;3）多态性高，自然存在，无须专门创造；4）表现为“中性”，即不影响性状的表达；5）许多为共显性，能鉴别杂合与纯合，提供完整的遗传信息。
2.2 分子标记的类型分三大类:1) 基于核酸分子杂交: 第一代，1980s, RFLP（Restriction fragmentlength polymorphism ），限制性片段长度多态性2) 基于PCR或限制酶切+PCR: 第二代，1990s ,RAPD、AFLP、SSR、ISSR、 SCAR、STS等3) 基于DNA测序:第三代，近年来SNP和EST,反转录转座子等第三节分子标记的应用1. RFLP标记RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)：限制性片段长度多态性，1980，Botstein。
基本原理：不同基因组DNA经特定限制酶消化后产生大小不等的片段，再经电泳分离、Southern 印迹杂交和检测后，得到特异的RFLP 标记，它反映不同DNA对所用探针限制性酶切片段长度的多态性，实际是酶切位点的变化和分布情况。
分子标记与油菜遗传图谱的构建摘要：对分别以AFLP，SSR，SNP为代表的三代DNA分子标记的原理、特点进行综述，以及它们的出现对遗传图谱构建的影响。
对油菜遗传图谱的的发展与现状作了分析，认为分子标记技术极大地促进遗传学的研究。
关键词：分子标记；遗传图谱；油菜；前言自然群体在形态，生理，行为等表型方面蕴藏着惊人丰富的变异，表型上的差异也是最直接，最容易观察的变异，所以在最初用来区分个体，在第一张遗传图谱的构建就是采用表型差异作为遗传标记标记构建的。
早在1913年，Sturtevant 成功地将五个基因定位在果蝇X 染色体上，构建出第一张遗传图谱，在植物上1923年，Sax就对菜豆种子大小与种皮色素(表型标记)之间的遗传关联进行了分析。
Law和Thoday也运用表型标记进行过遗传研究。
然而，在高等动、植物遗传图谱的构建中却遇到了基因组高度复杂和有性世代太长的困难，而最困难的问题还在于可供利用的遗传标记数量十分有限。
而且，生物个体的大部分性状，尤其是我们最关注的农艺性状基本都是数量性状，易受环境影响，难以用作遗传标记。
除了表型变异在遗传图谱研究初期，也有利用细胞标记，生化标记作为遗传标记，但她们同样存在数量有限的问题。
在第一张遗传图谱构建的以来，由于缺乏丰富的多态性标记，遗传图谱的构建进展缓慢。
直到1989年，Lander和Botstein构建了的第一张以AFLP作为遗传标记的遗传图谱以来，遗传图谱构建取得了惊人的发展。
从此以后，丰富的分子标记不断被发现。
先后出现了以分别以AFLP，SSR，SNP为代表的三代DNA分子标记。
随着测序技术的不断发展，测序的准确性不断提高，更重要的是价格不断下降，让一般实验室也能接受。
随着分子标记的不断发展，分子标记信息量不断提高，我们进入了大数据时代，如SNP标记，标记可达几万到几百万，测序的标记数目更多。
1 分子标记及其特点DNA 分子标记从它诞生之日起，就引起了生物科学家极大的兴趣，在经历了短短几十年的迅猛发展后，分子标记技术日趋成熟。
DNA分子标记的出现，让遗传图谱的构建进入了新时代，并使得我们能够精确定位基因，DNA分子使得准确可靠地对品种进行基因鉴定和纯度分析成为可能。
每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围，但就一般意义而言，DNA分子标记与形态标记和生化标记等相比，具有许多独特的优点：①不受组织类别、发育阶段、等影响植株的任何组织在任何发育时期均可用于分析。
②不受环境影响。
因为环境只影响基因表达(转录与翻译)，而不改变基因结构，即DNA的核苷酸序列。
③标记数量多，遍及整个基因组。
④多态性高，自然存在许多等位变异。
⑤有许多标记表现为共显性，能够鉴别纯合基因型和杂合基因型，提供完整的遗传信息。
⑥DNA分子标记技术简单、快速、易于自动化。
⑦提取的DNA样品，在适宜条件下可长期保存，这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利。
然而不同分子标记又具有各自的特点。
1.1 第一代分子标记1989年，Lander和Botstein构建了的第一张以RFLP作为遗传标记的遗传图谱，使遗传图谱构建进入了新时代，RFLP是最早应用的分子生物标记技术。
RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。
RFLP标记的等位基因具有共显性的特点，结果稳定可靠，重复性好，特别适应于构建遗传连锁图。
但是，在进行RFLP分析时，需要该位点的DNA 片段做探针，用放射性同位素及核酸杂交技术，既不安全又不易自动化。
另外，RFLP 对DNA多态性检出的灵敏度不高，RFLP连锁图上还有很多大的空间区。
扩增片段长度多态技术(AFLP)，又名限制片段选择扩增技术，1993年荷兰KEYGENE公司的Zabean和V os等发明的。
AFLP自发明以来，发展很迅速，它将基因组DNA用成对的限制性内切酶双酶切后产生的片段用接头连起来，并通过5’端与接头互补的半特异性引物扩增得到大量DNA片段，从而形成指纹图谱的分子标记技术。
AFLP呈现孟德尔遗传，方便研究。
AFLP具有RFLP和RAPD的优点，用少量的DNA 在短期内就可以检测到较多的多态性标记，并且AFLP在个染色体上分布均匀，所以用较少的标记就可以覆盖整个基因组。
1.2 第二代分子标记技术Moore等于1991年结合PCR技术创立了SSR(Simple sequence repeat，简单重复序列)标记技术。
（8）在真核生物基因组中存在大量的非编码重复序列，如重复单位长度为15到65个核苷酸的小卫星，重复单位长度在2到6个核苷酸的微卫星DNA。
小卫星和微卫星DNA分布于整个基因组的不同位点。
由于重复单位的大小和序列不同以及拷贝数不同，从而构成丰富的长度多态性。
SSR就是微卫星DNA，重复序列一般由1到5个核苷酸组成，最为常见的是由两个核苷酸组成，如(CA)n和(TG)n 。
不同遗传材料重复次数不同，导致了SSR长度的高度变异性，这一变异性正是SSR标记产生的基础。
SSR的基本原理为：微卫星两端序列一般比较保守，可以根据微卫星两端特定序列设计引物，然后通过PCR扩增微卫星片段。
由于不同基因型重复序列重复数目存在多态性，因而扩增出来的片段会存在差异，从而检测DNA多态性。
微卫星序具有多等位基因的特性，提供的信息量高共显性遗传，通常具有很高的多态性，因此是一类很好的分子标记。
不易被自然选择和人工选择所淘汰，符合孟德尔遗传定律。
易于利用PCR技术分析，对DNA质量要求低，用量少，不需使用同位素，即使是部分降解的样品也可进行分析。
每个位点由设计的引物顺序决定，便于不同的实验室相互交流合作开发引物。
此外SSR标记扩增的条带单一，所以可以在同一块胶上跑多对引物，节省成本和工作量。
ISSR标记指的是内部简单重复序列，ISSR实在SSR的基础上发明的，他的原理是：其基本原理是:用锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列的3'端或5'端加上2-4个随机核苷酸，在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。
所扩增的inter SSR区域的多个条带通过聚丙烯酞胺凝胶电泳得以分辨，扩增谱带多为显性表现。
用于ISSR-PCR扩增的引物一般含有16到18个核苷酸，有1到4个核苷酸组成的串联重复和几个非重复的锚定核苷酸组成，且发展速度也很快，与SSR相比，ISSR的引物不需要DNA测序，DNA 用量少，技术要求低，性价比高，并且PCR扩增时退火温度在52摄氏度左右，保证了PCR扩增的可重复性。
1.3 第三代分子标记技术分子标记取得的巨大发展也给其他实验带来了极大的方便，在这些分子标记的基础上构建了大量的遗传图谱。
然而相对于巨大的基因组，分子标记依旧不够，遗传图谱上也存在很大间隙。
第三代分子标记技术的代表为SNP分子标记技术，SNP全称为单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP），是指的在基因组上单个核苷酸的变异，包括臵换、颠换、缺失和插入，而形成的多态性。
从理论上来看每一个SNP 位点都可能有有4 种不同的变异形式，但实际上发生的一般只有两种，即转换和颠换，二者之比为1 :2。
SNP 在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T ，原因是CG 中的C 常为甲基化的，自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。
一般而言，SNP 是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。
在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一个SNP ，人类基因组上的SNP 总量大概是3百万个，能极大地提高遗传图谱的密度。
因此，SNP成为第三代遗传标志。
SNP的出现时分子标记进入了大数据时代，数量巨大的分子标记使得构建高密度的遗传图谱成为了可能。
SNP除了位点丰富，分布广泛还有众多优点。
SNP标记遗传稳定性高，相比串联重复微卫星等多态性标记，SNP是基于单核苷酸的突变，突变频率较低，遗传稳定性相对较高。
在动植物群体中，SNP标记可能由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上后2种情况出现的机率异常少见，常被忽略。
SNP标记一般只有2种等位型的碱基组成，具有二态性；由于具有等位基因性，因而在任何种群中其等位基因频率都可估计出来。
给构建图谱给予了极大地方便。
SNP还有一个最大的优点：检测快速，易实现自动化分析，通常一个人四天就可以完成八张芯片的，相当于不到十天就可以完成一张图谱的构建。
因此SNP在技术上有着较大的比较优势，可以摆脱电泳分型的瓶颈，加上近年来各种新兴的技术层出不穷，提高了自动化检测水平，也提高了检出率，因而促进其快速发展。
2 遗传图谱的构建1913年，Sturtevant 将五个基因定位在果蝇X 染色体上，构建出第一张遗传图谱，遗传图谱的研究经历了经典遗传图谱和分子遗传图谱两个阶段。
经典遗传图谱阶段的研究主要是基于形态学标记、细全学标记和生化标记。
由于缺乏足够的遗传标记，遗传图谱构建的进展十分缓慢。
直到1980年，Botstein 等创立了以Southern杂交为核心的RFLP技术，并构建了第一张以分子标记为遗传标记的图谱。
Helentjaris 等利用RFLP 标记构建了第一张玉米和西红柿的分子遗传图谱，其中玉米的13 个连锁群包含113 个RFLP位点，西红柿的20个连锁群包含104个RFLP 位点，其标记密特较之前的经典图谱有了极大的提升.将分子图谱跟经典遗传图谱综合，可得到综合图谱，综合图谱可提高图谱的可信度。
3 油菜遗传遗传图谱构建进展分子标记连锁图是重要性状基因定位和图位基因克隆的基础和理论依据，1990年，美国科学家slocum于1990年利用F2群体构建了第一张甘蓝的RFLP遗传图谱，揭开了油菜遗传图谱的序幕，该图谱包含有9个连锁群，共包括了258个RFLP标记，遗传图距总长820cM。
随后不同实验室义陆续发表了各自的甘蓝遗传图谱，1991年，Landry 等以油菜栽培种wester和Tapas杂交的F2群体为材料，用苗期特异表达的cDNA克隆作探针，构建了一张遗传图谱，Hu等(1999)利用一个F2群体，将前人发表的甘蓝连锁图进行了整合，整合后的连锁图共包含175个AFLP标记，分属于13个连锁群，覆盖基因组长度为1738cM，Song等(1991)构建了白菜型油菜的首张遗传连锁图，该图包含10个连锁群，共280个RFLP位点，图谱总长1850cM，随后国外的在白菜或白菜型油菜中又构建了多张遗传图谱。
国内，张鲁刚等(2000)利用芜青和结球白菜杂交的F2为材料，构建了含有99个RAPD标记的白菜连锁图，其平均图距为16.5cM，总长1632.4cM。
卢钢等(2002)利用白菜与芜青杂交的几代分离群体构建了白菜的遗传图谱，该图谱包括131个遗传位点，分布在10个主要连锁群及2个小连锁群上。
