脐血CD34+细胞体外扩增诱导成熟树突状细胞实验研究

旦堕焦些匡芏窒查！婴！±！塑茎垫查笪！塑１坐』！生！！型，塞堕坐！！！婴！塑！：望：堂：！脐血ＣＤ３４＋细胞体外扩增诱导成熟树突状细胞实验研究朱远丰陈东晓陈慎仁【摘要】目的建立体外诱导和扩增人脐血树突状细胞（Ｄｃ）的方法ｔ并进行生物学鉴定。

方法脐血细胞经免疫破珠法分离纯化为ｃＤ３４１细胞，加人细胞因子（ＧＭ—ｃｓＦ和ＴＮ卜ａ）培养约２周，光镜观察培养的ＤＣ形态学特征；通过与同种Ｔ细胞混合培养，采用Ｍｒｒ比色分析法测定不同浓度的Ｄｃ激发同种Ｔ细胞增殖的能月。

结果培养的Ｄｃ胞浆突起大而长，呈树突状，具有Ｄｃ的典型形态，并且具有强烈的激发同种异体Ｔ细胞增殖的能力。

结论从脐血细胞分离纯化ｃＤ３４＋细胞，加入细胞因子（ＧＭ—ｃｓＦ和ＴＮ卜ｑ＞培养，能获得大量、较高纯度的Ｄｃ。

Ｉ）ｃ具有强烈的激发同种异体Ｔ细胞增殖的能力。

【关键词】ｃＤ３４十细胞；树突状细胞｝细胞因子；增殖中圈分类号：Ｒ３９２—３３文献标识码：Ａ文章编号：１６７３—４１３０（２００７）０９７７７—０３ＤｅｎｄｒｍｃｃｅＩ¨酣Ⅱｃｌｌ相蚰ｄⅡｒｏ¨ｆｅｒａｔｉｏＨ０ｆＣＤ３４＋辑ｌＩｓｆｒｏｍ岫ｂｍ∞ｌｃｏｒｄｂ１００ｄｉⅡｖ．ｔｒｏＺＨＵ№ｏ妒—如ｎｇ．ＣＨＥ～ＤＤ”矿伽ｏ，ｃＨＥＮｓ＾Ｐｎ一枷．ＤＦ声Ⅱ儿研Ｐ＂￡ｏ，，ｎｆｅｎｄｆＭｅｄｆｃｔｎＰ，￡＾ｅｓＰ㈣ｄＡ，，ｉｆｔｎ￡缸Ｈｏ』声ｚｆ口￡ｆｏＭ甜枷ｚ（＝０ｍ班Ｄ，鼽ｎｎｆｏ“仉ｉｗＨ咖．ｓ＾ｏｎｆｏ“，５１５０４１，＆ｉｎｄ【Ａｂｓ”眦ｔ】ｏｂｊ毗ｉｖｅＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｔｈｅｍｅｔｈ（）ｄｏｆ１ｎｄｕｃｉｎｇａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇｄｅｎ州ｔｌｃｃｅｌｌｓ（ＤＣｓ）ｆｒｏｍｕｍｂｌｌｉｃａｌｃｏｒｄｂｌｏｏｄｃｅＵ（ＵＣＢＣ）ｉｎｖｌｔｒｏａｎｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅ“ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．ＭｔｔｈｏｄｓＣ【）３４＋ｃｅｌｌ３ｗｅｒｅｌｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｕｍｂｉｌｉｃａｌｃｏｒｄｂｌｏｏｄｃｅｌｌｓ，ａ【Ｉｄｔｈ…ｕｈｕｒｅｄｗｌｔｈｃｙｔｏｋｉｎｅｓｌｎｃｌｕｄｍｇＧＭ—ｃｓＦａｎｄＴＮＦ＿ａＡｆｔ町】４ｄａｙｓ’ｃｕＩｔｕｒｅ，ｔｈｅｌｎｄｕｃｅｄＤｃ５ｗｅｒｅＤｂｓｅｒｖｅｄｂｙ１ｌｇｈｔｎｕｃｒｏｓｃｏｐｅ．ａｎｄｃｏ＿ｃｕｈｕｒｅｄｗｉｔｈ１１ａｔｉｖｅＴｃｅｌｌｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｐｅｎｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄ．ＴｈｅｌｒｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆｕｎｃｔｉｏｎｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＭＴＴａｓｓａｙ．Ｒ髂ｕ№Ｔｈｅ１ｎｄｕｃｅｄＤＣｈａｄｔｈｅｔｙｐｌｃａｌｒ∞ｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．Ｄｌｆｆｅｒｅｎｔｎｕｍｂｅｒｏｆ１ｎｄ眦ｄ１）ＣｓｃｏｕＩｄｓｔｌｍｕｌａｔｅｔｈｅｐｒ０１ｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆａＩｌｏｇｅｎｅｌｃＴｃｅｌｌｓｅｆｆｉｃｌｅｎｔｌｙａｎｄｔｈｅｙｗｅｒｅｐｏｔｅｎｔｓ“ｍｕｌａｔｏｒｓｉｎａ】ｌ。

ｇｅｎｅ【ｃｍｉｘｅｄｌｙｍｐｈｏ。

ｙｔ￡ｒ眦ｔｉｏｎ（ＭＬＲ）．Ｃ帅ｃＩ聃ｉ帆ＩＬｌｓａｆｌａｐ—ｐｌｊｃａｂｌｅｍｅｔｌｌｏｄｂｙｕｓｉ“ｇｕｍｂｌｌｊｃａｌｂｌｏｏｄａｓａｓｏｕｒｃｅ日ｎｄｃ０－ｃｕｌｔｕｒ耐ｊｎｔｈｅｍｅｄｌｕｍｃｏｎｔａｊ面Ｔ１９６Ｍ—ＣＳＦａｎｄＴＮ卜ｎ，ｗｂｌｃｈｃ。

ｕｌｄｇｅｎｅｒａｔｅｐｌｅｎｔｙｏｆＤｃｓｗｌｔｈｈｌｇｈｐｕｒｉｔｙａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｌｏｎｓ．ＤｃｓｃｏｕＩｄｓｔｉｍｕｌａｔｅｔｈｅｐｒｏｌ讦ｅｒ８ｔｉｏｎｏｆａｌｌｏｇｅｎｅｉｃＴｃｅｌｌｓｅｆｆｌｃｊｅｎｔｌｙ．【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】ＣＤ３４‘ｃｅｌｌ；Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ；ｃｙｔｏｋｌｎｅ８；Ｐｒｏｌｌｆｅｒａｔｉｏｎ１９７３年Ｓｔｅｊｎｍａｎ和Ｃｏｈｎ首次分离出一类与粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞形态和功能不同的细胞，命名为树突状细胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ，ＤＣ）。

目前已知Ｄｃ是捕获、加工和提呈抗原功能最强的抗原递呈细胞（ａｎｔｉｇｅｎｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇｃｅｌｌ，ＡＰｃ），在激发Ｔ细胞免疫应答和Ｔ细胞依赖性抗体生成中起重要作用，已成为近几年来肿瘤主动特异性免疫治疗的热点ｏ］。

Ｄｃ在体内数量极少，体外培养扩增Ｄｃ将极大方便Ｄｃ的临床研究。

造血干／祖细胞能够在体外大量扩增，因此是扩增诱导ＤＣ的理想来源。

本组采用粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ—ｍａｃｒｏｐｈａｇＰｃｏｌｏ—ｎｙ－ｓｔｉｍｕｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ，ＧＭＣＳＦ）和肿瘤坏死因子（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ—ａ，ＴＮＦ＿Ｑ）组台细胞因子扩增诱导Ｄｃ的方法，将造血干／祖细胞诱导为Ｄｃ，获得高纯度的Ｄｃ，为其深入研究和临床应用奠定了基础・基金项目：广东省高校自然科学基金（Ｎ０．０１４４）和广东省科技厅项目（ＮＯ．２００４８３０３０１０１ｓ）资助作者单位，５１５０４１广东省汕头大学医学院附属第二医院内科通讯作者：阵慎仁，Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈ蛐ｓｈ㈣ｎ＠１６３．ｃＤｍ现报道如下。

资料与方法・７７７・・论著－１．主要试剂：正常人脐血由广东省汕头大学医学院附属第二医院产科提供，正常人外周血由健康自愿者提供。

ＭｉｎｉＭＡｃｓ磁式细胞分选器及ｃＤ３４＋细胞分离试剂盒购自ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ公司，重组人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭ—ｃｓＦ）购白ｓｉｇｍａ公司，ｒｈｌ、ＮＦ－Ⅸ（重组人肿瘤坏死因子）购自ＰｅＰＲＯＴｅｃｈＥｃＬＴＤ。

淋巴细胞分离液为中国科学院血液研究所产品。

ＲＰＭＩ１６４０为Ｇｉｂｃｏ公司产品。

胎牛血清（ＦＢｓ）购自天津ＴＢＤ公司。

ＲＰＭＩ１６４０培养液：ＲＰＭＩ１６４０１０．４ｇ、ＮａＨｃ０３２．ｏｇ、青霉素１００单位／ｍｌ，链霉素１００单位／ｍｌ，终体积１ｏＯｏｍｌ，ｐＨ７．２，抽滤除菌，４．Ｃ保存备用。

ＭＴＴ为Ａｍｅｒｓｃｏ公司产品，植物血凝素（ＰＨＡ）购自Ｓｉｇｍａ公司。

２．脐血单个核细胞制备及ｃＤ３４＋干细胞的分离纯化：胎儿娩出、胎盘尚未剥离时用医用一次性注射器无菌采集脐静脉血，经肝素（２ｕ／ｍＩ血）抗凝，加入等量磷酸盐缓冲液稀释。

缓慢加于等量淋巴细胞分离万方数据・７７８旦竖垫壁垦芏壅查！婴！圭！旦璺垫鲞璺！塑垫！』生！！！盟，墅曼！堕！塑！，兰型望ｔ型！：！液上，离心（离心半径８ｃｍ，２０００ｒ／ｍｉｎ离心１７ｍｉｎ，２０℃），分离脐血单个核细胞，经磷酸盐缓冲液洗涤后，凋整细胞悬液浓度为５×１０６／ｍｌ，按试剂说明书以免疫磁珠法分离纯化ｃＤ３４＋干细胞。

３．Ｄｃ体外扩增培养：将ｃＤ３４＋干细胞悬浮于含１０％胎牛血清ＲＰＭＩ１６４０培养浪中，调整细胞浓度为３×１０４／ｍｌ。

每个培养瓶加４ｍｌ上述培养基，并加人细胞因子ｒｈＧＭ—ＣＳＦｌｏｏｎｇ／ｍｌ、ｒｈＴＮＦⅡ５０Ｕ／ｍｌ，于３７℃、５％ｃＯ：、饱和湿度条件下培养９～１４ｄ，于培养过程中隔日半保留换液并补加相应细胞因子。

９～１４ｄ后收集细胞，ｏ．０４％台盼蓝染色检测细胞活力，计数并观察细胞的生长情况。

４．噻唑蓝比色法检测体外Ｄｃ对同源Ｔ细胞的刺激活力：取肝素抗凝的健康人外周血，经淋巴细胞分离液密度梯度离心，分离单个核细胞（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌ，ＭＮｃ）；实验分为３组，取培养１１ｄ的Ｄｃ，Ｄｃ与ＭＮｃ比例为１：１００，３：１００、１０：１００，每孔ＭＮｃ为１×１０５，植物血凝素（ｐｈｙｔｏｈｅｍａ９９１ｕｔｉｎｉｎ，ＰＨＡ）为１２．５ｍｇ，总体积为２５０ｍｌ。

每组均设Ｄｃ＋ＰＨＡ对照组，另设ＭＮｃ＋ＰＨＡ对照组和ＰＨＡ对照组。

每组设３复孔，实验重复３次。

将９６孔平底培养板置于３７℃、５％ｃ０２、饱和湿度条件Ｆ孵育４ｄ｝培养４ｄ后，每孔加入噻唑蓝溶液（５ｍｇ／ｍ１）２０ｍｌ，继续孵育４ｈ。

４ｈ后，离心半径８ｃｍ，ｌ０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，吸弃孔内上清液，每孔加入１５０ｍ１二甲基亚砜，振荡１０ｍｉｎ，使结晶物充分溶解；选择５７０ｎｍ波长，在ＢＩＤＲＡＤ３５５。

－ｕｖ型全自动酶联检测仪上铡各孔吸光度（Ａ），并记录结果。

各ＤＣ＋ＭＮｃ＋ＰＨＡ组与相应Ｄｃ＋ＰＨＡ组的Ａ值之差反映实验组Ｔ细胞的增殖反应；ＭＮｃ＋ＰＨＡ组Ａ值与ＰＨＡ组Ａ值之差反映对照组Ｔ细胞增殖反应。

ｊ．统计学方法：统计数据以ｊ士ｓ表示，采用ｓＰＳｓｌｏ．ｏ统计软件，对结果进行ｆ检验分析．Ｐ＜ｏ．０５或Ｐ＜ｏ．０１表示差异有统计学意义。

结果１．ｃＤ３４＋干细胞的分离纯化：分离的ｃＤ３４＋干细胞收获率为ｏ．５％～ｏ．９％，台黔蓝排斥试验９５％以上呈阴性。

２．ＣＤ３４＋干细胞体外培养生成Ｄｃ：（１）活细胞观察（见图１，２）。

例置相差显微镜下，ＣＤ３４＋细胞于体外培养基中悬浮生长，ＣＤ３４＋细胞呈小圆形，在ｒｈ—ＧＭＣｓＦ、ｒｈＴＮｐａ作用下开始增殖。

第３天时出现小集落，５～７ｄ时集落数量最多，其周围有呈树突样形态的细胞，７～１０ｄ后，集落数量逐渐减少，散在的悬浮细胞增多，此时多数Ｄｃ呈典型的形态，突起细长，有分支，表面呈毛刺样；有的短而钝呈伪足状。

（２）Ｄｃ对同源Ｔ细胞的刺激增殖作用：不同浓度ＤＣ对ＭＮｃ刺激增殖效应与对照组相比均有明显增强（Ｐ＜０．０ｉ，结果见表１），且其Ａ值随ＤＣ浓度增高而增高（见图３）。

图ｌ倒置星微镜下见ｒｈＧＭｃｓＦ、ｒｈＴＮＦ－ａ诱导培养８ｄ的人脐血Ｄｃ，周固有较多形态不规赠、大小不等、呈寞起样形蠢的Ｉ）ｃ细胞（５．０×２０．０）图２倒置显微镜下见ｒｈＧⅣ卜ＣＳＦ、ｒｈＴＮＦ—ｎ诱导培养１０ｄ的＾脐血Ｄｃ．呈长梭形、量形殛典型树寞状形态【５Ｏ×２０．Ｏ表ｌ不同浓度人脐血Ｄｃ对Ｔ细胞增殖反应的影响（ｉ土ｓ，Ⅺ一９）注：组１为对照组，组２～４为实验组。

各吏验组Ｔ细胞增殖反应（Ａ值）与对照组Ｔ细胞增殖反应（Ａ值）比较，尸＜０ｏｌ。

瞄３不同浓度人脐血Ｄｃ对Ｔ细胞增殖反应的影响注：ｌ组为对照纽，２～４组为实验组。

讨论ＤＣ是抗原呈递能力最强的ＡＰＣ，具有捕获、加工万方数据国睦垫些垦堂窭查！塑！王！旦堑望鲞筻！塑！坐！！生！！型：墨垡！！塑！！！堕・堕垫，！坠！和提呈抗原的功能，在抗肿瘤免疫中起重要作用ｏ］。

Ｄｃ在其提呈抗原过程中提供主要组织相容性复合体ＭＨＤＩ类和ＭＨＣ＿Ⅱ类分子、共刺激分子、细胞因子及黏附分子，有效刺激辅助性Ｔ细胞（Ｔｈｅｌｐｅｒ，Ｔｈ）和细胞毒性Ｔ细胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ｃＴＩ，）增殖；激发和增强宿主抗肿瘤细胞免疫应答及其Ｔ细胞依赖的抗体生成反应。

Ｄｃ的减少又与肿瘤的发生、发展密切相关。

近年来以ＤＣ为基础的肿瘤免疫研究有了长足的进展，有报道将肿瘤抗原编码的基因导入Ｄｃ，免疫接种后诱导出高水平的ｃＴＬ活性口］。