血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定实验报告

血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯于鉴定一、实验目的：1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法5、了解柱层析技术二、实验原理：蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。

对于不同的蛋白质，其分子量、溶解度及等电点等都有所不同。

利用不同蛋白质在这些性质上的差别，利用相应的物理方法可分离纯化不同蛋白质。

A.盐析法：在蛋白质溶液中加入大量中性无机盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。

同时，加盐后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，从而破坏了蛋白质的胶体性质，导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间易于聚集沉淀，进而使蛋白质从水溶液中沉淀析出。

B.凝胶层析：利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。

当溶液通过SephadeG-25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒网孔，而分子量小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔中，因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而达到去盐的目的。

C.离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。

D.纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳）：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。

它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。

由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。

因此电泳时可将它们分离为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。

三、材料与方法A材料样品：人混合血清试剂：葡聚糖凝胶（G-25)层析柱、DEAE纤维离子交换层析柱、饱和硫酸铵溶液、醋酸铵缓冲溶液、20%磺基水杨酸、1%BaCl溶液、氨基黑染色液、漂洗液、pH8.6巴比妥缓2冲溶液、电泳仪、电泳槽B实验步骤盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定）具体操作流程示意：（一）盐析+凝胶柱层析除盐：（二）离子交换层析（纯化）：（三）醋酸纤维素薄膜电泳：1、点样（如下图）：-点样线尽量点得细窄而均匀,宁少勿多2、电泳：①薄膜粗面向下②点样端置阴极端③两端紧贴在滤纸盐桥上，膜应轻轻拉平电压：110V时间：50min3、染色和漂洗：电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。

生物化学实验报告班级：学号：姓名：实验室：评分━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━日期：实验一：血清γ-球蛋白分离、纯度鉴定与浓度检测实验目的：1、熟悉盐析法分离蛋白质的原理和基本方法2、掌握凝胶层析法脱盐分离蛋白质的原理和基本方法3、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法进行纯度鉴定的原理和基本方法4、掌握分光光度计检测蛋白质含量的原理和基本方法实验原理：1.盐析法:盐析法是在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度或达饱和状态，可使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。

蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。

此外，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。

2.凝胶层析法脱盐：在葡聚糖凝胶柱中，蛋白质与盐的分子量不同，当样品通过层析柱时，分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔而进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱;反之，盐的分子量较小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，流出层析柱的时间较后。

分段收集蛋白质洗脱液，即可得到脱盐的蛋白质。

3.醋酸纤维素薄膜电泳：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。

它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。

由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。

因此可以将它们分离为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。

4.分光光度计是应用分光光度法（即比色法）测定物质含量的装置。

通常需要加入某种显色剂，以产生有色化合物，其颜色深浅与待测化学成分的含量成正比，据此对待测物浓度进行测定。

分光光度计的工作原理及分光光度法的计算根据Lambert-Beer定律导衍而得Abs（吸光度）=KCL K:摩尔吸收系数 C:吸光物质浓度 L-溶液厚度实验操作：1.硫酸铵分段盐析:血清2.0 ml,加入PBS2.0ml,一边摇一边缓慢加入饱和硫酸铵2.0 ml,混匀后室温下静置10分钟，3000rpm离心10分钟。

实验三血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定【实验目的】一.掌握层析技术的基本原理及应用二.了解层析技术的分类三.掌握凝胶层析和离子交换层析的原理【实验原理】一、层析技术1.层析法层析法也称色谱法，是一种广泛运用的物质分离纯化、分析鉴定技术,是1903年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。

将植物色素溶液通过装有CaCO3 吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。

2.依据混合物中各组分理化性质的差异—分子大小、酸碱性、吸附力、分子形状、分子极性、分子亲和力以及分配系数等。

3.基本原理固定相—固定不动。

流动相—对固定相作单向相对运动，推动样品中各组分通过固定相向前移动。

分离原理：待分离混合物中各组分理化性质不同，对流动相和固定相具有不同的作用力，因此在流动相推动样品通过固定相的过程中，通过不断地吸附、解吸、再吸附、再解吸作用，造成混合物中各组分在固定相中的迁移距离不等，达到分离。

4．凝胶层析(凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、分子排阻层析)①定义：指混合物随流动相流经固定相的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。

②基本原理：固定相：凝胶，不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒内部都具有很多细微的小孔，如同筛子一样，故称分子筛。

包括琼脂糖、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖-葡聚糖复合凝胶。

流动相：洗脱液。

样品加于柱上，样品随洗脱液的流动而向下移动，小分子能进入凝胶孔内部，做不定性扩散运动，流程长，速度慢，后流出；大分子不能进入凝胶孔内部，只能在颗粒间移动，作垂直向下运动，流程短，先流出→大小分子彼此分开。

③影响因素*层析柱的选择及装填：柱大小—分离样品量凝胶型号—分辨率：各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。

凝胶分离范围之外的分子，难以分离。

如大小不同的两种全排阻分子/完全渗透分子。

*洗脱液：溶解待分离物质，不变性*加样量：1%～5%*凝胶的再生5. 离子交换层析离子交换层析是利用离子交换剂对各种离子的亲和力不同，借以分离混合物中各种离子的一种层析技术。

血清清蛋白及γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定目的要求1．1．熟悉蛋白质分离纯化的总体思路。

2．2．掌握盐析、离心、层析、浓缩、电泳等技术在蛋白质分离纯化中的综合作用。

3．3．学会设计和制定分离纯化蛋白质的方法。

实验原理血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类：清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白，其中γ-球蛋白含量约占16％，100ml血清中约含1.2g左右。

首先利用清蛋白和球蛋白在高浓度硫酸铵溶液溶解度的差异而进行沉淀分离，此为盐析法。

半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，经离心分离,沉淀部分即为含有γ-球蛋白的粗制品。

用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此首先必须去除。

常用的方法有透析法、凝胶层析法等。

本实验采用凝胶层析法，其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。

当溶液通过SephadexG--25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中．因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而可达到去盐的目的。

脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们等电点的不同可进行分离。

清蛋白、α－球蛋白、β-球蛋白的PI<6.0；γ－球蛋白的PI为7.2左右。

因此在PH6.3的缓冲溶液中，各类球蛋白所带电荷不同。

经DEAE(二乙基氨基乙基)纤维素阴离子交换层析柱进行层析时，带负电荷的α－球蛋白和β-球蛋白能与DEAE纤维素进行阴离子交换而被结合；带正电荷的γ－球蛋白则不能与DEAE纤维素进行交换结合而直接从层析柱流出。

因此随洗脱液流出的只有γ－球蛋白，从而使γ－球蛋白粗制品被纯化。

其反应式如下：用上述方法分离得到γ－球蛋白是否纯净，单一。

可将纯化前后的γ－球蛋白进行电泳比较而鉴定之。

提高醋酸铵溶液的浓度到0.06 mol/L，DEAE纤维素层析柱上的ß-球蛋白及部分a-球蛋白可被洗脱下来。

血清γ- 球蛋白的分离、纯化与鉴定【目的】1 ．掌握盐析 - 层析法提纯血清γ- 球蛋白的原理和技术。

2 ．熟悉电泳比较法定性γ- 球蛋白的方法。

3 ．了解扫描定量γ- 球蛋白的方法。

【原理】蛋白质的分离、纯化是研究蛋白质化学性质及生物学功能的重要手段。

根据不同蛋白质的分子量、溶解度以及在一定条件下带电荷性状的差异来分离、纯化各种蛋白质。

1 ．γ- 球蛋白的分离、纯化（ 1 ）盐析：清蛋白与球蛋白的稳定性不同，故可用盐析法对血清蛋白质初步分离。

在半饱和硫酸铵溶液中，清蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，离心所得的沉淀即是球蛋白混合物。

（ 2 ）脱盐：球蛋白混合物中的硫酸铵会妨碍进一步分离纯化，应除去。

脱盐的方法有多种，本试验采用凝胶过滤。

在凝胶过滤中，柱中的填充料是高度水化的惰性多聚物，最常用的有葡聚糖凝胶（ Sephadex Gel ）和琼脂糖凝胶 (Agarose Gel) 等颗粒。

葡聚糖凝胶是具有不同交联度的网状结构物，它的“ 网眼” 大小可以通过交联剂与葡聚糖的配比来达到。

不同型号的葡聚糖凝胶可用来分离和纯化不同分子大小的物质。

把葡聚糖凝胶装在层析柱中，不同分子大小的蛋白质混合液借助重力通过层析柱时，比“ 网眼” 大的蛋白质分子不能进入网格中，而被排阻在凝胶颗粒之外，随着洗脱剂在凝胶颗粒的外围而流出。

比‘ 网眼 ' 小的分子则进入凝胶颗粒内部。

这样，由于不同大小的分子所经路程距离不同而得到分离。

大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗脱出来。

所以含硫酸铵的蛋白值溶液通过层析柱时，先被洗脱出层析柱的是球蛋白，小分子硫酸铵由此法分离除去（参见第 2 篇第 2 章图 2-3 ）。

（ 3 ）纯化：γ- 球蛋白与α 、β- 球蛋白（以及微量的清蛋白），等电点不同，所以采用离子交换层析，从球蛋白混合物中分离、提纯出γ- 球蛋白。

用于蛋白质分离的层析材料多是离子交换纤维素，它们的优点是对蛋白质的交换容量较一般的离子交换树脂大，而且品种较多，可以适用于各种分离目的。

生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：XX】实验目的：1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法5、了解柱层析技术实验原理：1、蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。

2、不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。

利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。

3、盐析法：盐析法是在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度或达饱和状态，可使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。

蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。

中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。

4、离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。

5、醋酸纤维素薄膜电泳原理：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。

它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。

由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。

因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。

实验材料：人混合血清葡聚糖凝胶（G-25)层析柱DEAE纤维离子交换层析柱饱和硫酸铵溶液醋酸铵缓冲溶液 20%磺基水杨酸1%BaCl溶液氨基黑染色液2漂洗液 pH8.6巴比妥缓冲溶液电泳仪、电泳槽实验流程：盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定）实验步骤：（一）盐析+凝胶柱层析除盐：（二）离子交换层析（纯化）：（三）醋酸纤维素薄膜电泳：1、点样（如下图）：-点样线尽量点得细窄而均匀,宁少勿多2、电泳：①薄膜粗面向下②点样端置阴极端③两端紧贴在滤纸盐桥上，膜应轻轻拉平电压：110V时间：50min3、染色和漂洗：电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。

生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称血清清蛋白、γ-球蛋白分离、纯化与纯度鉴定实验日期2014-11-20 实验地点第4实验室合作者指导老师评分教师签名批改日期一、实验目的1.掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法2.掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法3.掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法4.掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法5.了解柱层析技术二、实验原理蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。

不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。

利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。

清蛋白A球蛋白α1α2βγ等电点相对分子量（×104）含量（％）4.886.957~675.06202~55.06304~95.129~156.2~126.85~7.315.6~3012~20（一）粗提（盐析法）盐析法是在蛋白质溶液中,加入无机盐至一定浓度,或达饱和状态,可使蛋白质在水中溶解度降低,从而分离出来。

蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。

同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。

由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。

所以调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。

（二）脱盐盐析分离的蛋白质溶液中含有大量无机盐，必须先脱盐后才能进一步纯化。

脱盐有多种方法，本实验采用凝胶层析法。

凝胶层析法主要是根据混合物中各种物质分子大小的不同而将其分离的技术。

（三）纯化（离子交换层析）离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离（四）纯度鉴定血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。

血清γ-球蛋白的分离纯化与鉴定及电泳分析【实验目的】1、了解蛋白质分离提纯的总体思路。

2、掌握盐析法、凝胶层析法和离子交换层析的实验原理及操作技术3、掌握电泳法分离纯化蛋白质的方法。

【实验原理】1、蛋白质的粗提——盐析法胶体的盐析是加盐，盐中的带电粒子使蛋白质周围的水化膜减弱，胶粒溶解度降低，形成沉淀析出的过程，是胶体的聚沉现象的一种。

向蛋白质溶液中加入某些浓的无机盐[如(NH4)2SO4或Na2SO4]溶液后，可以使蛋白质凝聚而从溶液中析出，这种作用就叫做盐析。

盐析不能使蛋白质变性，可以复原。

利用这个性质，可以采用多次盐析的方法来分离、提纯蛋白质。

蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。

蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。

同时，离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，蛋白质溶解度更加降低，之蛋白质分子之间聚集而沉淀。

由于各种蛋白质在不同盐浓度中的溶解度不同，不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋白质不同，从而使之从其他蛋白中分离出来。

简单的说就是将硫酸铵、硫化钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。

由于清蛋白的亲水性比球蛋白大，且清蛋白的分子比球蛋白小，所以清蛋白需要高浓度的盐溶液才能够发生盐析，低浓度的时候球蛋白发生盐析。

盐析法分离蛋白质：各种蛋白质的颗粒大小、亲水程度、pI不同，盐析所需的盐浓度也不一样。

调节盐浓度可使不同的蛋白质沉淀，从而达到分离的目的。

常用中性盐：硫酸铵、硫酸钠等。

硫酸铵：温度系数小，溶解度大，蛋白谱广，盐析效果好，不易引起变性。

可用硫酸/氨水按需要调节pH值。

本实验中清蛋白分子小，亲水性强，在饱和硫酸铵溶液中可沉淀析出，而球蛋白分子大，亲水性弱，在半饱和硫酸铵溶液中即可沉淀析出。

血清γ-球蛋白的分离纯化实验报告血清γ-球蛋白的分离纯化一、目的与要求1、掌握分离纯化蛋白质的基本原理和基本过程。

2、熟悉盐析、离心、层析、电泳等生化基本技术在蛋白质分离纯化中的综合应用。

3、学会设计和制定分离纯化蛋白质的实验方案，技术路线，质量监控和保证措施。

二、实验原理血清蛋白有300多种，可粗略的分为清、球蛋白两大类，γ球蛋白只是球蛋白中的一个亚类。

欲用常规方法获得，可先用半饱和硫酸铵从血清中盐析出球蛋白，接着用葡萄糖凝胶G-25脱去球蛋白中的盐分最后用DEAE纤维素阴离子交换柱便可直接从脱盐的球蛋白溶液中分离纯化出γ球蛋白,其反应机理如下：C2H5H纤维素-O-(CH2)2-N(C2H5)2纤维素-O-(CH2)2-N+……H2PO4H++H2PO4DEAE纤维素离子交换柱COOHC2H5α、β、γ球蛋白NH2COOH经过盐析和脱盐的球蛋白液纤维素-O-(CH2)2-N+…α和βGPH6.3NH2交换到柱上的α和β-球蛋白H2PO4COOHγ-球蛋白NH3+被DEAE柱分离纯化的γ-球蛋白被柱层析交换结合的α球蛋白和β球蛋白，可通过增加洗脱液的离子强度或降低洗脱的pH值（也可两者同时改变），使其分部洗脱下来而被纯化。

纯化前后的γ球蛋白可用电泳方法进行比较鉴定。

三、仪器和材料仪器：离心机，1.5×40cm层析柱，层析架或滴定台，核酸-蛋白检测仪，部分收集器，紫外分光光度计，色谱柱，电泳槽，电泳仪。

材料：马血清，SephadexG-25×200g，DEAE-32×200g。

四、实验步骤（一）分离纯化步骤1、取3mL,4℃预冷血清，加入3mL4℃预冷的饱和硫酸铵。

边滴边摇。

2、静置大于10min后，3500rpm离心15min，弃去上清液，将沉淀溶于少量的生理盐水。

从中取0.5mL用于测定蛋白质含量。

3、将剩余的样品上SephadexG-25柱，用0.02mol/LpH6.5的NH4AC缓冲液洗脱，每管收集3mL，用于绘制洗脱曲线，选择颜色最深（即浓度最高管）的取0.5mL留待电泳用。

综合研究性实验一：血清清蛋白与γ-球蛋白的分离与鉴定一.实验目的1.掌握盐析法分离提纯蛋白质的原理和方法；2.掌握透析法脱盐与蛋白质浓缩的方法；3.掌握凝胶过滤层析的技术方法；4.掌握利用醋酸纤维素薄膜电泳法分离与鉴定血清清蛋白的原理和方法。

二.血清清蛋白与γ-球蛋白的盐析、透析与浓缩[一]实验试剂和仪器1.试剂（1）血清（2）PBS（3）(NH4)2SO4溶液（4）双缩脲试剂（5）酪蛋白（6）蔗糖（7）蒸馏水（8）BaCl溶液2.用品与仪器（1）离心机（2）烧杯（3）移液管（4）透析袋[二]血清清蛋白与γ-球蛋白的盐析（一）蛋白质盐析的实验原理1.蛋白质分子是生物大分子，其大小恰好在胶体的范围，且分子中亲水基团多位于分子的表面，疏水基团多在分子结构内部。

因此，蛋白质分子在水中能以胶体颗粒存在，形成胶体溶液。

2.蛋白质在水中形成亲水胶体，亲水胶体颗粒有两个稳定因素：（1）胶粒上的电荷；（2）水化膜。

3.蛋白质在水溶液中呈现两性电离。

在环境的pH≠pI时，蛋白质可带正电荷或负电荷。

在某一pH条件，蛋白质带同种电荷，同电相斥，故可吸引水分子（水分子为极性分子），水分子排列围绕在蛋白质分子周围，形成水化膜，使蛋白质分子相互分割开来。

破坏这两个因素或其中某一个因素（破坏了蛋白质胶体的稳定性），易于蛋白质发生沉淀。

4.高浓度盐溶液，在水溶液中电离，其正、负离子吸引水分子，从而夺取水化膜，还可以中和部分电荷。

这样，就不同程度地去掉了上述的两个稳定因素，使蛋白质凝聚、沉淀，这就是蛋白质的盐析。

5.由于各种蛋白质的颗粒大小、带电荷多少及亲水程度的不同，对于同一种中性盐，蛋白质盐析所需最低浓度也不同。

例如：球蛋白不溶于半饱和的(NH4)2SO4溶液，γ-球蛋白不溶于1/3饱和度的(NH4)2SO4溶液，而清蛋白仅不溶于饱和的(NH4)2SO4溶液。

因而。

可以利用不同浓度的(NH4)2SO4溶液使血清或其他混合蛋白质中的这些不同的蛋白质分开。

生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times New Roman；标题用：四号，黑体，加粗。

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一、实验目的1、掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法。

2、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法。

3、了解柱层析技术。

二、实验原理1、粗提（盐析法）：蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素：表面的电荷和水化膜。

当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出。

盐在水溶液中电离所形成的正负离子可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷使蛋白质分子聚集而沉淀，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。

由于血清中各种蛋白质颗粒大小、所带电荷多少及亲水程度不同，因此，利用不同浓度的硫酸铵溶液分段盐析，便可将血清中清蛋白和球蛋白从溶液中沉淀出来，达到初步分离清蛋白、球蛋白的目的。

2、脱盐（凝胶层析法）凝胶层析法利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。

当溶液通过凝胶柱时，溶液中分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱。

而盐的分子量较小，可通过网孔进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，较晚流出层析柱。

从而可达到去盐的目的。

3、纯化（离子交换层析法）离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。

带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。

本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合，带正电荷的离子则不能，这样便可达到分离纯化的目的。

脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们的等电点的不同可进行分离。

血清中各种蛋白质的pI各不相同，因此，在同一醋酸铵缓冲液中，各蛋白质所带的电荷不同，可以通过DEAE离子交换层析将血清清蛋白和γ-球蛋白分离出来。

血清清蛋白、γ-球蛋白的分离纯化与鉴定之答禄夫天创作（一）血清清蛋白、γ-球蛋白的分离与纯化【目的要求】1．了解蛋白质分离提纯的总体思路。

2．掌握盐析法、分子筛层析、离子交换层析等实验原理及操纵技术。

【实验原理】血清中含有清蛋白和各种球蛋白（α-β-γ-球蛋白等），由于它们所带电荷分歧、相对分子质量分歧，在高浓度盐溶液中的溶解度分歧，因此可利用它们在中性盐溶液中溶解度的差别而进行沉淀分离，此法称为盐析法。

本实验应用分歧浓度硫酸铵分段盐析法可将血清中清蛋白、球蛋白初步分离。

在半饱和硫酸铵溶液中，血清清蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，离心后清蛋白主要在上清液中，沉淀的球蛋白加少量水可使其重新溶解。

用盐析法分离而得的蛋白质含有大量的硫酸铵，会妨碍蛋白质的进一步纯化，因此必须去除，经常使用的有透析法、凝胶过滤法等。

本实验采取凝胶过滤法，该法是利用蛋白质与无机盐类之间相对分子质量的差别除去粗制品中盐类。

脱盐后的蛋白质溶液再经DEAE纤维素层析柱进一步纯化。

DEAE纤维素为阴离子交换剂，在pH 6.5的条件下带有正电荷，能吸附带负电荷的α-球蛋白和β-球蛋白（pl分别为4.9、5.06和5.12），而γ-球蛋白（pl7.3）在此条件下带正电荷，不被吸附故直接从层析柱流出，此时收集的流出液即为纯化的γ-球蛋白。

提高醋酸铵溶液的浓度到0.06 mol/L，DEAE纤维素层析柱上的ß-球蛋白及部分a-球蛋白可被洗脱下来。

将醋酸铵溶液的浓度提高至，则清蛋白被洗脱下来，此时收集的流出液即为较纯的清蛋白。

经DEAE纤维素阴离于交换柱纯化的清蛋白、γ－球蛋白液往往体积较大，样品质量分数较低。

为便于鉴定，常需浓缩。

浓缩的方法很多，本实验选用聚乙二醇透析浓缩的方法。

血清清蛋白、γ-球蛋白分离纯化后，选用醋酸纤维薄膜电泳法鉴定其纯度。

【试剂与器材】1.试剂.（1）饱和硫酸铵溶液：称取固体硫酸铵850g加入1000mL蒸馏水中，在70~80℃下搅拌促熔，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵液。

血清蛋白的分离提纯与鉴定血清蛋白的分离、提纯与鉴定血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯于鉴定一、实验目的：1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法5、了解柱层析技术二、实验原理：蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。

对于不同的蛋白质，其分子量、溶解度及等电点等都有所不同。

利用相同蛋白质在这些性质上的差别，利用适当的物理方法可以拆分提纯相同蛋白质。

a.盐析法：在蛋白质溶液中加入大量中性无机盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。

同时，加盐后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，从而破坏了蛋白质的胶体性质，导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间易于聚集沉淀，进而使蛋白质从水溶液中沉淀析出。

b.凝胶层析：利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。

当溶液通过sephadeg-25凝胶柱时，溶液中分子直径小的蛋白质无法步入凝胶颗粒网孔，而分子量大的无机盐能够步入凝胶颗粒的网孔中，因此在洗清过程中，小分子的盐会被迟滞而后洗清出，从而达至回去盐的目的。

c.离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。

d.纯度鉴别（醋酸纤维素薄膜电泳）：血清中各种蛋白质的等电点相同，通常都高于ph7.4。

它们在ph8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。

由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。

因此电泳时可将它们分离为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。

三、材料与方法a材料样品：人混合血清试剂：葡聚糖凝胶（g-25)层析柱、deae纤维离子交换层析柱、饱和硫酸铵溶液、醋酸铵缓冲溶液、20%磺基水杨酸、1ocl2溶液、氨基黑染色液、漂洗液、ph8.6巴比妥缓冲溶液、电泳仪、电泳槽b实验步骤盐析（细拆分）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→deae纤维素色谱法层析（提纯）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴别）具体操作流程示意：（一）盐析+凝胶柱层析除盐：取血清0.8ml，边摇边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液0.8ml，混匀室温放置10min，4000r/min离心10min沉淀（含球蛋白）加水0.6ml溶解上清液（含清蛋白、少量α球蛋白和β球蛋白)过葡聚糖凝胶g-25层析柱（1.0×7cm）过葡聚糖凝胶g-25层析柱（1.0×7cm）用1ml0.02mol/lnh4ac缓冲液清洗层析柱内壁,继续用0.02mol/lph6.5nh4ac 缓冲液(2ml)洗脱，流出液量约1ml时开始检测蛋白质用1ml0.02mol/lnh4ac缓冲液清洗层析柱内壁,继续用0.02mol/lph6.5nh4ac缓冲液洗脱，流出液量约1ml时开始检测蛋白质磺基水杨酸检测蛋白质磺基水杨酸检测蛋白质继续用2ml0.02mol/lnh4ac缓冲液洗涤继续用2ml0.02mol/lnh4ac缓冲液洗涤收集含有蛋白质的峰液12滴收集含有蛋白质的峰液12滴bacl2检测so42-阴性bacl2检测so42-阴性用2-3ml0.02mol/lnh4ac缓冲液再生平衡（二）色谱法层析（提纯）：用2-3ml0.02mol/lnh4ac缓冲液再生平衡除盐后搜集的球蛋白过deae-纤维素层析柱（1.0×6cm）用1ml0.02mol/lnh4ac缓冲液冲洗层析柱内壁,稳步用0.02mol/lph6.5nh4ac缓冲液(3ml)洗清，流入液量约1ml已经开始检测蛋白质挑浓度最低的1管作纯度鉴别（醋酸纤维素薄膜电泳法）磺基水杨酸检测蛋白质搜集所含蛋白质的洗脱液每管及10几滴，已连续搜集3管除盐后搜集的明蛋白deae-纤维素柱不必再造，可以轻易用作提纯清蛋白过deae-纤维素层析柱（1.0×6cm）用1ml0.0６mol/lnh4ac缓冲液冲洗层析柱内壁,用约５ml0.06mol/lnh4ac缓冲液流洗，除去α球蛋白和β球蛋白磺基水杨酸检测蛋白质2管均作纯度鉴别(醋酸纤维素薄膜电泳法)（三）醋酸纤维素薄膜电泳：deae-纤维素柱先用6mll.5mol/lnacl-0.3mol/lnh4ac溶液流洗，再用10ml0.02mol/lnh4ac缓冲液流洗再造均衡搜集所含清蛋白的洗脱液每管及10几滴，已连续搜集2管1、点样（如下图）：-点样线+点样区（粗面）1.5cm2cm点样线尽量点得细窄而均匀,宁少勿多2、电泳：①薄膜细面向下②点样端置阴极端③两端紧贴在滤纸盐桥上，膜应轻轻拉平电压：110v时间：50min3、染色和冲洗：电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。

生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：实验室第一部分一、实验目的二、实验原理一、材料与方法1、实验材料2、实验流程3、操作步骤：粗提 脱盐 纯化 鉴定 盐析法进行粗分离 葡聚糖凝胶G-25层析 DEAE 纤维素离子交换层析 醋酸纤维素薄膜电泳4、注意事项第二部分一、实验结果与处理1、实验现象2、讨论与分析结果：从电泳结果来看，血清蛋白1管没有出现电泳图谱，我们小组的实验没有成功。

实验失败及误差分析：3、思考题a.硫酸铵盐析一步，为什么是0.8ml血清加0.8ml饱和硫酸铵?答：依据的原理：在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度，或达饱和状态，可使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。

0.8ml饱和硫酸铵加到0.8ml血清中有利于血清蛋白析出。

b.为什么实验中DEAE纤维素柱分离γ-球蛋白后不用再生，可直接用于纯化清蛋白?答：当用0.02mol/LNH4Ac，pH6.5分离γ-球蛋白时，清蛋白及a、b 球蛋白的pI＜6.5 ，带负电荷γ-球蛋白pI ＞6.5，带正电荷；此时清蛋白及a、b球蛋白被层析柱吸附，γ-球蛋白被洗脱。

当用0.06mol/LNH4Ac，pH6.5时，a、b球蛋白被洗脱，清蛋白仍被吸附，只有用到0.3mol/L的NH4Ac时，清蛋白才被洗脱出来。

c.应用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定分离纯化后的血清清蛋白和γ-球蛋白的纯度，根据什么来确定它是清蛋白还是γ-球蛋白？判定它们纯度的依据是什么?答：与血清蛋白电泳图谱对照，并根据各种蛋白质的带点性质、分子质量大小以及他们的浓度判断他们在电泳时的相对速度来确定。

判定它们纯度的依据是电泳图谱的宽度以及颜色深浅。

血清清蛋白及γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定目的要求1．1．熟悉蛋白质分离纯化的总体思路。

2．2．掌握盐析、离心、层析、浓缩、电泳等技术在蛋白质分离纯化中的综合作用。

3．3．学会设计和制定分离纯化蛋白质的方法。

实验原理血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类：清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白，其中γ-球蛋白含量约占16％，100ml血清中约含1.2g左右。

首先利用清蛋白和球蛋白在高浓度硫酸铵溶液溶解度的差异而进行沉淀分离，此为盐析法。

半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，经离心分离,沉淀部分即为含有γ-球蛋白的粗制品。

用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此首先必须去除。

常用的方法有透析法、凝胶层析法等。

本实验采用凝胶层析法，其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。

当溶液通过SephadexG--25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中．因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而可达到去盐的目的。

脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们等电点的不同可进行分离。

清蛋白、α－球蛋白、β-球蛋白的PI<6.0；γ－球蛋白的PI为7.2左右。

因此在PH6.3的缓冲溶液中，各类球蛋白所带电荷不同。

经DEAE(二乙基氨基乙基)纤维素阴离子交换层析柱进行层析时，带负电荷的α－球蛋白和β-球蛋白能与DEAE纤维素进行阴离子交换而被结合；带正电荷的γ－球蛋白则不能与DEAE纤维素进行交换结合而直接从层析柱流出。

因此随洗脱液流出的只有γ－球蛋白，从而使γ－球蛋白粗制品被纯化。

其反应式如下：用上述方法分离得到γ－球蛋白是否纯净，单一。

可将纯化前后的γ－球蛋白进行电泳比较而鉴定之。

提高醋酸铵溶液的浓度到0.06 mol/L，DEAE纤维素层析柱上的ß-球蛋白及部分a-球蛋白可被洗脱下来。

生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：第六实验室生物化学与分子生物学实验教学中心一、实验室规则1．实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。

2．进入实验室必须穿白大衣。

严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。

不得高声说话。

严禁拿实验器具开玩笑。

实验室内禁止吸烟、用餐。

3．严格按操作规程进行实验。

实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时请教指导老师。

4．严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告老师，不得擅自拆修。

5．取用试剂时必须“随开随盖”，“盖随瓶走”，即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李戴”，避免污染。

6．爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。

7．注意水、电、试剂的使用安全。

使用易燃易爆物品时应远离火源。

用试管加热时，管口不准对人。

严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。

任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。

8．废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。

废弃液体如为强酸强碱，必须事先用水稀释，方可倒入水槽内，并放水冲走。

9．以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。

实验失败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。

实验完毕，认真书写实验报告，按时上交。

10．实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好，方可离开实验室。

值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁卫生。

离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。

二、实验报告的基本要求实验报告通过分析总结实验的结果和问题，加深对有关理论和技术的理解与掌握，提高分析、综合、概括问题的能力，同时也是学习撰写研究论文的过程。

1．实验报告应该在专用的生化实验报告本上、按上述格式要求书写。

血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯于鉴定一、实验目的：1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法5、了解柱层析技术二、实验原理：蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。

对于不同的蛋白质，其分子量、溶解度及等电点等都有所不同。

利用不同蛋白质在这些性质上的差别，利用相应的物理方法可分离纯化不同蛋白质。

A.盐析法：在蛋白质溶液中加入大量中性无机盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。

同时，加盐后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，从而破坏了蛋白质的胶体性质，导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间易于聚集沉淀，进而使蛋白质从水溶液中沉淀析出。

B.凝胶层析：利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。

当溶液通过SephadeG-25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒网孔，而分子量小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔中，因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而达到去盐的目的。

C.离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。

D.纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳）：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。

它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。

由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。

因此电泳时可将它们分离为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。

三、材料与方法A材料样品：人混合血清试剂：葡聚糖凝胶（G-25)层析柱、DEAE纤维离子交换层析柱、饱和硫酸铵溶液、醋酸铵缓冲溶液、20%磺基水杨酸、1%BaCl溶液、氨基黑染色液、漂洗液、pH8.6巴比妥缓2冲溶液、电泳仪、电泳槽B实验步骤盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定）具体操作流程示意：（一）盐析+凝胶柱层析除盐：（二）离子交换层析（纯化）：（三）醋酸纤维素薄膜电泳：1、点样（如下图）：-点样线尽量点得细窄而均匀,宁少勿多2、电泳：①薄膜粗面向下②点样端置阴极端③两端紧贴在滤纸盐桥上，膜应轻轻拉平电压：110V时间：50min3、染色和漂洗：电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。