凝血酶滴定法测定水蛭素活性步骤

检验操作规程
标准曲线含量公式： ()%100×1A ×A ×C 水分样对样对-⨯=M n 矿物类含量计算公式： 5.004×（B-A ）×稀释倍数×C 样 含量%= ×100% m ×1000×（1-水分） 【含量测定】 本品每1g 含抗凝血酶活性水蛭应不低于16.0U ；蚂蟥、柳叶蚂蟥应不低于3.0U 。

仪器与试剂：分析天平、离心机、数显恒温水浴锅、氯化钠等。

方法：取本品粉末（过三号筛）约1g ，精密称定，精密加入0.9%氯化钠溶液5ml ，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，精密量取上清液100μl ，置试管（8mm ×38mm ）中，加入含0.5%（牛）纤维蛋白原（以凝固物计）的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液[注1]（临用配制）200μl ，摇匀，置水浴中（37℃±0.5℃）温浸5分钟，滴加每1ml 中含40单位的凝血酶溶液[注2]（每1分钟滴加1次，每次5μl ，边滴加边轻轻摇匀）至凝固（水蛭）或滴加每1ml 中含10单位的凝血酶溶液[注2]（每4分钟滴加1次，每次2μl ，边滴加边轻轻摇匀）至凝固（蚂蟥、柳叶蚂蟥），记录消耗凝血酶溶液的体积，按下式计算： U=（C 1V 1/C 2V 2） 式中 U -- 每1g 含凝血酶活性单位，U/g ； C 1 -- 凝血酶溶液的浓度，μ/ml ； C 2 -- 供试品溶液的浓度，g/ml ； V 1 -- 消耗凝血酶溶液的体积，μl ； V 2 -- 供试品溶液的加入量，μl 。

中和一个单位的凝血酶的量，为一个抗凝血酶活性单位。

海南水蛭中水蛭素的抗凝活性研究刘腾;符乃光;李泽友【摘要】Objective To analyze the species of Hainan leeches and the anticoagulant activity of hirudin. Methods The morphological characteristics and thin-layer chromatogram of Hainan leech were observed. Then anti-coagulant activity was measured with the method of thrombin titration. Results Hainan leeches were Hirudinaria ma-nillensis. The anticoagulant activity of Hainan Leech hirudin was 1 174.8 U/g of whole body, 6 521.7 U/g of the head and 308.6 U/g of the body. Conclusion Hainan leeches have very good anticoagulant activity, which deserve further research and development.%目的：分析海南水蛭的品种及其中水蛭素的抗凝作用。

方法观察海南水蛭的形态特征、薄层色谱图，并采用凝血酶滴定法测定其抗凝活性。

结果海南水蛭为菲牛蛭，水蛭素的抗凝活性分别为：全身1174.8 U/g、头部6521.7 U/g、身体308.6 U/g。

结论海南水蛭具有很好的抗凝血活性，值得进一步研究开发。

【期刊名称】《海南医学》【年(卷),期】2015(000)016【总页数】3页(P2345-2346,2347)【关键词】海南水蛭;水蛭素;薄层色谱;凝血酶【作者】刘腾;符乃光;李泽友【作者单位】海南医学院药学院，海南海口 571199;海南医学院药学院，海南海口 571199;海南医学院药学院，海南海口 571199【正文语种】中文【中图分类】R282.74中药水蛭具有抗凝血、抗肿瘤、提高免疫力、降血脂等多种药理活性，临床上用于治疗多种疾病[1]。

凝血酶滴定法测定水蛭素活性步骤实验目的：凝血酶滴定法测定水蛭素活性含量实验仪器和试剂:电子天平 酸度计 离心机 移液器 ４5度试管架 三羟甲基氨基甲烷（Tris ） 盐酸（Hcl) 生理盐水 蒸馏水 凝血酶 纤维蛋白原及常用玻璃仪器实验步骤：１、称取1.2１g 三羟甲基氨基甲烷加蒸馏水充分溶解,定溶到50ml,浓度为０.２mol/L 。

2、用移液器取４29ul 盐酸加蒸馏水充分溶解,定溶到５０ml ，浓度为0.1ml/Ｌ。

３、从1去25ｍl,从2取４0ｍl 混合调ＰＨ到７.4（用1或2调)，加蒸馏水定溶到10０ml 。

4、称取样品1g 放入试管加生理盐水5ｍl 充分溶解30分钟。

5、把4放入离心机离心10分钟,4000转/分。

6、取3(Ｔri ｓ缓冲液)１.6ｍl,稀释纤维蛋白原0.00８g,浓度0．5%。

7、用生理盐水配制40u/ml 的凝血酶溶液。

８、从5取上清液10０ul 。

９、从6取200ｕl 加入８充分摇匀后，吹一小气泡。

10、从７每分钟取5ul 加入9迅速摇匀后，匀速转动试管,观察反应,溶液上的小气泡随液面转动时视为反应的终点（记录好滴加凝血酶的次数)。

11、计算公式为:2211V C V C U其中C1=凝血酶的浓度Ｃ２=样品的浓度V１＝滴加凝血酶的体积V2=取样的体积注：1、滴加次数超过５次还不凝固的,应按一定倍数稀释样品。

2、为了提高滴定的准确度可梯度配用不同浓度的凝血酶溶液。

3、为了提高滴定的准确度同时也可在临近凝固的下一次滴加凝血酶5ｕ/次，改为４ｕ/次,3ｕ/次，2ｕ/次，１u/次。

4、如果样品是溶液，直接取样10０uｌ检测,检测步骤和计算方法不变。

5、如果样品是可溶性粉状物，加溶液溶解后,取溶液1０0uｌ检测,检测步骤和计算方法不变。

XXXXXXXXXX 有限公司原料质量标准及检验操作规程1品名：1.1中文名：水蛭1.2汉语拼音：Shuizhi2代码：3取样文件编号：4检验方法文件编号：5依据：《中国药典》（2020年版一部）6质量标准：7.1试药与试剂：乙醇、水蛭对照药材、环已烷、乙酸乙酯、盐酸、10% 硫酸乙醇溶液、0.9%氯化钠溶液、1ml中含40单位的凝血酶溶液、0.5%（牛）纤维蛋白原（以凝固物计）的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液。

7.2仪器与用具：电子天平、超声波处理器、硅胶G薄层板、紫外光灯、烘箱、马福炉、离心机、水浴锅。

7.3性状：取本品适量，自然光下目测色泽，嗅闻气味。

7.4鉴别：取本品粉末1g,加乙醇5ml，超声处理15分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。

另取水蛭对照药材1g，同法制成对照药材溶液。

照薄层色谱法（附录7）试验，吸取上述两种溶液各5卩」分别点于同一硅胶G薄层板上，以正已烷-乙酸乙酯（4: 1 ）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105C加热至斑点显色清晰。

供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点；紫外光灯（365nm）下显相同的橙红色荧光斑点。

7.5检查：7.5.1水分：不得过18.0% （附录15第二法）。

7.5.2总灰分：不得过10.0% （附录17）。

7.5.3酸不溶性灰分：不得过2.0% （附录17）。

7.5.4酸碱度：取本品粉末（过三号筛）约1g,加入0.9%氯化钠溶液10ml，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，精密量取上清液照pH值测定法（附录11）测定，应为4.5~6.5。

7.5.5重金属及有害元素照铅、镉、砷、汞、铜测定法（附录35原子吸收分光光度法或电感耦合等离子体质谱法）测定，铅不得过十万分之一；镉不得过百万分之一；砷不得过百万分之五；汞不得过百万分之一；7.5.6黄曲霉毒素照黄曲霉毒素测定法（附录50）测定。

取本品粉末约5g,紧密称定，加氯化钠3 g,照黄曲霉毒素测定法项下的供试品的制备方法，测定，计算，即得。

产品中天然水蛭素的测定方法（《中国药典》2010年版1部规定的测定方法）方法提要（凝血酶滴定法）水蛭素能与凝血酶直接结合，使凝血酶失活，其结合比例为1:1，抗凝血酶单位以ATU 表示，即每消耗一个凝血酶单位(U)相当于一个抗凝血酶单位(ATU) 。

仪器设备0.75cm×10cm小试管；微量移液器（1～500μl、1～5ml）；45 度角试管架；秒表；恒温水浴箱；分析天平，感量0.0001克；pH测试仪；普通玻璃仪器。

试剂（人）纤维蛋白原；凝血酶； 0.2 mol/L的 Tris-Hcl缓冲液（pH7.4）；0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液；0.1mol/L盐酸溶液；氯化钠；0.9％生理盐水。

溶液的配制1、Tris-HCl缓冲液（pH7.4）的配制将0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液约25 ml、0.1mol/L盐酸溶液约40ml和氯化钠0.8766g混合、溶解，调节pH值至7.4，然后加蒸馏水定容100ml(含0.15 mol 氯化钠)即成Tris-HCl缓冲溶液，备用。

2、0.5％（人）纤维蛋白原的配制用上述已配制好的Tris-HCl缓冲溶液溶解（人）纤维蛋白原，配成0.5%纤维蛋白原溶液（以凝固物计，现用现配），备用。

3、凝血酶溶液的配制用0.9％生理盐水配制成凝血酶浓度为40 U/ml的溶液（现用现配），备用。

分析步骤取1g样品粉末（过三号筛），精密称定，精密加入0.9％氯化钠溶液5ml，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，精密量取上清夜100μl置试管中，加入0.5％（人）纤维蛋白原溶液200μl、摇匀，用移液器在试管内的溶液中吹一小气泡作为观察标记（注意避免产生其它气泡），接着加入已配制好的凝血酶溶液，轻轻摇匀（3～5s，下同）、计时，然后将试管插入位于37℃恒温水浴箱的45 度角试管架中，轻轻旋转并观察气泡随液面转动情况，如气泡随液面转动即为反应终点，否则按每分钟滴加5μl凝血酶溶液至凝固（如滴加凝血酶溶液次数超过5次不凝固者应稀释样品，直至在3～5次为止）。

兰州大学硕士学位论文中文摘要本试验对传统活血化瘀中药水蛭的抗凝血活性部位进行了提取、分离和纯化。

建立了水蛭提取液蛋白含量测定及抗凝活性测定的质控方法。

以水蛭提取液中蛋白质含量及活化部分凝血活酶时间（ＡＰＴＴ）为指标分别考察药材在不同溶媒、温度、提取时间、溶媒倍量及提取次数条件下的提取效果。

在此基础上对水蛭提取物的抗结石、抗纤维化的药理作用进行了初步研究。

初步建立了在６０＂（２条件下，采用ｌＯ倍于药材重量的４％ＮａＣｌ水溶液分３次提取药材６ｈ（３ｈ＋２ｈ＋ｌｈ），作为干品宽体金线蛭的提取工艺。

采用１０倍于药材重量的４％ＮａＣｌ水溶液，在３０℃条件下分３次提取药材６ｈ（３ｈ＋２ｈ＋ｌｈ），作为活体蛭的最佳提取工艺。

本试验考察了水蛭提取物对抗酸损伤（Ｏ．１ＭＨＣＬ）致大鼠膀胱粘膜上草酸钙沉积的作用。

发现与肝素类似，水蛭提取物可覆着在已受化学损伤的膀胱粘膜上，抑制草酸钙在膀胱粘膜上的粘附作用。

其抗草酸钙沉积作用优于肝素。

水蛭提取液也可溶解部分白内障皮质变性蛋白，但纤溶活性很弱，不随时间而延长。

其纤溶活性仍需通过进一步药理试验加以证明。

关键词；水蛭；提取工艺；质量控制｛抗结石；抗纤维化兰州大学硕士学位论文ＡｂｓｔｒａｃｔＴｈｅａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎｓｅｇｍｅｎｔｏｆｔｈｅＣｈｉｎｅｓｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｅｄｉｃｉｎｅＬｅｅｃｈｈａｄｂｅｅｎｅｘｔｒａｃｔｅｄａｎｄｉｓｏｌａｔｅｄ．ＴｈｅｍｅｔｈｏｄｓｏｆｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｗｉｔｈｐｒｏｔｅｉｎｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎａｎｄａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒａｗｍａｔｅｒｉａｌｗｅｒｅａｌＳＯｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｔｈｅｆａｃｔｏｒｓｓｕｃｈａｓｓｏｌｖｅｎｔｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｔｉｍｅ，ｔｈｅｆｏｌｄｏｆｓｏｌｖｅｎｔａｎｄｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄａｆｆｅｃｔｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｆｔｈｅＷｈｉｔｍａｎｉａＰｉｇｍＷｈｉｎｌｓ．ｎｈａｄｂｅｅｎｈａｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅｗａｓｓｅｌｅｃｔｅｄ谢ｔｈＡｃｔｉｖａｔｅｄＰａｒｔｉａｌＴｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎＴｉｍｅ（ＡＰＴｌ）ａｎｄｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｐｒｏｔｅｉｎｉｎｅｘｔｒａｃｔｆｒｏｍｌｅｅｃｈ．Ｏｎｔｈｅｂａｓｉｓｏｆａｌｌｔｈｅｗｏｒｋ，ｔｈｅｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｆｒｏｍｌｅｅｃｈｔｈａｔＣａｌｌｒｅｓｉｓｔｃａｌｃｕｌｕｓａｎｄｆｉｂｒｏｓｉｓｗｅｒｅｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｅｖａｌｕａｔｅｄ．ＴｈｅｏｐｔｉｍｕｍｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｄｒｙＷｈｉｔｍａｎｉａＰｉｇｒａＷｈｌｍＲＩｌｗｅｒｅｆｏｌｌｏｗｅｄａｓ：ａｄｄｉｎｇ１０ｆｏｌｄｏｆ４％ＮａＣｌｓｏｌｖｅｎｔ，ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｆｏｒ６ｈｕｎｄｅｒ６０。

蚂蝗抗凝血酶活性物质提取工艺改进 【编者按】医药论文是科技论文的一种是用来进行医药科学研究和描述研究成果的论说性文章。

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 蚂蝗抗凝血酶活性物质提取工艺改进 【摘要】目的通过正交实验研究中药水蛭中抗凝血酶活性物质提取的最佳工艺。

方法采用正交实验设计法，以提取温度，生理盐水用量，提取次数和提取时间为考察因素，每个因素设计3个水平进行实验。

以测得的水蛭素含量和蛋白质含量计算出水蛭素的比活力做为评价指标进行正交实验。

结果最佳提取工艺为：15倍溶剂量，温度为70℃，提取时间为30 min，提取次数为两次。

结论该方法可为中药水蛭中抗凝血酶活性物质的提取提供依据。

 【关键词】水蛭素; 蛋白质; 正交实验; 提取工艺 水蛭是传统的破血逐瘀药，始载于《神农本草经》，《中国药典》2005年版收载了水蛭Hirudo nipponica Whitman，蚂蝗Whitmania pigra Whitman和柳叶蚂蝗W.acranulata Whitman 3种[1]。

水蛭在抗凝血、抗血栓形成等方面有着很强的生物活性，其中水蛭素是迄今为止发现的最强的凝血酶抑制剂之一。

在中国水蛭临床用药多为炮制品，其炮制方法多样，质量各异，标准不一。

经过调查，市售的炮制品水蛭多为开水烫制水蛭(清水水蛭)和滑石粉炒制水蛭，然而随着研究的不断深入，越来越多的学者认为生用效果更佳[2]，所以本实验采用风干的生水蛭也就是吊干水蛭进行研究。

 正交实验设计可以用较少的、有代表性的处理组合数提供充分有用的信息，与普通的多因素试验设计相比，它在分析主效应与交互作用的同时大大减少了样本量及实验次数，是一种高效、灵活的多因素试验设计方法，因此被广泛应用于科学研究中。

目前对水蛭抗凝血活性物质提取的报道特别是对提取工艺研究的报道较少，为了有效地开发和利用药材资源，充分提取水蛭中抗凝血活性成分，本实验采用正交实验的方法对传统提取方法进行了改进，确定了生理盐水提取水蛭中抗凝血酶活性成分的最佳提取工艺，为水蛭资源的开发和抗凝血物质的提取提供科学依据。