2狂犬病实验室检测技术指南

全国狂犬病监测方案(试行)正文：---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 全国狂犬病监测方案(试行)（2005年9月8日）一、概述狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种人兽共患传染病，按《中华人民共和国传染病防治法》的规定为乙类传染病。

许多种类的哺乳动物都与狂犬病的传播有关，犬是发展中国家人狂犬病最主要的储存宿主和传播宿主。

人感染狂犬病最常见的方式是通过感染狂犬病毒的犬、猫、野生食肉动物以及食虫和吸血蝙蝠的咬伤、挠抓、舔舐皮肤或粘膜破损处而感染。

狂犬病毒主要通过破损的皮肤或粘膜侵入人体，经神经末梢上行进入中枢神经系统，临床表现主要为急性、进行性、几乎不可逆转的脑脊髓炎，病死率100％。

狂犬病在世界范围内广泛分布。

据1999年世界狂犬病调查报告，145个国家和地区中仅有45个无狂犬病报告。

近年来，我国狂犬病疫情一直呈上升趋势，病死数居我国37种法定报告传染病首位。

1996年全国报告狂犬病发病数曾一度较低，为159例，而2004年全国狂犬病报告发病数上升至2660例，与2003年同期相比上升30.58%。

2004年狂犬病死亡人数占我国法定报告传染病总死亡构成的35.72%。

我国的广西、湖南、江苏、安徽、湖北、广东和贵州等省份近年来疫情持续上升，疫情形势十分严峻。

因此，建立全国狂犬病监测系统，在狂犬病多发地区开展监测，分析狂犬病流行因素、掌握狂犬病的疫情特点与流行趋势，对于狂犬病的预防和控制具有重要的意义。

二、监测目的（一）掌握我国狂犬病的疫情动态和流行规律，分析流行因素，为制定有效的预防控制措施提供科学依据。

（二）了解狂犬病暴露后预防处置现状，评价预防处置效果，为进一步规范暴露后预防处置提供依据。

RT-PCR检测
以提取的RNA为模板，进行逆转录聚合酶链式 反应（RT-PCR），扩增病毒特异性基因片段， 从而判断标本中是否存在狂犬病毒。
标本保存和运输要求
低温保存
标本应保存在-70℃以下的超低 温冰箱中，以确保病毒的活性 和稳定性。
避光保存
避免标本长时间暴露在光线下 ，以免影响病毒活性。
密封运输
02
预防和控制狂犬病需要政府、社会和个人的共同努力，包括加
强疫苗接种、提高公众认知、加强动物管理等措施。
通过有效的预防和控制措施，可以保护人类和动物的健康，维
03
护社会公共卫生安全。
02
实验室诊断方法概述
实验室诊断目的和意义
确诊狂犬病感染
通过实验室诊断方法，可以准确检测狂犬病病毒的 存在，从而确诊狂犬病感染，为临床治疗提供依据 。
实验室空气、表面和水源等也 应定期进行消毒处理，以减少 环境中病原体的传播风险。
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04
血清学检测方法
酶联免疫吸附试验
原理
将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行， 通过洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后根据酶作用于底物后显色来判断结果。
应用
ELISA法可用于检测狂犬病病毒抗原、抗体等，具有灵敏度高、特异性强、操作简便、 可批量检测等优点。
注意事项
操作过程中需注意避免交叉污染，设置阴阳性对照，严格控制反应条件等。
荧光抗体技术
原理
用荧光物标记抗体，与待测标 本中的相应抗原或抗体结合， 形成带荧光的抗原抗体复合物 ，在荧光显微镜下观察荧光以 判断结果。
应用
荧光抗体技术可用于狂犬病病 毒的快速诊断和病原学研究， 具有灵敏度高、特异性强、直 观快速等优点。

《狂犬病预防控制技术指南（2016 版）》暴露分级与处置1.暴露分级 I 级暴露：符合以下情况之一者：（ 1）接触或喂养动物；（ 2）完好的皮肤被舔；（ 3）完好的皮肤接触狂犬病动物或人狂犬病病例的分泌物或排泄物。

II 级暴露：符合以下情况之一者：（ 1）裸露的皮肤被轻咬；（ 2）无出血的轻微抓伤或擦伤。

首先用肉眼仔细观察暴露处皮肤有无破损；当肉眼难以判断时，可用酒精擦拭暴露处，如有疼痛感，则表明皮肤存在破损（此法仅适于致伤当时测试使用）。

III 级暴露：符合以下情况之一者：（1）单处或多处贯穿皮肤的咬伤或抓伤（“贯穿”表示至少已伤及真皮层和血管，临床表现为肉眼可见出血或皮下组织）；（ 2）破损皮肤被舔舐（应注意皮肤皲裂、抓挠等各种原因导致的微小皮肤破损）；（ 3）粘膜被动物唾液污染（如被舔舐）；（ 4）暴露于蝙蝠（当人与蝙蝠之间发生接触时应考虑进行暴露后预防，除非暴露者排除咬伤、抓伤或粘膜的暴露）。

注：a.暴露于啮齿类动物、家兔或野兔时通常无需接受狂犬病暴露后免疫预防。

b.禽类、鱼类、昆虫、蜥蛎、龟和蛇不会感染和传播狂犬病。

（美国CDC明确指出：所有的哺乳动物都可患狂犬病。

禽类、鱼类、昆虫、蜥蜴、龟和蛇不属于哺乳动物，不会感染和传播狂犬病。

）c.发生在头、面、颈部、手部和外生殖器的咬伤属于 III 级暴露。

（ WHO推荐：由于头、面、颈、手和外生殖器部位神经丰富，建议这些部位的暴露属于III 级暴露） d.暴露于蝙蝠属于III 级暴露。

e. 暴露后预防处置应立即开始。

如果伤人动物在10 日观察期内保持健康，或经可靠的实验室使用恰当诊断技术证明该动物未患狂犬病，则可以终止免疫接种。

2．暴露后处置 2.1 暴露后预防处置的内容包括：①尽早进行伤口局部处理；②尽早进行狂犬病疫苗接种；③需要时，尽早使用狂犬病被动免疫制剂（狂犬病人免疫球蛋白、抗狂犬病血清）。

2.2判定暴露级别后，应根据需要尽早进行伤口处理；在告知暴露者狂犬病危害及应当采取的处置措施并获得知情同意后，采取相应处置措施（详见表3）。

狂犬病病毒实验室检测方法摘要：狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，近年来又有感染上升的趋势。

一种准确、灵敏、快速的实验室检测诊断方法就显得极为重要。

现就酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体方法（FAT）、快速荧光抑制灶技术（RFFIT）、反转录－聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量RT-PCR，基因芯片技术和恒温扩增技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述。

关键词：狂犬病狂犬病病毒检测方法狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁、急性致死性脑脊髓炎，进行性麻痹和最终死亡为主要临床特征。

RV可感染多种温血动物引起死亡，表现为高度嗜神经性。

脑组织感染RV后遭到破坏，使得狂犬病感染的病死率几乎100%。

据WHO数据显示狂犬病在全世界150个国家和地区出现过狂犬病病例。

尽管狂犬病可以通过疫苗免疫进行预防，全世界每年仍有超过5.5 万人死于该病，主要集中在亚、非、拉等发展中国家[1]。

中国狂犬病疫情较严重，居世界第2位[2~3]，近年来，狂犬病疫情呈现回升的趋势[4]。

检测狂犬病抗原抗体、分析狂犬病的流行特点，并建立高效、快速、可靠的实验室检测方法可以有效控制此病的流行。

下面主要针对RV的形态特征和分子结构及主要的检测技术进行概述。

1、狂犬病病毒形态特征RV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）血清/基因1 型，单股负链RNA病毒。

电镜下观察病毒粒子直径为70～80nm，长160～240nm，一端钝圆，另一端平凹，整体呈子弹状[5]。

病毒有双层脂质外膜，其外面镶嵌有1072-1900个8-10nm长的纤突(spike)，为糖蛋白，每个糖蛋白呈同源三聚体形式，电镜还显示了糖蛋白具有“头”和“茎”结构。

狂犬病病毒实验室检测方法摘要：狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，近年来又有感染上升的趋势。

一种准确、灵敏、快速的实验室检测诊断方法就显得极为重要。

现就酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体方法（FAT）、快速荧光抑制灶技术（RFFIT）、反转录－聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量 RT-PCR，基因芯片技术和恒温扩增技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述。

关键词：狂犬病狂犬病病毒检测方法狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁、急性致死性脑脊髓炎，进行性麻痹和最终死亡为主要临床特征。

RV可感染多种温血动物引起死亡，表现为高度嗜神经性。

脑组织感染RV后遭到破坏，使得狂犬病感染的病死率几乎 100%。

据WHO数据显示狂犬病在全世界150个国家和地区出现过狂犬病病例。

尽管狂犬病可以通过疫苗免疫进行预防，全世界每年仍有超过 5.5 万人死于该病，主要集中在亚、非、拉等发展中国家[1]。

中国狂犬病疫情较严重，居世界第2位[2~3]，近年来，狂犬病疫情呈现回升的趋势[4]。

检测狂犬病抗原抗体、分析狂犬病的流行特点，并建立高效、快速、可靠的实验室检测方法可以有效控制此病的流行。

下面主要针对RV的形态特征和分子结构及主要的检测技术进行概述。

1、狂犬病病毒形态特征RV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）血清/基因 1 型，单股负链RNA病毒。

电镜下观察病毒粒子直径为70～80nm，长160～240nm，一端钝圆，另一端平凹，整体呈子弹状[5]。

病毒有双层脂质外膜，其外面镶嵌有1072-1900个8-10nm长的纤突(spike)，为糖蛋白，每个糖蛋白呈同源三聚体形式，电镜还显示了糖蛋白具有“头”和“茎”结构。

附件2 狂犬病实验室检测技术指南1、实验室条件及生物安全操作要求（1）从事狂犬病临床和实验室的工作人员需要暴露前免疫，所有意外暴露于狂犬病毒时必需立即报告本部门负责人。

（2）操作所有潜在狂犬病感染的材料均应在P2或P3（实验室固定毒在P2，病人或动物分离的街毒在P3）生物安全实验室内进行。

（3）当实验室对接收到的动物标本进行操作时，必须在P3以上条件的专业实验室中进行。

没有安全实验室（P3级）的单位，严禁从事病毒分离工作。

（4）实验前要穿戴好防护服装、眼镜、手套，作好技术上的准备。

（5）由于空气传播狂犬病毒已经得到证实，因此高速混悬或离心操作应在密闭状态下进行。

（6）实验后要作好善后消毒处理,狂犬病毒对脂溶剂（肥皂水、醚、氯仿、丙酮），45～70%乙醇，碘制剂和四铵化合物敏感，操作完毕对操作台、实验材料等要用相应的消毒剂或高压蒸汽进行消毒处理。

2、实验室检测网络组成及职责（1）中国疾病预防控制中心牵头，全国各省级疾病预防控制中心及所辖区域内的各级疾病预防控制中心组成实验室检测网络。

（2）中国疾病预防控制中心职责A.诊断试剂的研制、标准化，并推荐质量稳定可靠的诊断试剂；B.负责毒株的鉴定和病毒变异性调查；C.对各级实验室检测人员进行技术培训。

D.协助省级疾病预防控制中心完成标本的实验室检测。

（3）省级疾病预防控制中心职责A.收集、保存辖区内各监测点的各种待检测标本。

B.辖区内各种标本的实验室检测。

C.对本省监测点标本采集和运送给与技术指导和协助。

（4）县级监测点疾病预防控制中心职责采集病例标本，运送病例标本至省级疾病预防控制中心。

3、实验室检测方法（1）病原检测：A.免疫荧光法检测抗原：病人的脑脊髓液或唾液直接涂片、病人的角膜印片或咬伤部位皮肤组织或脑组织印片或冷冻切片，丙酮固定，抗狂犬病毒特异性荧光抗体染色检测狂犬病毒抗原。

B.快速狂犬病酶联免疫吸附法检测抗原：用pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释的抗狂犬病毒核衣壳IgG包被96孔酶标板，4℃过夜；用含0.3％牛血清白蛋白和5% 蔗糖的pH9.6碳酸盐缓冲液封闭30分钟；将采集到的标本研磨，用pH 7.4 PBS 制成30％的悬液，离心取上清加入酶标板孔内，同时设阴性、阳性对照，200 µ l/孔，37℃孵育1小时；洗板四次后加入纯化的酶标记抗狂犬病毒抗体200μl/孔，37℃l小时后洗板，加入酶反应底物，室温作用30分钟，2M H2SO4终止反应，肉眼观察或酶标仪测定结果。

狂犬病实验室诊断一、狂犬病实验室诊断病人发病后（死亡前）可采集其唾液（间隔3-6小时，至少采集3份）、脑脊液、血清及颈后带毛囊的小块皮肤；病人死后最好采集其脑组织标本（小脑和脑干）进行实验室检测。

直接免疫荧光法是狂犬病诊断的金标准，可以快速、敏感、特异地检测人和动物脑组织中的病毒抗原。

临床病例活体组织标本（如颈后部皮肤毛囊）亦可进行DFA检测。

直接快速免疫组化法及酶联免疫吸附测定法亦可特异检测狂犬病病毒抗原。

病毒核酸检测可用于早期诊断，以逆转录PCR法检测体液（唾液、血清等）和脑组织等标本，但需要严格的质量控制以保证结果的准确性。

脑组织及唾液等病毒含量高的样本还可进行病毒分离。

细胞培养分离所需时间（1-2天）远少于小鼠颅内接种分离法所需时间（10-21天），且前者的生物安全风险远小于后者。

未接种过疫苗的患者，发病早期几乎没有中和抗体产生，到发病晚期（通常在临床症状出现后7-8天），病毒在脑内大量增殖后突破血脑屏障进入血液，刺激机体产生低水平的中和抗体。

通过病毒中和试验检测病人血清或脑脊液中的中和抗体，可作为狂犬病诊断的依据之一。

世界卫生组织（WHO）推荐的抗狂犬病病毒中和抗体标准检测方法包括快速荧光灶抑制试验（RFFIT）和小鼠脑内中和试验（MNT）。

由于RFFIT法无需使用小鼠，所用时间短（24小时），目前已被广泛采用。

RFFIT方法也是我国现行药典规定的检测狂犬病病毒中和抗体的标准方法之一。

此外，常用的狂犬病病毒中和抗体检测方法还有荧光抗体病毒中和试验（FAVNT）。

用ELISA法测定的抗狂犬病病毒糖蛋白抗体滴度与用病毒中和试验测定的结果有一定的相关性（约80%符合率），但相应试剂盒尚未普及。

此外，还可以通过检测中和抗体，监测暴露前抗体背景及暴露后疫苗注射的免疫效果。

WHO狂犬病专家咨询委员会认为：中和抗体水平等于或高于0．5IU/ml时，接种者才具备了有效的保护能力；如果发现中和抗体水平低于0．5IU/ml，应进行加强免疫，至达到有效保护水平为止。

狂犬病的实验诊断方法狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的致命的神经系统疾病。

早期的病毒检测方法依赖于动物的大脑组织或脊髓液样本，但这些方法不仅需要病毒在大脑中进行复制，而且也有传播病毒的风险。

因此，近年来，研究人员已经发展出一些实验室诊断方法来检测狂犬病病毒。

目前，主要的实验室诊断方法包括直接免疫荧光试验（Direct Immunofluorescence Assay，DFA）、滴度测定法（VirusNeutralization Test，VNT）、聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）和免疫组织化学染色（Immunohistochemistry，IHC）。

直接免疫荧光试验是一种常用的狂犬病病毒检测方法。

它使用特异性单克隆抗体来识别狂犬病病毒的抗原。

通过在疾病动物的脑组织切片上施加单克隆抗体并且经过染色，病毒抗原会与抗体结合形成荧光染色，并通过荧光显微镜观察。

这种方法的优点是快速和准确，可以在病毒分离和动物死亡之前得出结果。

然而，它需要经过训练的实验室技术人员进行操作，并且有时可能出现假阴性结果。

滴度测定法是通过将狂犬病病毒与病毒中和抗体混合来测定病毒的滴度。

该方法基于当病毒与病毒中和抗体结合时，不能侵入新宿主细胞。

这种方法需要一定时间，通常需要3-5天才能得到结果。

这种方法的优点是可以测定病毒的效价，并且可以用于评估深度冷冻疫苗的效果。

然而，该方法需要繁琐的操作步骤，并且对实验室条件要求较高。

聚合酶链式反应是一种在检测狂犬病病毒中应用广泛的方法。

它通过扩增病毒RNA或DNA的特定区域来检测病毒。

首先，通过提取样品中的RNA或DNA，然后进行逆转录反应（对于RNA）或核酸扩增反应（对于DNA）以合成相应的cDNA或DNA，并最后通过PCR扩增目标区域。

这种方法极其敏感，可以检测到非常低浓度的病毒，但在操作过程中需要谨慎处理以避免污染。

此外，PCR方法已经逐渐从传统的实验室检测中发展到快速诊断方法，如实时定量PCR。

《狂犬病预防控制技术指南》要点摘要狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的一种动物源性传染病，临床大多表现为特异性恐风、恐水、咽肌痉挛、进行性瘫痪等。

近年来，狂犬病报告死亡数一直位居我国法定报告传染病前列，给人民群众生命健康带来严重威胁。

为指导基层疾控机构做好狂犬病的预防控制工作，尤其是暴露后的预防处置，降低狂犬病所致死亡，中国疾病预防控制中心组织专家，参考世界卫生组织和美国疾控中心的技术指南，以及国内外最新研究进展，制定了《狂犬病预防控制技术指南（2016 版）》。

本指南系统回顾了狂犬病的病原学、临床学、实验室诊断、流行病学、疫苗和被动免疫制剂的种类、机理、效果、安全性和不良反应监测与处置，以及暴露预防处置方法等内容的科学证据，在此基础上对狂犬病暴露前和暴露后预防处置的伤口处置、疫苗接种和被动免疫制剂使用等技术给出了推荐建议。

本指南适用于从事狂犬病防控工作的各级各类疾病预防控制机构、狂犬病暴露预防处置门诊、医疗机构感染科和急诊科等专业人员。

根据狂犬病的国内外研究进展，本指南今后将不断更新、完善。

前言狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabies virus）感染引起的一种动物源性传染病。

狂犬病病毒主要通过破损的皮肤或粘膜侵入人体，临床大多表现为特异性恐风、恐水、咽肌痉挛、进行性瘫痪等。

近年来，狂犬病报告死亡数一直位居我国法定报告传染病前列，给人民群众生命健康带来严重威胁。

暴露后处置是暴露后预防狂犬病的唯一有效手段。

世界卫生组织认为，及时、科学和彻底的暴露后预防处置能够避免狂犬病的发生。

为指导基层疾控机构做好狂犬病预防控制工作，尤其是暴露后的预防处置，降低狂犬病所致死亡，中国疾病预防控制中心组织专家，参考世界卫生组织和美国疾控中心的技术指南，以及国内外最新研究进展，制定了《狂犬病预防控制技术指南（2016 版）》。

本指南适用于从事狂犬病防控工作的各级各类疾病预防控制机构、狂犬病暴露预防处置门诊、医疗机构感染科和急诊科等专业人员。

生物安全级别＆对工作人员的要求
(Biological Safety Level, BSL ) (Protection, P ) BSL-1：实验人员在实验程序方面受过特殊训练，由受 过微生物学或相关科学一般训练的科学工作者监督实验。 BSL-2：实验人员均接受过病源处理方面的特殊培训， 并由有资格的科学工作者指导。 BSL-3：实验人员应在处理致病性的和可能使人致死的 病源方面受过专业训练，并由对该病源工作有经验的、 有资格的科学工作者监督。 BSL-4：实验室成员应在处理特别危险的传染源方面受 过特殊和全面的训练，应了解标准和特殊操作中一级和 二级遏制的作用、遏制设备、实验室设计性能。实验由 在有关病源方面受过训练、并有工作经验的、有资格的 科学工作者监督。
荧光标记抗 狂犬病毒抗体
狂犬病毒抗原
荧光抗体实验检测狂犬病毒抗原
FAT的技术要求：
—— 由于狂犬病毒多分布在动物脑海马回及脑干处， 因此合适的取样部位对抗原的检测很重要。 —— 脑样品印片必须用丙酮固定 5-10 分钟，因为丙酮 可去除细胞膜表面的脂类，以便抗体到达细胞内与狂 犬病毒结合。 ——脑样品必须保存在含50%甘油的生理盐水中，印片 染色前需用生理盐水洗涤数次。 ——荧光标记抗体需最大限度降低非特异性反应，因 此制备特异性、高效价的抗体是FAT的关键。
2) 唾液腺的获取
为取出颌下腺，在复盖于下颌骨间 的皮肤上作一切割，将皮肤往外侧翻， 两侧的颌下腺位于颌骨后部边缘表面。 在下颌下淋巴结的后面（这二种不要相 混淆）。
4. 标本的快速收集技术
在某些情况下可能难于或不可能尸解以便 打开颅骨取脑, 为减少这些困难已经设计出简 便的技术，即用塑料管插入颅骨采集一小块脑 组织体。 第一种技术是用吸管通过枕骨孔插入并往 前推至一眼睛部位，则吸管中的脑组织内含有 部分脑干，小脑，海马回和皮质。 第二种技术为将吸管通过眼窝后壁(用套管 穿孔)并推至枕部，脑组织内含有部分皮质、 海马回、小脑。

(法语是一个字 )，只 在愚人 的字典 中找得 到。--拿 破仑。 37、不要生气要争气，不要看破要突 破，不 要嫉妒 要欣赏 ，不要 托延要 积极， 不要心 动要行 动。 38、勤奋，机会，乐观是成功的三要 素。(注 意：传 统观念 认为勤 奋和机 会是成 功的要 素，但 是经过 统计学 和成功 人士的 分析得 出，乐 观是成 功的第 三要素 。
拉
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
39、没有不老的誓言，没有不变的承 诺，踏 上旅途 ，义无 反顾。 40、对时间的价值没有没有深切认识 的人， 决不会 坚韧勤 勉。
56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿