细胞培养教程

细胞株(系)细胞复苏

(1)戴手套，从液氮罐中取出冷冻管。

(2)迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化。

(3) 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。

然后在无菌下取出细胞。冻存管用75%酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加10ml培养液。

(4)在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。加入的培养液的量依冻存的细胞数量，如果冻存数量为106，则稀释10倍使细胞达到105即可。

注意事项

在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-5～0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。

细胞换液

（1）贴壁细胞（包括半贴壁细胞的换液）

紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。将培养瓶放于37℃,5%CO2的培养箱内培养

细胞生物学实验教程

1. 细胞培养

细胞培养是研究细胞生物学的重要工具。其基本原理是将动植物等生物材料分离、挑选出优良细胞群体，通过合适的细胞培养基、培养条件、方法和设备，使细胞在体外生长和繁殖。其常用培养细胞的类型有：肺、肝、胃肠、心肌、肌肉、神经、结缔组织、卵巢等。

2. 细胞分离

将细胞组织挑选出来进行细胞分离，我们需要用到一般的分离试剂，如细胞酶、生物表面活性剂、离子液体、尼龙布、毛细管、细胞分选仪和细胞联合培养等，同时需要注意一些技术细节。例如合适的分离环境和分离条件、合适的分离时间、细胞貌形的观察以及细胞去污的操作等。

3. 细胞染色

细胞染色是存在于细胞的染色体、蛋白质和核酸等物质，借助不同染色剂使之显色的过程。其优点是操作简便，速度快，结果直观且研究范围广。根据它的使用范围和目的不同，一般分为核型分析、基因型分析、生化分析、免疫分析和化学分析等。

4. 免疫组化染色

免疫组化染色是指利用抗体与细胞中的特定抗原之间的结合反应，使细胞中的抗原在细胞、组织切片或细胞培养物中可视化并得到定位的技术。这种技术是现代生物技术与分子生物学的重要组成部分，也是研究细胞分子和生物学的密切联系。

5. 荧光标记技术

荧光标记技术是指在一定条件下，荧光分子效应的物理特性。将该技术运用于细胞生物学中，可以标记生物分子，如细胞内结构组分和生物分子中的蛋白质、核酸、糖等，以实现对其特性、运动和转化的动态和定量分析。同时，它对于研究牛眼改良和细胞砂浆的研究、比较病理学和細胞生理学中细胞示踪标记的定位等过程中也有着积极的作用。

6. 电镜观察

电子显微镜（EM）是一种利用电子束代替光束观察样品表面的高分辨率显微镜。其操作方法较为复杂，需要像样的准备样本和设备，但提供的高分辨率和高对比度，使得研究者可以观察小于光学分辨率的细胞结构，并能发现小分子、细菌和病毒等细胞成分。

7. 分子生物学实验技术

目前，分子生物学技术已经成为细胞生物学研究的重要手段之一。例如，聚合酶链式反应（PCR）、DNA构建、DNA测序、蛋白质组学等，这些都是分子生物学技术广泛应用于细胞生物学领域的示例。

一、基本概念

传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。

原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞，在传代之前称为原代培养。

细胞系（cell line）：原代培养细胞首次传代成功后的细胞，称细胞系。

细胞株(cell strain):从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株（Substrain）。瘤株：在动物体内可传代的肿瘤细胞系。

二、体外培养细胞的生长方式

贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。

悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞（一）贴附型 大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能按照体内组织学标推判定，仅大致分成以下四型： 1、成纤维细胞型 ：胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。 1．原代培养（Primary Culture）期：也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。 胞群是异质的 Heterogeneous） 细 （ ， 也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，即细胞独立生存性差。克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。初代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。

细胞培养技术

摘要：细胞培养技术是成功培养细胞的前提，是分子生物学科学研究的重要手段,而细胞培养技术又是细胞试验中不可或缺的关键性技术方法 。细胞培养是现代生物科学中发展十分迅速的一种实验技术,细胞培也是研究病毒与研制疫苗的基础技术，细胞培养的培养物可为单个细胞或细胞群，但细胞培养工作十分繁琐，且环节较多。

关键词：细胞；培养；

问题的提出：

细胞培养技术是研究细胞的技术方法,指的是从体内取出単个细胞或细胞群摹拟体内生理环境,在无菌、适当温度和一定营养条件下,使之生存和生长并维持其结构和功能的方法 。被培养的细胞是科学研究的重要对象。近年来分子生物学,分子遗传学获得巨大进展,动物和人的培养细胞被广泛应用于该领域的研究,成为一个有力的手段 。细胞培养到底有哪些培养技术用于实践？又有哪些培养方式正在被运用？现阶段细胞培养技术又有哪些问题呢？

问题的讨论：

细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体内生存环境, 在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下, 使其生长繁殖并维持结构和功能的一种培养技术.

从体内取出细胞首次培养即为原代培养 ( P r i ma r yCu l t u r e ) , 这是细胞培养的最初和必经阶段. 当原代培养细胞生长到一定时期, 受到群体环境限制, 就需要转移到另一容器才能继续生长, 称为传代或继代培养(S u b c u l

t u r e ) . 根据原代培物性状 的一致性与否, 传代 成功后称为细 胞系 (Ce l

ll i n e ) 或细胞株 ( Ce l lS t r a i n ) . 这些细胞一般可顺利传 40～ 50代次, 并保持染色体二倍体数量和接触抑制, 传至50代左右时则出现生长停滞,

大部分衰老死亡。此类称为为有限细胞系 /株; 在细胞传代的过程中, 有些因发生遗传突变获得了持久性增殖能力的细胞称为无限细胞系 /株.

当细胞生长至高密度时,即需分殖至新的培养瓶中,否则就会影响细胞的生长,甚而引起死亡。一般分瓶的稀释比例为1:3至l:6,依细胞种类而异 。一般步環是先去除原培养瓶中旧的培养液, 用 PBS缓冲液洗操细胞2次,加人 0.25%胰酶溶液进行消化,使紧贴瓶壁的细胞脱落,胰酶37℃作用数秒至数分钟(时间依不同细胞而异)后,于倒置显微镜下观察,当细胞将要分离而呈圆粒状时,去掉胰酶溶液, 加入适量新鲜培养基,以吸管反复吹打瓶壁数次,使细胞脱离瓶壁,均匀悬浮于培养液中。将此培养液分装于若干个新的培养瓶中,依稀释比例加入新鲜培养液,放入37℃,5% C02培养箱中培养。培养几日后,见细胞分裂增殖到一定密度时,重复上述操作。