实验一、骨髓瘤细胞的培养

单抗制备流程1975年,Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术.这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。

制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。

一、细胞融合前准备（一) 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。

一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定.1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。

下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10７／0.5ml ip （腹腔内注射)↓2～3周后第二次免疫1×10７／0。

5ml ip↓3周后加强免疫（融合前三天）1×10７／0.5ml ip或iv（静脉内注射）↓取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂,常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂.要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。

商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇,使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

初次免疫 Ag 1~50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│(一般0.8～1ml 0.2ml／点)↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip│(ip剂量不宜超过0.5ml)↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂,ip│（5～7天后采血测其效价,检测免疫效果）↓2～3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv↓3天后取脾融合目前,用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。

⾼中⽣物单克隆抗体实验总结 考试是检测学⽣学习效果的重要⼿段和⽅法，考前需要做好各⽅⾯的知识储备。

下⾯是店铺为⼤家整理的⾼中⽣物单克隆抗体实验总结，希望对⼤家有所帮助! ⾼中⽣物单克隆抗体实验总结 (⼀)动物的选择 ⽬前应⽤最⼴的是⼩⽩⿏和⼤⽩⿏，尤以⼩⽩⿏为好。

就品系⽽⾔以Balb/c⼩⽩⿏应⽤最⼴，由于所有的⼩⽩⿏⾻髓瘤系均从Balb/c⼩⽩⿏系诱导出来。

Balb/c系⼩⽩⿏必须⽤纯系的，雌雄均可，以8~12周龄为宜。

⼤⽩⿏也可，能产⽣较多量的单抗体。

现在已经在⼩⿏杂交瘤的基础上，发展了⼩⿏-⼤⿏，⼩⿏-⼈以及⼈-⼈杂交瘤技术。

(⼆)免疫 ⼀般⽽⾔，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。

免疫程序、剂量和⽅法是关系到是否能得到所需要的单抗体的关键之⼀。

正常⼩⿏脾脏含有能产⽣各种不同抗体的B淋巴细胞，⼀只纯种⼩⽩⿏估计能产⽣1.0×107~5.0×107种不同的抗体。

因此⼀只正常的⼩⽩⿏的脾细胞与⼩⿏⾻髓瘤融合，只能有千万分之⼀的机会获得某⼀种特定抗体。

所以为了进步得到某种杂交瘤的机会，必须加强免疫，使产⽣特异性抗体的B淋巴细胞⼤量增加。

B淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很⼤影响。

有⼈以为处在转化时期的B淋巴细胞可能更易于融合，⽽免疫以后7~8天，固然是抗体产⽣的⾼峰时期，但形成有活⼒的杂交瘤细胞的可能反⽽减少。

故⼀般以为加强免疫后的第三天应杀⿏取脾做细胞融合。

1.可溶性抗原(蛋⽩质) 以1mg/ml～5mg/ml的溶液加等量的弗⽒完全佐剂乳化，分多点⼩⿏⽪下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔3～5周再同样注射⼀次，10天后，断尾取⾎⼀滴，测抗体效价，选滴度⾼的⼩⿏做融合试验。

⼀个⽉后可以经静脉(尾静脉)给予⽆佐剂抗原0.2ml～0.4ml，3～4天后，杀死⼩⿏取脾做融适⽤。

2.颗粒性抗原如抗原来源⽅便，可以不加佐剂⽽增加免疫次数，缩短间隔时间。

细胞生物学实验报告细胞生物学实验报告细胞生物学实验报告细胞生物学实验报告动物细胞融合【实验目的】⒈了解动物细胞融合的常用方法。

⒉学习化学融合的基本操作过程。

⒊观察动物细胞融合过程中细胞的行为和变化。

【实验原理】细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。

目前人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括病毒诱导融合、化学诱导融合和电激诱导融合。

⒈病毒诱导融合仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融合。

这类病毒的被膜中含有融合蛋白，可介导病毒和宿主细胞融合，同时也可介导细胞与细胞的融合。

用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。

⒉化学诱导融合很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。

这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。

在恢复过程中相接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。

化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。

PEG是被广泛使用的化学融合剂。

⒊电激诱导融合包括电诱导、激光诱导等。

其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。

电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。

【实验用品】⒈材料鸡血红细胞。

⒉试剂50%PEG、Hank’s溶液(pH7.4)、Alsever’s细胞保存液、0.85%氯化钠溶液。

⒊器材正置显微镜、离心机、离心管、载玻片、盖玻片、滴管、注射器等。

【实验步骤】⒈鸡血红细胞的制备和保存用无菌注射器先吸入Alsevers溶液1ml，再从鸡翼下静脉取血0.5~1ml，取出后放入刻度离心管中，再加入2~3mlAlsevers溶液，使总量为4~5ml，混匀并封口，置于4℃冰箱内。

成都石室中学2024～2025学年度上期高2025届半期考试生物试卷本试卷分选择题和非选择题两部分。

第Ⅰ卷为选择题，第ⅠⅠ卷为非选择题，共8页，满分100分，考试时间75分钟。

第Ⅰ卷（选择题，共48分）本卷共16小题，每小题3分，共计48分。

每小题给出的四个选项中只有一个符合题意。

1．下列关于高中生物学实验的叙述，错误的是A．“用高倍显微镜观察叶绿体”实验中，利用藓类叶片为材料对于制作临时装片十分有利B．“探究温度对酶活性的影响”实验中，将淀粉和淀粉酶先置于不同温度处理后再混合C．“探究植物细胞的失水和吸水”实验，细胞随着质壁分离程度的加深，吸水能力增强D．“用伞形帽和菊花形帽伞藻进行嫁接实验”得出结论：伞藻帽形的建成主要与细胞核有关2．北京烤鸭是北京的传统特色美食。

饲喂选做食材用的北京鸭时，主要以玉米、谷类和菜叶为饲料，使其肥育，这样烤出的鸭子外观饱满，皮层酥脆，外焦里嫩。

北京鸭的脂肪会积累在一种由内质网衍生而来的油质体中，如图所示。

下列相关叙述正确的是A．玉米、谷类和菜叶可为北京鸭提供了富含脂肪的饲料B．检测脂肪时，可以用50%的盐酸洗去多余的苏丹Ⅲ染液C．北京鸭的皮下富含不饱和脂肪酸的固态脂肪D．油质体中的脂肪会在两层磷脂分子之间积累3．泛素蛋白会与细胞中需降解的蛋白质结合，当降解蛋白质上连接4个以上泛素蛋白后会被细胞内的蛋白酶体识别并降解（如图1）。

蛋清溶菌酶与细胞提取液混合后会逐渐通过泛素降解途径降解。

为探究蛋清溶菌酶的降解过程，进行以下实验。

实验组：放射性同位素标记的蛋清溶菌酶与细胞提取液混合。

对照组：放射性同位素标记的蛋清溶菌酶与不含细胞提取物的缓冲液混合。

反应一段时间后，进行蛋白质电泳，放射性自显影显示含有放射性同位素的蛋白质条带如图2所示。

下列叙述错误的是A．泛素蛋白含量降低将不利于某些需降解的酶的降解B．据图2可知，实验组中蛋清溶菌酶的种类多于对照组C．蛋清溶菌酶的降解需要蛋白酶体、泛素连接酶等多种酶参与D．泛素蛋白、泛素连接酶在蛋白降解过程中可以重复发挥作用4．当人体内血糖浓度升高时，葡萄糖进入胰岛B细胞，引发一系列生理反应促进胰岛素分泌，如右图所示。

单克隆抗体的制备及应用 The latest revision on November 22, 2020单克隆抗体的制备及应用单克隆是由杂交瘤产生的、只针对复合上某一单个。

技术(monoclonalantibodytechnique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的，并以此生产抗体。

是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。

1单克隆抗体的优点与局限性：1.1单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。

(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。

(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA 等。

(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。

总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。

1.2单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。

由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。

(2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。

(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。

2单克隆抗体的制备：单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。

这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。

单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与、细胞融合、选择杂交瘤细胞及检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。

单克隆细胞株的构建与筛选
首先是构建单克隆细胞株的过程。

构建单克隆细胞株通常涉及
以下步骤：
1. 抗原免疫，首先需要选择合适的抗原，然后将其注射到实验
动物体内，激发免疫反应。

2. 细胞融合，从免疫动物中收集B细胞，然后与骨髓瘤细胞或其他恶性细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。

3. 筛选杂交瘤细胞，通过培养基中添加特定抗生素或其他筛选
方法，筛选出成功融合的杂交瘤细胞。

4. 克隆化，将筛选得到的杂交瘤细胞进行稀释，使其在培养皿
上形成单个克隆，然后进行单克隆的扩增培养。

其次是单克隆细胞株的筛选过程。

在单克隆细胞株构建完成后，需要对其进行筛选以获得所需的单克隆细胞株。

1. 抗原特异性筛选，通过ELISA、免疫组化等方法对单克隆细
胞株进行抗原特异性筛选，筛选出对目标抗原具有高亲和力的细胞株。

2. 亲和纯化，利用蛋白A/G、蛋白L等亲和层析柱对单克隆抗
体进行纯化，获得高纯度的单克隆抗体。

3. 功能性筛选，对单克隆细胞株的功能进行检测，如中和活性、细胞毒性等，筛选出具有良好功能的细胞株。

总的来说，构建单克隆细胞株是一个复杂的过程，需要仔细的
实验操作和严格的筛选步骤。

通过以上步骤，可以获得对特定抗原
具有高亲和力和良好功能的单克隆细胞株，为后续的科研和生产提
供了重要的实验材料。

山东大学细胞生物学实验报告聚乙二醇（PEG ）法诱导的动物细胞融合实验2012/9/11实验目的：了解细胞融合技术的发展过程和主要方法的基本原理，用聚乙二醇(PEG)化学诱导法进行鸡血红细胞的融合实验，掌握实验的基本操作，观察鸡血红细胞融合的不同时期。

实验原理：1. 细胞融合的概念两个或两个以上的细胞或原生质体在自然或人为诱导的情况下细胞质膜相互融合，细胞质相互混合成为一个整体杂合细胞的现象被称为细胞融合。

细胞融合可以发生在同种细胞之间也可以在不同物种间实现。

2. 细胞人工融合的主要方法及基本原理细胞体外融合的主要方法分为病毒诱导，化学诱导和物理诱导。

1953年，M. Kuroya 在临床中第一次分离到仙台病毒（HVJ ）[1]。

1958年，日本学者Okada 发现仙台病毒（HVJ ）能诱导动物细胞融合[2]，其基本原理是仙台病毒的衣壳上有细胞表面受体的结合位点，可以诱导不同细胞凝集，最终使不同细胞的细胞膜相互融合。

1974年，加拿大学者高国楠发明了细胞的聚乙二醇（Polyethyleneglycol ，PEG ）化学融合法，由于该方法对实验条件要求极低，试剂易得，操作简单，成为应用最广泛的细胞融合方法。

化学诱导细胞融合的基本原理是PEG 等化学物质能够诱导细胞膜磷脂分子的极性基团发生结构重排，相互接触的细胞在细胞膜恢复过程中借助磷脂分子的亲和作用和表面张力实现融合。

比之于仙台病毒诱导法，PEG 诱导法的效率提高了几百倍。

80年代，科学家发明了细胞电融合法[4, 5]，电融合法将细胞融合的产率提高到了50%-80%。

电融合法的建立是基于细胞膜表面带电荷的性质。

当在细胞悬液周围加入特定方向的电场时，细胞表面会发生极化现象，相邻的细胞将吸附在一起。

这时突然提高电场强度，细胞间彼此接触的细胞膜会被击穿，细胞膜修复时受到磷脂分子间的亲和作用和细胞膜表面张力的作用将会发生融合。

图2. 以电融合方法得到的3T3-C2融合细胞 （引自J. Teissie 等，1982 )。

杂交瘤技术的原理和应用1. 原理杂交瘤技术（Hybridoma Technology）是一种利用小鼠骨髓细胞与肿瘤细胞融合的方法，成功制备出可以长时间稳定产生单克隆抗体的细胞系。

其原理主要包括以下几个步骤：1.免疫反应：首先，将目标抗原注射到小鼠体内，刺激小鼠产生特定抗体。

2.提取骨髓细胞：将小鼠的骨髓细胞提取出来，骨髓细胞中含有大量产生抗体的浆细胞。

3.融合：将提取的骨髓细胞与骨髓瘤细胞（如懒汉肉瘤细胞）进行融合，得到杂交细胞。

4.筛选：将杂交细胞进行筛选，通过培养基和细胞培养条件的优化，筛选出可以长期产生抗体的稳定细胞系。

2. 应用杂交瘤技术在生物医药领域具有广泛的应用价值，主要集中在以下几个方面：2.1 产生单克隆抗体杂交瘤技术可以制备出可以长期稳定产生单克隆抗体的细胞系，这对于研究和应用单克隆抗体具有重要意义。

单克隆抗体在临床诊断、治疗和疾病标记等方面有着广泛的应用，例如，可用于检测特定疾病标志物、治疗癌症等。

2.2 研究蛋白质结构与功能由杂交瘤技术获得的单克隆抗体可以应用于免疫印迹、免疫组化等实验方法，用于研究蛋白质的表达、定位、结构和功能。

通过分析抗体与靶蛋白的相互作用，可以揭示蛋白质在生物体内的生理功能和生物学机制。

2.3 生物学药物和诊断试剂的生产杂交瘤技术可以用于生物学药物的生产，例如单克隆抗体药物、重组蛋白药物等。

杂交瘤技术还可以制备用于临床诊断和检测的试剂盒，用于检测特定疾病的标志物、病原体等。

2.4 分子免疫学研究杂交瘤技术在分子免疫学研究中具有重要地位。

通过制备获得的单克隆抗体，可以对特定的抗原进行精确定位，研究免疫应答的机制、免疫调控等。

杂交瘤技术也被广泛应用于抗体工程、抗体片段构建等技术的开发与应用。

2.5 其他应用领域此外，杂交瘤技术还在农业、环境保护、食品安全等领域有所应用。

例如，可以应用于农业植物抗性基因的研究与育种、环境中有毒物质的检测与分析等。

结论杂交瘤技术作为一种重要的细胞融合技术，在生物医药领域具有广泛的应用前景。

实验报告实验名称：牛蛙血细胞的体外融合时间：20220418实验目的：1、掌握细胞融合的概念、类型和体外诱导细胞融合的方法。

2、掌握PEG诱导细胞融合的原理、影响因素和试剂作用，并掌握PEG诱导细胞融合的操作和注意事项。

3、掌握细胞计数板的使用和细胞计数的方法。

4、了解单克隆抗体制备技术。

实验原理：1、细胞融合：1）概念：细胞融合又称为细胞杂交，是通过培养和诱导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程，或者用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞，随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞，此杂交细胞具有很强的生命力，增值网盛，并且细胞融合是形成杂交细胞的前提。

2）类型：分为自发融合和诱发融合。

自发融合是指同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并；诱发融合是指异种间的细胞必须经过诱导剂的处理才能融合。

3）方法：a.物理法：电、激光触合b.生物法：病毒诱导融合，如仙台病毒c.化学法：PEG诱导融合4）应用：制备单克隆抗体、疫苗生产、培育动植物新品种、获得优良的微生物菌种、膜蛋白研究等。

2、PEG（聚二乙醇）：(1)PEG是乙二醇的多聚化合物，具有强烈的吸水性，能使两个细胞接触点的距离拉近；能够凝聚和沉淀蛋白质，引起磷脂的酰键及极性基团发生结构重排，因此膜结构改变，引起细胞融合。

但是PEG长时间作用对细胞有毒性，因此作用一段时间后需要稀释或撤去。

(2)融合的活力与频率与PEG的相对分子质量、浓度、作用时间、细胞的生理状态与密度等有关。

(3)PEG法最佳的融合条件：1）细胞：状态良好，得是单细胞悬液，有核细胞（便于观察，便于用光学显微镜判断是否成功融合）；因此选择新鲜制备的牛蛙血细胞，细胞很大且有核，若是培养的细胞，需要将其状态调至很好。

2）密度：5*105-106个/ml3）PEG：分子量4000，浓度为50%（浓稠的吸水性更好，但对细胞膜的损伤更大）4）温度：37℃5）缓冲液：pH7-84、细胞计数：1）细胞计数板：每个大方格的体积为0.1mm3，可换算为每毫升液体中的细胞数量。