生物反应器

生物反应器
光生物反应器（ Physcomitrella patens）
生物反应器的概念
• 能够产生生物活性物质的生物体，也称为生 物反应器。 • 生物反应器包括以下几种: 细菌生物反应器； 酵母生物反应器； 发酵罐 细胞生物反应器； 藻类基因工程； 转基因动物生物反应器。
细菌生物反应器
• 细菌作为反应器，是最早使用的转基因生 产技术。目前，细菌仍然作为一种廉价高 效的表达重组外源蛋白的宿主在广泛使用。 大肠杆菌表达目的基因遗传背景比较清楚， 易于控制。另外，大肠杆菌容易培养，可 以获得高产量的目的蛋白。
酵母生物反应器的缺点
• 在酵母表达系统中部分外源基因不能表达； • 内部降解和多聚体形成； • 蛋白质高级结构不正确、翻译后加工、修 饰等不正确限制。
3种酵母表达系统
• 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系 统：酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率 低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋 白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确 糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。 因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表 达的宿主菌。
3种酵母表达系统
• 甲醇营养型酵母表达系统：巴斯德毕赤酵 母(Pichia pastoris)表达系统最为常用；
• 巴斯德毕赤酵母具有翻译后修饰功能，如 信号肽加工、蛋白质折叠、二硫键形成和 糖基化作用等，其糖基化位点其他哺乳动 物细胞相同，适合于生产医药用重组蛋白 质。
3种酵母表达系统
• 裂殖酵母不同于其他酵母菌株，它具有许 多与高等真核细胞相似的特性，它所表达 的外源基因产物具有相应天然蛋白质的构 象和活性。遗憾的是，目前对它的研究较 少。
鸡输卵管生物反应器
优点：鸡具有世代周期短、低成本、繁殖力 高、卵中天然存在着蛋白酶抑制剂和良好 的无菌环境； • 鸡的蛋清是一种相对简单的混合物，单个 鸡蛋卵清蛋白含量约为3.6 g，仅包括约11 种主要的蛋白，因此利于纯化；
• 与哺乳动物相比，一些鸡蛋白的糖基化方 式比哺乳动物更近似人类。
鸡输卵管生物反应器
质粒表达载体
• Invitrogen公司的pcDNA系列载体。
CMV: Cytomegalovirus, 能在哺乳动物细 胞中表达，不具 有组织或细胞特 异性。
细胞系和细胞株
• 原代培养物经首次传代成功即称为细胞系 （Cell Line），因此细胞系可泛指一般可能 传代的细胞。 • 其中能够连续传代的细胞叫做连续细胞系 或无限细胞系，不能连续培养的称为有限 细胞系。
• 缺点：蛋白质高级结构不正确、无翻译后 加工、无修饰等限制。
表达载体
• Novagen公司的PET系列载体。
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（简称IPTG）是经 常被用来作为乳糖操纵子的诱导物。
乳糖操纵子的应用
乳糖操纵子的应用
最早应用基因工程生产人的蛋白
质的方法是在细菌中表达人的胰 岛素(1982)。
转基因动物乳腺特异性表达的启动子
• 乳球蛋白( BLG) 基因启动子； • 酪蛋白基因调控序列， 常用牛 αS1-酪蛋白 基因和羊β -酪蛋白基因的调控序列； • 乳清酸蛋白( WAP) 基因启动子； • 乳清白蛋白基因启动子。
乳腺生物反应器产业化
• 重组人抗凝血酶Ⅲ ( ATryn)已经被美国FDA批准 上市；
哺乳动物细胞、鱼类 细胞生物反应器
• 表达具有天然活性蛋白的最佳宿主。
• 其优势在于能正确有效地识别真核蛋白的 合成、 加工和分泌信号 , 能准确地完成糖 基化、磷酸化 ，形成链内和链间二硫键以 及蛋白水解等翻译后加工过程 ,因而产生的 完整蛋白和天然蛋白一样。
• 缺点：产量低、成本高、需要严格灭菌的 培养条件。
生物反应器（Bioreactor）
生物反应器的概念
• 用微生物、植物、动物、人细胞或者专一性 酶， 通过生物方法将原料转化为特定产品 的容器称为生物反应器( Bioreactor) 。
• 胃就是人体内部加工食物的一个复杂生物反 应器。食物在胃里经过各种酶的消化，变成 我们能吸收的营养成分。
生物反应器
家蚕丝腺生物反应器
• 家蚕是人工养殖的经济昆虫， 蚕的丝腺作 为生物反应器来表达重组的外源蛋白具有 极高的商业价值与应用前景。
家蚕丝腺生物反应器
• 存在的问题：
丝腺中主要以丝蛋白分泌为主，给目的蛋白 的下游分类纯化带来了困难；
与杆状病毒表达系统一样存在蛋白质转录后 修饰的问题；
如何将外源基因稳定的转入家蚕体内，同时 能高效稳定地在丝腺细胞中表达也是亟待 解决的技术难关。
• 真核单细胞、结构简单、 因序列已经完全测 得, 序列结构比较清楚, 利于遗传操作; • 培养条件简单, 可以大规模培养, 易于工业化 生产; 核转化与叶绿体转化方法成熟; • 衣藻作为真核生物, 可以对真核蛋白质进行准 确的翻译后加工修饰( 如: 正确的折叠等) ; • 衣藻本身不带有对人体有害的生物, 如病毒、 细菌等, 这就使得其表达的产物不会含有毒素 等有害物物质, 从而减少纯化步骤, 大大降低成 本。
• 蛋清的一半蛋白来自两个卵清蛋白等位基 因，其特异表达于输卵管膨大部的管腺细 胞。
现状： 研究还处于初级阶段。
乳腺生物反应器
通过转基因技术 将乳腺组织特异性启动子
驱动的外源基因 在动物乳腺组织高效表达 通过乳汁分泌到体外 该方式不会对动物自 身机体造成损害通过回收乳汁就可以提取 有重要价值的生物活性酶 III( ATryn) ，每年市值7 亿美元；
• 5种药进入临床Ⅲ期试验；
• 37 种进入Ⅱ期临床研究阶段。
乳腺生物反应器面临的问题
• 生产周期长、基因整合效率不高； • 转基因动物死亡率较高； • 常出现不育导致转基因动物续代难。
莱茵衣藻生物反应器
动物细胞生物反应器
• 昆虫细胞； • 哺乳动物细胞； • 鱼类细胞。
昆虫细胞生物反应器
• 昆虫杆状病毒表达系统( BEVS)： 病毒载体、昆虫细胞、宿主培养基； 与细菌 、酵母、 哺乳动物细胞表达系统相比， 具有易于操作和筛选， 较好的转录后加工 修饰以及安全等优点；
缺点：昆虫细胞的蛋白质加工过程并非同高 等的真核生物完全一致， 最终会影响到表 达产物的生物学活性。
胰岛素是一种控制糖代谢的 蛋白质激素。缺乏糖尿病， 注射胰岛素。 现已在细菌中生产10多种 药品，例如表皮生长因子、 人生长激素、干扰素、乙 型肝炎工程疫苗等。
不同目的选择不同的菌株
• • • • DH5α; JM109; TOP10; BL21(DE3)……
酵母生物反应器
• 单细胞低等真核生物、遗传背景清晰、培养条 件普通、生长繁殖速度迅速、表达量高； • 用于表达基因工程产品时，可以大规模生产， 有效降低了生产成本； • 我国目前肝疫苗主要还是以酵母作为反应器来 生产的； • 酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力， 收获的外源白质具有一定程度上的折叠加工和 糖基化修饰， 性质较原核表达的蛋白质更加 稳定。
植物生物反应器
• 以植物悬浮细胞培养或整株植物为加工场 所大量生产具有重要功能或药用价值的蛋 白、人或动物的疫苗 抗体、重要的氨基酸 等；
• 相关植物生物反应器产品可通过种子、果 实或块茎表达，便于贮藏 运输和利用。
利用植物生物反应器制备抗体
• 抗肿瘤抗体； • 肿瘤疫苗； • 其它抗肿瘤药物。 缺点： • 重组蛋白表达量低； • 重组蛋白的免疫原性不够强；