神经营养素3基因克隆及其真核表达载体的构建

・８６・　Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｃｈｉｎａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ，２００８，Ｖｏ１．３２，Ｎｏ．２　

神经营养素３基因克隆及其真核表达载体的构建　

（６５００３２　昆明医学院第一附属医院辇　兴　杨智勇冯忠堂　堆物ｆ治Ｈ亨巾　Ｉ、吾　Ｉ氍　

（６５００３１昆明）昆明医学院神经科学研究所王廷华　徐　丹　

【摘要】目的克隆大鼠神经营养素一３（ＮＴ－３）基因的表达序列，构建大鼠ＮＴ－３基因真核表达载体。方法应用ＲＴ－　

ＰＣＲ从大鼠脑组织总ＲＮＡ中扩增ＮＴ－３基因ｃＤＮＡ，将其克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３中构建重组质粒ｐｃＤＮＡ３一Ｎ３，用限　

制酶酶切鉴定和ＤＮＡ序列分析鉴定重组质粒。结果ＲＴ－ＰＣＲ产物为８２２　ｂｐ的特异片段，重组质粒酶切后产生８２２　ｂｐ和　

５．２　ｋｂ片段，ＤＮＡ测序证实８２２　ｂｐ片段的碱基序列与大鼠ＮＴ一３　ｃＤＮＡ序列完全一致。结论成功克隆大鼠ＮＴ－３基因表　

达序列并构建了ＮＴ－３基因真核表达载体ｐｃＤＮＡ３一Ｎ３。　

【关键词】神经营养素３基因；真核表达；重组质粒　

Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅ￣ｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｒａｔ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ　３　ｇｅｎｅ．ＤＥＮＧ　Ｘｉｎｇｌｉ　，ＹＡＮＧ　Ｚｈｉｙｏｎｇ　，　

ＷＡＮＧ　Ｔｉｎｇｈｕａ　ｅｔ　ａ１．　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，１　ｓｔ　Ａ｛｛ｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｋｕｎｍｉｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｋｕｎｍｉｎｇ　

６５００３２　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｃｌｏｎｅ　ａｎｄ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ｔｈｅ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｒａｔ　Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ　３（ＮＴ－３）ｇｅｎｅ．　

Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｒａｔ　ＮＴ－３　ｃＤＮＡ　ｗａｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ＲＴ—ＰＣＲ　ｆｒｏｍ　ｒａｔ　ｂｒａｉｎ　ｔｉｓｓｕｅ．Ｂｙ　ｇｅｎｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｒａｔ　ＮＴ－３　

ｃＤＮＡ　ｗａｓ　ｉｎｓｅｒｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐｃＤＮＡ３　ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐｃＤＮＡ３一Ｎ３．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　

ｐｌａｓｍｉｄ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｚｙＩｎｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｉｓ　８２２ｂｐ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　

ｓｅｇｍｅｎｔ．Ｂｙ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｚｙｍｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ，ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｗａｓ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｉｎｔｏ　８２２ｂｐ　ａｎｄ　５２００ｂｐ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｔｈｅ　ＤＮＡ　

ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　８２２ｂｐ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｃａｌ　ｗｉｔｈ　ｒａｔ　ＮＴ－３　ｃＤＮＡ　ｉｎ　ＧｅｎＢａｎｋ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ＮＴ－３　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ，ａｎｄ　

ｔｈｅ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ＮＴ－３　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ，ｗｈｉｃｈ　ｗｉｌｌ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｔｈｅ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｆｕｒｔｈｅｒ　

ｒｅｓｅａｒｃ｝Ｌ　

［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓｌ　Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ　３　ｇｅｎｅ；Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　

神经营养素一３（ＮＴ－３）在各种感觉神经元、交感　

神经元、基底前脑胆碱能神经元、中脑多巴胺能神经　

元以及运动神经元的发育、存活、分化和轴突再生中　

发挥着重要作用　１］，并在脊髓损伤、脑外伤、帕金森　

病（ＰＤ）和阿茨海默病等中枢神经系统疾病的治疗　

中显示出广阔的应用前景　２ｊ。然而，ＮＴ－３属生物　

大分子，不能通过血脑屏障，使其应用受到了限制。　

基因治疗是目前解决ＮＴ－３给药途径问题最有希望　

的方案。本研究将克隆大鼠ＮＴ－３基因编码序列并　

构建其真核表达载体，为进一步开展ＰＤ的基因治　

疗研究奠定基础。　

材料与方法　

一、材料　

真核表达质粒载体ｐｃＤＮＡ３由昆明医学院第　

一附属医院生物治疗研究中心保存；Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５　

由昆明医学院神经科学研究所保存；ＳＤ大鼠由昆明　

医学院实验动物中心提供。主要试剂与工具酶：　

ＴＲＩｚｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）；ＨｉｎＤⅢ、Ｘｈｏ　Ｉ、Ｔ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ、Ｃａｌｆ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈｏｔａｓｅ、　

Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ、Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　

ＰＣＲ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘ（ＭＢＩ）；凝胶回收试剂盒、ＤＮＡ纯　

化试剂盒、质粒ＤＮＡ提取试剂盒（ＯＭＥＧＡ）；ＤＮＡ　

Ｍａｋｅｒ　ＤＬ２０００、ＤＮＡ　Ｍａｋｅｒ　Ｘ－ＥｃｏＴ１　４（Ｔａｋａｒａ）；６　

×ＲＮＡ　Ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ、ＬＢ　Ｂｒｏｔｈ、ＬＢ　Ａｇａｒ（上海生　

工）。引物的设计与合成：根据ＧｅｎＢａｎｋ公布的大　

鼠ＮＴ－３　ｃＤＮＡ（ＮＭ一０３１０７３），用Ｐｒｉｍｅｒ　５．（）软件　

设计引物，由Ｔａｋａｒａ生物有限公司合成，序列如下：　

上游引物为５＇－ＧＣ垒垒　！ＴＡＣＡＧＧＴＧＡＡＣＡＡＧＧＴ—　

ＧＡＴＧＴＣＣＡＴ－３　（含ＨｉｎＤⅢ酶切位点）；下游引物为　

５＇－ＣＧＣＴＣＧＡＧＡＣＡＧＡＴＧ　ＣＡＴＧＴＴＣＴＴＣＣＧ－３　

（含Ｘｈｏ　Ｉ酶切位点）。　

二、方法　

１．总ＲＮＡ的提取和ＲＴ＿ＰＣＲ　用ＴＲＩｚｏｌ试　

剂从大鼠脑组织中提取总ＲＮＡ。紫外分光光度法　

及甲醛变性凝胶电泳鉴定提取ＲＮＡ的纯度和完整　

性。用ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　

Ｋｉｔ，以ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）

　为引物反转录合成ｃＤＮＡ第一　维普资讯 http://www.cqvip.com 华中医学杂志２００８年第３２卷第２期　

链，然后进行ＰＣＲ扩增，反应条件为９４℃预变性３　

ｍｉｎ；９４℃１　ｍｉｎ，５５℃１　ｍｉｎ，７２℃１　ｍｉｎ，共３０个　

循环；７２℃延伸１０　ｍｉｎ。ＲＴ－ＰＣＲ产物用ＤＮＡ纯　

化试剂盒纯化。　

２．目的基因的扩增　以纯化的ＲＴ－ＰＣＲ产物　

为模板进行ＰＣＲ扩增，设定条件为９４℃预变性３　

ｍｉｎ；９４。Ｃ　１　ｍｉｎ，５５℃１　ｍｉｎ，７２℃１　ｍｉｎ，３０个循　

环；７２℃延伸１０　ｍｉｎ。以ＤＮＡ纯化试剂盒纯化　

ＰＣＲ产物，紫外分光光度法测定其浓度和纯度。　

３．酶切反应分别取１０　ｇ质粒ｐｃＤＮＡ３和纯　

化的目的基因ＰＣＲ片段进行ＨｉｎＤⅢ、Ｘｈｏ　Ｉ双酶　

切。碱性磷酸酶去除酶切后载体５　末端磷酸基。　

用凝胶回收纯化试剂盒纯化经酶切的质粒载体和目　

的基因。　

４．连接反应在２０　ｌ反应体系中加入４００　ｎｇ　

去磷酸反应后的ＤＮＡ载体与１７５　ｎｇ酶切后的目的　

基因（两者的摩尔比约为１：３），进行连接反应，构建　

重组质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｎ３。　

５．重组载体的鉴定　将连接产物转化Ｅ．ｃｏｌｉ　

ＤＨ５ａ，接种ＬＢ／Ａｍｐ平板３７℃培养过夜，挑取单　

菌落，摇菌扩增后用质粒小量提取试剂盒提取质粒，　

经ＨｉｎＤⅢ、Ｘｈｏ　Ｉ双酶切鉴定后，送上海博亚生　

物技术有限公司测序。　

结　果　

一、总ＲＮＡ提取总ＲＮＡ经甲醛变性凝胶电　

泳、ＥＢ染色，凝胶成像系统下观察其完整性。２８　Ｓ　

和１８　Ｓ条带清晰可见，５．８　Ｓ隐约可见，说明ＲＮＡ　

完整未降解。紫外分光光度法测定其Ａ　。／Ａ　为　

２．２，ＲＮＡ纯度高，符合ＲＴ－ＰＣＲ要求。　

二、ＲＴ－ＰＣＲ扩增大鼠ＮＴ一３　ｃＤＮＡ　ＲＴ－ＰＣＲ　

产物经１　琼脂糖凝胶电泳显示为８２２　ｂｐ的特异性　

条带，与预期结果相符（图１）。　

１　２　２０００ｂｐ　

ｌＯ００ｂｐ　７５０ｂｐ　

５００ｂｐ　

２５０ｂｐ　

１００ｂｐ　１为ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ２０００：２为ＰＣＲ　图１　ＲＴ－ＰＣＲ产物　

三、重组质粒的酶切鉴定与序列分析　重组质　

粒ｐｃＤＮＡ３一Ｎ３经ＨｉｎｄⅢ和Ｘｈｏ　Ｉ双酶切后，琼　・　８７・　

脂糖凝胶电泳分离可见８２２　ｂｐ和５．２　ｋｂ的两个片　

段，与预期结果一致（图２）。ＧｅｎｅＢａｎｋ　Ｂｔ　ＡＳＴ分　

析显示重组质粒测序结果与ＧｅｎｅＢａｎｋ中大鼠ＮＴ＿　

３　ｃＤＮＡ完全一致。　

１　２　３　４　

１为　．ＥｃｏＴ１４ＩｄｉｇｅｓｔＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；２为ｐｃＤＮＡ３．Ｎ３，　Ｄ　ＩＩＩ酶ｔ：３Ｊ；３为ｐｃＤＮＡ３－Ｎ３／ＨｉｎＤ　ⅡＩ　Ｄ　Ｉ酶切；４为ＤＮＡ　Ｍａｒｋ—　ｅｒＤＬ２０００　图２重组质粒体ｐｃＤＮＡ３．Ｎ３　的酶切鉴定　

讨　论　

ＮＴ－３最早由Ｅｒｎｆｏｒｓ等于１９９０年首先发现。　

大鼠ＮＴ－３基因定位于第４号染色体长臂（４ｑ４２），　

转录后形成全长为１．４　ｋｂ的ｍＲＮＡ，其编码区序列　

翻译产物为２５８个氨基酸组成的ＮＴ－３前体，其经　

酶解去除１８个氨基酸组成的Ｎ端信号肽和１２３个　

氨基酸组成的前导区，形成由１１７个氨基酸组成的　

成熟ＮＴ－３Ｅ　。　

ＮＴ－３属生物大分子，不能通过血脑屏障，使其应　

用受到了限制。基因治疗为应用ＮＴ－３治疗中枢神　

经系统疾病带来新的曙光。根据采用载体的不同，基　

因治疗可分为基于病毒载体的基因治疗和基于非病　

毒载体的基因治疗两类。病毒载体虽基因转移效率　

极高，然而潜在的危险限制了其在临床上的推广应　

用。随着脂质体、非脂质体、磁转染及核转染等新型　

基因转染技术的发展，在体外应用非病毒载体介导的　

基因转染也能获得同病毒载体同样甚至更高的转染　

效率，同时可避免病毒载体所带来的安全性问题ｌⅢ３］。　

本研究应用ＲＴ—ＰＣＲ成功从大鼠脑组织中克　

隆出ＮＴ－３　ｃＤＮＡ，经基因测序证实其与ＧｅｎＢａｎｋ　

公布的大鼠ＮＴ－３　ｃＤＮＡ（７７７ｂｐ）序列一致。应用　

基因重组技术，将ＮＴ－３　ｃＤＮＡ插入质粒载体ｐｃＤ－　

ＮＡ３巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子的下游，从而构建　

了真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３一Ｎ３。ＣＭＶ启动子可操　

纵外源基因在大多数哺乳动物细胞中高效表达。　

ＰＤ是一种常见于老年人的神经系统退行性疾　

病，其主要病理改变为黑质致密部多巴胺能神经元　

的变性及其导致纹状体内神经递质多巴胺的耗竭，　

目前尚无可取得满意疗效的治疗手段。随着ＮＴ－３　

等ＰＤ治疗性分子的发现及现代分子细胞生物学技　

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