原位杂交步骤自己整理的精讲
原位杂交是一种常用的实验方法，可以用来检测DNA或RNA序列在细胞或组织中的分布情况。这种方法可以帮助研究人员确定基因在染色体上的位置，并研究基因的表达和调控。下面是原位杂交的详细步骤：
1.样品处理：首先，需要提取并处理样品中的细胞或组织。这一步骤通常包括细胞固定、组织切片和蛋白酶处理等。细胞固定能够保持细胞的形态和结构，而组织切片则能够使得样品更容易进行观察和分析。蛋白酶处理的目的是通过消化蛋白质来提高核酸的可达性。
2.探针设计：在进行原位杂交之前，需要准备一个能够与目标DNA或RNA序列互补配对的探针。这个探针通常是由DNA或RNA序列构建而成的，可以通过人工合成或PCR扩增获得。在设计探针时，一般要考虑到探针的长度、碱基组成和互补性等因素。
3.标记探针：为了便于后续的检测，需要将探针标记上报告标记物。常用的报告标记物有荧光染料、放射性同位素和酶等。标记探针的方法通常包括非放射性标记和放射性标记两种方式，具体选择哪一种方法取决于实验的需求和要求。
4.杂交反应：将标记好的探针与样品中的DNA或RNA序列进行杂交反应。这种反应通常在固定样本上进行，样品和探针会在适当的杂交缓冲液中反应一段时间。杂交反应的温度和时间会根据探针的长度和互补性等因素进行调节。反应结束后，通常需要进行洗涤以去除未结合的探针和杂交缓冲液。
5.可视化和分析：经过洗涤之后，探针与目标DNA或RNA序列杂交形成的杂交体可以通过其中一种方法进行可视化和分析。常用的方法包括荧光显微镜观察、放射性测量和酶活性检测等。通过这些方法，可以确定目标序列在样品中的分布情况和数量。
除了上述的基本步骤，还可以根据实验的具体要求进行一些改进和优化。例如，可以采用双标记法来同时检测不同序列的分布情况；可以使用探针混合标记法来提高检测的灵敏度和特异性；可以用信号扩增技术来增加检测的信号强度等。
总体来说，原位杂交是一种常用的实验方法，可以用于研究基因的定位和表达。通过精确的步骤操作和合适的优化策略，可以获得准确和可靠的结果，为生物学和医学研究提供重要的信息和支持。
原位杂交
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1 探针的设计与合成
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1) 根据实验室已有的p8基因cDNA全长序列，用premier primer5.0设计引物p81和p82，
以卤虫cDNA为模板，PCR扩增得到346bp的产物，用Takara胶回收试剂盒回收纯化。
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引物编号 引物序列 长度
p81 TGCGGACGAAACAGGAAG 18 bp
p82 GCTCAAACAGTGATGCCAGT 20 bp
2) 目的片段克隆
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a. 在无菌离心管中加入连接载体的各种成分，载体与片段的摩尔比控制在1:3-1:8，根据凝
胶电泳检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算摩尔比。加入成分及比例如下：
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目的PCR片段 5 μl
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pGM-T载体（约50ng/uL） 1 μl
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10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μl
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T4 DNA Ligase（3U/uL） 1 μl
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无菌去离子水 3 μl
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总体积 10 μl
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b. 轻轻弹动离心管以混合内容物，短暂离心。置于PCR仪中16℃过夜连接，反应结束后将
离心管置于冰上。
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c. 向铺好的含有氨苄青霉素的固体平板表面加入16 μl的IPTG（50mg/ml）、40 μl的X-gal
（20mg/ml），使用无菌的弯头玻璃棒将其均匀的涂开，避光置于37℃培养箱1-3小时，使
溶解X-gal的二甲基甲酰挥发干净。
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d. 将10 μl的连接产物加到100 μl DH5感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴半小时，将离心管
置于42℃水浴90秒，取出管后立即置于冰浴上放置2-3分钟，其间不要摇动离心管。向离
心管加入500 μl 37℃预热的LB（不含抗生素）培养基，150rpm摇床37℃振荡培养45分钟。
目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。将菌液于4000g下离心10分钟，
去掉上清，加入100 μl培养液重溶并加入到配制好的LB固体培养基上，用无菌的弯头玻璃
棒轻轻将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16小时。
原位杂交实验原理
带有标记的（有放射性同位素，如3H、35S、32P、荧光素生物素、地高辛等非放射性物质)DAN或RNA片段作为核酸探针，由于核酸探针的种类和标记物的不同，在具体使用的技术方法上也各有差异，但其基本方法和使用原则大致相同。大致可分为：①杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等；②杂交；③杂交后处理；④显示（visual－ization）：包括放射性自显影和非放射性标记的显色。
a) 固定
原位杂交组织化学技术（In Situ Hybridization Histochemistry,
ISHH）在固定剂的使用和选择上应兼顾到三个方面：保持细胞结构，大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；使探针易于进入细胞或组织。DNA是比较稳定的，mRNA是相对稳定的但易为酶合成和降解。RNA却绝然不同，非常容易被降解。因此，对于DNA的定位来说，固定剂的种类和浓度并不十分重要。相反，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解减少到低限度，那么，不仅固定剂的种类浓度和固定的时间十分重要，而且取材后应尽快予以冷冻或固定。在解释ISHH的结果时应考虑到取材至进入固定剂或冰冻这段时间对RNA保存所带来的影响，因组织中mRNA的降解是很快的。在固定剂中，常用的是多聚甲醛。和其它的固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。其它如醋酸-酒精的混合液和Bouin’s固定剂也能获得较满意的效果。对于mRNA的定位，我们常采用的方法是将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中1～2h，在冷冻前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱过夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入4%多聚甲醛约10min，空气干燥后保存在-70℃。如冰箱温度恒定，在-70℃可保存数月之久不会影响杂交结果。在病理学活检取材多用福尔马林固定和石蜡包埋，这种标本对检测DNA和mRNA有时也可获得杂交信号，但石蜡包埋切片由于与蛋白质交叉连接的增加，影响核酸探针的穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片。同时，在包埋的过程中可减低mRNA的含量。其它固定剂如使用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷冻切片也可获得满意效果。各种固定剂均有各自优缺点，如沉淀性（Precipitating）固定剂：酒精/醋酸混合液、Bouin’s液、Carnoy’s液等能为增加核酸探针的穿透性提供佳条件，但它们不能大限度地保存RNA，而且对组织结构有损伤。戊二醛能较好地保存RNA和组织形态结构，但由于和蛋白质产生广泛的交叉连接，从而大大地影响了核酸探针的穿透性。至今，多聚甲醛仍被公认为ISHH较为理想的固定剂。
原位杂交步骤-⾃⼰整理的1
荧光原位杂交
试剂及其配制⽅法（以下试剂均需⽤RNase-free⽔配制）：1×PBS：NaCl 8g⁄L、KCl 0.2 g⁄L、Na2HPO4 1.44 g⁄L、KH2PO4 0.24 g⁄L，溶于DEPC处理的去离⼦⽔中，⽤pH 计测其pH，再⽤NaOH调其pH为7.4；
PBST：PBS加0.1%吐温-20；
LiCI：配4M LiCI 100ml需要LiCI．H20 25.6g，配好后加⼊千分之⼀的DEPC，37℃，12h放置，⾼温灭菌。
4%多聚甲醛（4%PFA）：
准确称取40g多聚甲醛，溶于1000ml的1×PBS中，避光于摇床（37℃，160r⁄m）上，待其全部溶解后，⽤棕⾊瓶分装成⼩体积包装，保存于－20℃。（注：本⽅法与其他⼀些⽂献⽤NaOH和HCl先后调节pH⽽促其溶解的⽅法略有不同，因是考虑到pH的稳定性；另外之所以采⽤上述⽅法使多聚甲醛缓慢溶解⽽没有采⽤⽂献中提及的⽤NaOH调节其pH⾄10促其溶解后再⽤HCl调节pH的原因，除了⽤⼀般的pH试纸测量配置好的4%多聚甲醛的pH不够准确外，也因为不能⽤pH计对其酸碱度进⾏测量，因为它会损坏pH 计）。取以上各成分，溶于DEPC处理过⼀定量的纯⽔（或双蒸⽔）中，测定其pH(放置⼀段时间待其pH稳定后)，据此以HCl或NaOH来调节其pH值⾄7.4，定容⾄所要求的体积。
（注：根据实际情况，因DEPC处理过的⽔其pH会下降，故本实验中实际上是⽤1mol⁄L的NaOH来调节其pH）。75%甲醇／PBST：将⽆⽔甲醇按75%（V／V）⽐例溶于PBST；
50%甲醇／PBST：将⽆⽔甲醇按50%（V／V）⽐例溶于PBST；
25%甲醇／PBST：将⽆⽔甲醇按25%（V／V）⽐例溶于PBST；
HYB－溶液：50%甲酰胺（V／V）、5×SSC（终浓度）、0.1%吐温-20（终浓度）、RNase-free⽔（－20℃）pH6.2
