黄曲霉毒素的测定29页PPT

ISO 17901
2017：规定了食品中黄曲霉毒素 M1和M2的液相色谱-串联质谱测 定方法。
欧盟标准
EC 450/2009
规定了食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的限量要求和检 测方法。
EC 152/2013
规定了食品中黄曲霉毒素M1和M2的限量要求和检测方法。
中国标准
GB 5009.22-2016
致癌性
黄曲霉毒素是一种强烈的 致癌物质，可导致肝癌、 胃癌、肠癌等癌症的发生 。
急性中毒
摄入大量黄曲霉毒素可引 起急性中毒，出现恶心、 呕吐、腹痛等症状。
慢性影响
长期摄入低量的黄曲霉毒 素也可能对健康造成潜在 危害，如影响肝脏功能、 降低免疫力等。
02
黄曲霉毒素检测方法
薄层色谱法
总结词
一种经典、常用的黄曲霉毒素检测方法。
预防疾病是保障人类健康的重要途径，而黄曲霉毒素检测是预防疾病的重要手段 之一。加强黄曲霉毒素检测，有助于降低疾病的发生率，提高人民的健康水平。
维护人类健康
人类健康是社会发展的重要基石，而黄曲霉毒素检测是维 护人类健康的重要手段之一。通过检测，可以及时发现食 品中黄曲霉毒素的污染情况，采取有效措施防止其进入市 场，保护消费者的健康权益。
国际化
推动黄曲霉毒素检测方法的国际标准 化，加强国际间的交流与合作，促进 检测技术的发展和创新。
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荧光光度法利用荧光物质与目标化合物的特异性结合反应，通过荧光信号的检测和分析，对目标化合物进行定性 和定量分析。该方法可用于黄曲霉毒素的定量分析，具有高灵敏度、高选择性等优点，但需要特定的荧光物质和 操作技术。
03
黄曲霉毒素检测标准

(2)展开：
a．横向展开：在展开槽内的长边置一玻璃支架，加10mL无水 乙醇，将上述点好的薄层板靠标准点的长边，置于展开槽内展开， 展至板端后，取出挥干。根据情况，需要时，可再重复l～2次。 b．纵向展开：挥干的薄层板以丙酮一三氯甲烷(8：92)展开至 10～12cm为止。丙酮与氯甲烷的比例，根据不同条件自行调节。
仪器
小型粉碎机 样筛
电动振荡器
玻璃浓缩器 玻璃板5cm×20cm、薄层板涂布器 展开槽(25cm×6cm×4cm) 紫外光灯100一125w、波长365nm滤光片、微量注射器(2)
试剂

三氯甲烷、正己烷(沸程30～60℃)或石油 醚(沸程60～90℃)、甲醇、苯、乙腈、无 水乙醚或乙醚经无水硫酸钠脱水、丙酮。 以上试剂在试验前需先进行空白试验， 如不干扰测定即可使用，否则需逐一进 行重蒸。
取20.00mL甲醇水溶液置于另一125mL分液漏斗 中，加20mL三氯甲烷，振摇2min、静置分层， 如出现乳化现象，可滴加甲醇促使分层。放出 三氯甲烷层，经盛有约10g预先用三氯甲烷湿 润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸，过滤于 50mL蒸发皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗 中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发 皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并 于蒸发皿中。
2、黄曲霉毒素B标准使用液：
I液(1.0ug／mL)：取1mL AFTB标准液(10.0ug／mL)于10mL容 量瓶中，用苯一乙腈混合液稀释、定容。
Ⅱ液(0.2ug／mL)：取I液1mL，按上法定容5mL。
Ⅲ液(0.04ug／mL)：取液Ⅱ1mI。，按上法定容5mI。。
思考：在配制黄曲霉毒素B标准使用液时，为什么需要用贮备 液来稀释而不是直接配制？
本章重点

黄曲霉毒素的污染及其程度因地理和季节因素以及农作 物生长、 收割储存的条件而异。潮湿和高温地区更适 合于毒素的产生。
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产生黄曲霉毒素的霉菌可在各种各样的食物中 生长, 尤其是植物性食物, 其中玉米、 花生、 棉籽 等最易受黄曲霉毒素污染, 果仁类也常受其污染。
黄曲霉毒素对作物污染始于田间, 收获后霉菌爆 发和毒素污染通常是由于不良储藏条件和过高含 水量所引起。一般来说, 谷物水分在 14%以上( 花 生水分在 9%以上) 最适合黄曲霉繁殖和生长。
黄曲霉素微溶于水,易溶于油脂和某些有机溶剂;对温度的 敏感性差,280℃高温下才裂解,故在通常的烹调条件下不 易被破坏。碱性条件下,黄曲霉素极易降解;紫外线辐照也 容易使黄曲霉素染概况
目前, 粮油食品的生物性污染问题随着食品质量安全问 题而日益受到人们的普遍关注。真菌毒素的污染是导致 食品污染的主要因素之一。据联合国粮农组织估计, 全 世界谷物供应 25%受真菌毒素污染而不能食用。 真菌 毒素种类多, 其中黄曲霉毒素是迄今发现污染农产品毒 性最强的一类生物毒素,也是强致癌物, 国家标准中对其 有严格限定。
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2 .黄曲霉毒素的去除
① 挑选霉粒法 ② 碾轧加工法 ③ 植物油加碱去毒法 ④ 加水搓洗法 ⑤ 吸附去毒法 ⑥ 高温高压去毒法 ⑦ 烹调去毒法 ⑧ 碾磨去毒法
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㈠黄曲霉毒素及其特点 ㈡黄曲霉毒素对食品的污染概况 ㈢黄曲霉毒素产毒菌及产毒条件 ㈣黄曲霉毒素毒性及其危害 ㈤黄曲霉毒素预治
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㈠黄曲霉毒素及其特点 • 黄曲霉毒素主要是黄曲霉和寄生曲霉在生长
过程中产生、分泌的次级代谢产物。
黄曲霉素是一类化学结构类似的二吠喃香豆素衍生物.其 基本结构含有一个双吠喃环和一个氧杂蔡邻酮,在紫外线 下产生荧光。

最为多见，其毒性和致癌性也最强。1993年被 黄曲霉毒素分子中的双呋喃环结构，是产生毒性的重要结构。
肾脏、脾脏和肾上腺也可检出，肌肉中一般不能检出。 1995年，世界卫生组织制定的食品黄曲霉毒素最高允许浓度为15微克/千克。
世界卫生组织（WHO）的癌症研究源自构划定为1类致癌物。▪ 20世纪60年代，在英国发生的十万只 火鸡突发性死亡事件被确认与从巴西 进口的花生粉有关。进一步的调研证 明，这些花生粉被一种来自真菌的有 毒物质污染，这些研究工作最终使人 们发现了黄曲霉产生的有毒代谢物质， 黄曲霉毒素。
黄曲霉毒素B1的分解温度为268℃,通常 的烹调条件下不易被破坏。紫外线对低浓度 黄曲霉毒素有一定的破坏性。
黄曲霉毒素 - 分布
黄曲霉在大豆、稻谷、玉米、通心粉、调 味品、牛奶、奶制品、食用油等制品中也经常 发现黄曲霉毒毒素存在于土壤、动植物、各种 坚果，特别是花生和核桃中。一般在热带和亚 热带地区，食品中黄曲霉毒素的检出率比较高。
黄曲霉毒素 –临床特征
▪ 食品中所污染的主要是黄曲霉毒素B1，其毒 性目前一般认为有三种临床特征；急性中毒、 慢性中毒和致癌性：
（1）急性中毒： 它是一种剧毒物质，毒性比KCN大10倍，
比砒霜大68倍，仅次肉毒霉素，是目前已知霉 菌中毒性最强的。中毒症状主要表现为：呕吐、 厌食、发热、黄疸和腹水等肝炎症状，即肝毒 性。
黄曲霉毒素 - 检验检疫 A 致癌范围广，能诱发鱼类、禽类，各种实验动物、家畜及灵长类等多种动物的实验肿瘤；
生曲霉代谢的一组化学结构类似的产物，特曲 B 致癌强度大，其致癌能力比六六六大1万倍；
黄曲霉纯培养的显微镜下形态
霉也能产生黄曲霉毒素，但产量较少。黄曲霉 黄曲霉毒素 - 分布
在紫外线下，黄曲霉毒素B1、B2发蓝色荧光，黄曲霉毒素G1、G2发绿色荧光。 中毒症状主要表现为：呕吐、厌食、发热、黄疸和腹水等肝炎症状，即肝毒性。

实验黄曲霉毒素测定
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• 4．植物油：
• 用小烧杯称取4.0g样品，用20.0mL石油醚，将样品移 于125mL分液漏斗中，用20.0mL 甲醇水(55 ＋45）溶 液分次洗烧杯，溶液一并移人分液漏斗中。（精炼油 4.0g样为4.575mL，可直接用移液器加入分液漏斗再加 溶剂后振摇）振摇2min，静置分层后，放出下层甲醇 水溶液于750mL蒸发皿中。再用5.0mL甲醇水溶液重复 振摇提取一次，提取液一并加入蒸发皿中，以下按自 “65℃水浴通风挥干”起，依法操作。
实验黄曲霉毒素测定
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• 2. 玉米（脂肪含量3.0～5.0％）：
• 样品粉碎后过20目筛，称取20.0g，加入250mL具塞锥形瓶中。准 确加入50.0mL甲醇一水（80+20）溶液和15.0mL石油醚，盖塞后滴 水封严，150rpm振荡30min。用快速定性滤纸过滤于125mL分液漏 斗中,待分层后，放出下层甲醇水溶液于50mL烧杯内，从中取 10.0mL （相当于4.0g样品）于75mL蒸发皿中,以下按上述“65℃水浴 通风挥干”起，依法操作。
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实验二十、食品中黄曲霉毒素B1的检测
标准依据: GB/T5009.22-2003食品中黄曲霉毒素B1的测定
实验黄曲霉毒素测定
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• 一、实验目的与要求：
• 1、学习酶联免疫(ELISA)方法测定粮食及食品中黄曲霉 毒素B1的实验原理，掌握实验的操作要点及测定方法
• 2、了解酶联免疫(ELISA)的工作原理，正确熟练使用酶 标仪。
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五、数据处理及计算结果
• 1、求出各孔的0.D校正值：0.D校正值＝O.D实测值一空白对照孔 0.D值（均值）。
• 2、求出待测样的0.D％值：0.D％＝[O.D校正值/阴性对照孔0.D校 正值（均值）］ × 100％。

均匀分布（如蛋白质） 不均匀分布（黄曲霉毒素）
所谓“ppb”
1，000，000，000中的1分子 32年中的1秒 地球至月球总距离中的40cm 22公斤沙子中的1粒 3.5车厢中的1粒玉米
检测误差 Errors in Analysis
100%总误差
88%采样误差
10%制样误差 2%检测误差
集装箱
原理：紫外线照射后，黄曲霉毒素能发 射特征荧光 优点： 1、操作简便、安全 2、检测限小于2ppb 缺点：有假阳性的存在

酶联免疫法

黄曲霉毒素 B1同肝细胞DNA的鸟嘌 呤碱基结合，使得控制细胞 生长的基因代码发生错误，从而使 细胞生长失控，成为癌性肿瘤。
二、黄曲霉毒素的国际限量
Codex
花生(未加工): 黄曲霉毒素总量
牛奶: 黄曲霉毒素M1 0.5ppb
15ppb
EU
黄曲霉毒素B1/总量
花生、坚果、干果： 2/4ppb 花生（进一步挑选等）：8/15ppb 坚果、干果（进一步挑选）：5/10ppb 谷物及加工产品：2/4ppb 各种调味品：5/10ppb
黄曲霉毒素的毒理作用
黄曲霉毒素是潜在的肝脏毒素。当大剂量摄入 这些毒素时可能是致命的。亚致死剂量会导致慢 性中毒，而低剂量的长期接触则会致癌，特别是 导致肝癌。通常，动物幼仔比成年动物更加容易 遭受黄曲霉毒素的毒害。 黄曲霉毒素引起了人们对健康最强烈的关注， 是因为其广泛分布于一些食物诸如花生、坚果、 牛奶、玉米中，同时也是人类潜在的பைடு நூலகம்癌原。

黄曲霉毒素的化学性质
黄曲霉毒素是结果相近的一群衍生物。化学结 构式为二呋喃环和香豆素。在紫外线下，黄曲 霉毒素B1、B2发兰色荧光，黄曲霉毒素G1、G2发 绿色荧光。 黄曲霉毒素的分解温度为237-299度，一般加 热不能破坏其毒性。 在有氧条件下，紫外线照射可去毒。 难溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有 机溶剂，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中。一 般在中性及酸性溶液中较稳定，在强碱溶液下 易分解

人氯化钠3g，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟（搅拌速度 大于11000转/分钟），离心5分钟（离心速度2500转/分钟），精密量 取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜 （0.45µm）滤过，量取续滤液20.0ml，通过免疫亲合柱，流速每分钟 3ml，用水20ml洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子， 再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻 度，摇匀，即得。
《中国药典》2015年版柏子仁等14味易受黄曲霉毒素感 染药材及饮片增加了“黄曲霉毒素”检査项目和限度标准。
必备知识
高效液相色谱法检查黄曲霉毒素
本法系用高效液相色谱法（通则0512）测定药材、饮片及制剂中 的黄曲霉毒素（以黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲 霉毒素G2总量计），黄曲霉毒素
必备知识
注意事项 本实验应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境。 残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，应置于专用贮存容器
（装有10%次氯酸钠溶液）内，浸泡24小时以上，再用清水将玻璃器皿
冲洗干净。 流动相单独收集，先用次氯酸钠灭毒，再按常规处理 当测定结果超出限度时，采用第二法进行确认。
B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标示浓度分别1.0µg/ml、0.3µg/ml、 1.0/µg/ml、0.3µg/ml）0.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作 为贮备溶液。精密量取贮备溶液1ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻 度，即得。
必备知识
高效液相色谱法检查黄曲霉毒素
供试品溶液的制备 取供试品粉末约15g（过二号筛），精密称定，置于均质瓶中，加
中药制剂的杂质检查技术
—— 高效液相色谱法检查黄曲霉毒

HPLC-UV HPLC-FLD HPLC-FLD/ELISA Bio-method / ELISA HPLC-MS/MS
实验室认可
STCIQ is accredited by China national accreditation service for Conformity Assessment (CNAS) and operated in accordance with ISO/IEC 17025:2005 (E) General requirements for the competence of testing and calibration laboratories.
FAPAS 成绩
时间 Date 轮次号FAPAS Series and Round AFB1 z-score Total AF zscore
2001.1 1 2002.1 0 2003.7
Series 4 Round 39 Series 4 Round 47 Series 4 Round 56 2004.9 Series 4 Round 67 2005.8 FAPAS 0479
黄曲霉毒素的产生
黄曲霉毒素主要由黄曲霉和寄生曲霉等 在代谢过程中产生。 黄曲霉毒素产生的条件：菌株的产毒能 力、适宜的湿度（80%-90%相对湿度和基 质的含水量）、温度（24-30度）、氧气 （1%以上）、培养时间、机械损伤、昆 虫损害等。

黄曲霉毒素的分布
黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2大多分布在 农产品中，常见的有花生、玉米、棉籽、 芝麻、杏仁、辣椒等。 黄曲霉毒素M1分布在牛奶及奶制品中。 在哺乳动物的肝脏与尿中发现了黄曲霉 毒素P1和Q1。
均匀分布（如蛋白质） 不均匀分布（黄曲霉毒素）

3.2.3 结果计算
同单向展开法。
3.2.4 说明及注意事项
用过后受污染的玻璃器皿，应经次氯酸溶液(25g ／L)，浸泡消毒后再清洗之。
20%不等。硅胶有时含有铁盐及氯离子等杂质，它们可被展开剂提取出来， 对层析的结果产生一定影响。 • 硅胶H――不含粘合剂和其他添加剂（不会被展开剂提出杂质）。 • 硅胶HF254 ――掺有荧光指示剂，可在短波254纳米的紫外光下观察到荧光。 • 硅胶GF254――含石膏及荧光物质。
黄曲霉毒素B1标准溶液
展开与观察
•
在展开槽内加10mL无水乙醚，预展12cm，取出挥干。
再于另一展开槽内加10mL丙酮一三氯甲烷(8+92)，展开
10～12cm，取出，在紫外光下观察结果，方法如下：
•
a．由于样液上加滴了AFTB1标准，可使AFTB1标
准点与样液中AFTB1荧光点重叠。若样液为阴性，薄板上
第三点AFTB1为0．000 4μg，可用作检查样液中AFTB1
• 黄曲霉毒素属剧毒物质，其毒性比氰化钾还高，也是目前最强的化学致癌物 质。其中AFT B1的毒性和致癌性最强，帮其在食品中允许量各国都有严格 规定。
• AFT主要污染粮油及其制品，如花生、花生油、玉米、大米、棉籽等被污染 严重。
黄曲霉毒素允许量标准
• 食品品种 允许量标准（ppb或10-6）
• 玉米、花生、花生油 ≤20
次氯酸钠溶液
• 配制：取100g漂白粉，加入500mL水，搅拌均 匀。另将80g工业用碳酸钠(Na2CO3·H2O)溶于 500mL温水中。将两液合并、搅拌、澄清、过滤。 此液含次氯酸25g／L。
• 思考题： • 1、次氯酸钠溶液的作用是什么？ • 消毒用，污染的玻璃器皿用次氯酸钠溶液浸泡可

液相色谱 试剂盒 紫外线
液相色谱
检测结果 4.0ppb 57.0ppb 3.9ppb 38.0ppb 0ppb 0ppb 0ppb 0ppb 93 ppb 98 ppb
偏差值
备注
0.1 ppb 53.1 ppb
0 ppb 34.1 ppb
0 ppb 0 ppb 0 ppb 0 ppb —3.0 ppb 0 ppb
采样
• 采样时必须特别注意样品的代表性和避免 采样时的污染。
• 根据原料及饲料仓库，料垛的大小和类型， 分层定点采样，一般可分三层五点或分层 随机采样，不同点的样品，充分混合后， 取500g左右送检。
• 利用四分法，取一份约150g左右饲料样粉 碎，充分混匀。
• 将被检样品粉碎过20目筛，用4分法取20g 于分析筛上，让其筛下物均匀分布于筛盘， 于365nm紫外线下观察，细心查看有无亮 黄绿色荧光粒，并记录荧光粒颗数。
黄曲霉毒素感观检
南京柏发生物科技
• 粮油饲料真菌毒素类检测试剂盒： • 黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、三聚氰胺、赭曲霉毒素、
T2毒素、伏马毒素ELISA快速检测试剂盒 • 胶体金快速检测试纸条类： • 黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、三聚氰胺 • 仪器设备类： • 酶标仪、离心机、移液枪、素检测资料、品管化验制度、饲料国标、原料鉴别、原料储藏资料
判定标准来源
• 表一黄曲霉毒素含量与玉米荧光粒数关系 表
荧光粒（颗）
4
8
12
16
20
AFT含量（ug/kg）
5
10
20
59
76
（ ug/kg）
• 关系图
120 110 100
90 80 70 60 50 40 30 20 10