中枢神经蛋白质组分析中双向电泳技术的建立

随着后基因时代的来临，研究生命活动的直接 执 行 体— — —蛋 白 质 的 科 学— — —蛋 白 质 组 学 （ B>4C/4@’AH ） 应 运 而 生 = 双 向 电 泳 （ CG4, ?’@/*H’4*<D /D/AC>4B04>/H’H， 5,ON ） 作 为 蛋 白 质 组 研 究 的 开 门 技 术， 得 到 生 物 医 学 界 的 充 分 关
G>. 0 +/H #$% 胶， "2/ (( < ++/ (( < / 8 2 (( 9:9 凝胶 （ +" 8 2 C ） ， 泡胀时加低电压， 银染 ! "! I"E : 蛋 白 质 标 准 ， !："E:F 蛋白质标准，"：低分子质量蛋白质标准 !
!’(
平衡
等电聚焦电泳后， #$% 胶条在平衡液 4 平衡 +2 (56，再在平衡液 7 中平衡 +2 (56，用湿润的滤 纸吸去胶条多余的平衡液 ! !’) *+*,-./# #$% 胶 条 平 衡 后， 在 靠 近 阴 极 缓 冲 条 侧
双向电泳是目前分析组分复杂蛋白质分辨率最 高的 工 具 之 一 = 5,ON 技 术 的 第 一 向 等 电 聚 焦 （’H4/D/AC>’A I4A&H’* +， ZN^）是基于蛋白质等电点不 同而将其分离；第二向 6O6,聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ ["$N）是基于蛋白质亚基分子质量不同将一向 分离后的蛋白质进一步分离 = 双向电泳后，将 5, ON 凝胶染色，然后扫描；再用专业分析软件包对 5,ON 图谱进行分析、比较 = 万方数据
7 3 P "M M ! ! " $ " $ 平 衡 液： :’ 33,- R 6 M@*H8(N- .( K Y K、 9 3,- R 6尿素、 =’T 甘油、 LT E"E、少量溴 酚 蓝， U L’V 保存 ! 平衡液工作液 4：使用前 F’ 3- 平衡 液储存液加 F’’ 3 P "M M ! 平衡液工作液 W：使用 前 F’ 3- 平衡液储存液加 L:’ 3 P 碘乙酰胺 ! E"E 凝胶缓冲贮液： F Y : 3,- R 6 M@*H8(N-、 ’ Y ST E"E .( K Y K，SV 保存 ! !"$"% !"$"& !"$"’ 质电泳实验技术》配制 !
储存液
L’’’；#<（9）
髓）的蛋白质进行了双向电泳的初步尝试，获得了 满意的电泳图谱 !
()(*+,-. 均一胶配方
浓缩胶 分离胶 （ M Z S Y KT ） （ M Z FL Y :T ） ’ Y K 3） L） K Y SF（ FF Y L） 3-
!
!"!
材
设备
料
L& Y FT 丙烯酰胺 R ’ Y &T 甲叉 双丙烯酰胺储存液 凝胶缓冲液 K7T 甘油 双蒸水 MDAD" F’T 过硫酸铵 终体积
样品处理非常困难 = 对样品液组成、样品处理、上样方式、上样量、 Z[$ 胶条和 6O6,聚丙烯酰胺凝胶电泳染色 方法和保存等相关技术进行了比较研究和条件优化后，以固相 B% 梯度等电聚焦为第一向和 6O6 均一胶（ . \ (5 P MT ）的水平电泳为第二向，成功地得到了神经组织双向电泳图谱 = 关键词 蛋白质组，双向电泳， [8(5 细胞，中枢神经组织 -M( 学科分类号
用于灌制
L:’ 33 [ FK’ 33 [ ’ Y : 33 的凝胶 !
#
#"!
实验方法
样品处理
# " ! " ! >NFL 细胞蛋白提取：吸 出 培 养 液，加 入 >0E，F ’’’ ! 离心 F’ 3*5；弃上清， >0E 洗 = 次 后；加入 : 倍体积裂解液，混匀，液氮中反复冻融 三次 后， F:V ， S’ ’’’ ! 离 心 =’ 3*5 ! 上 清 用 ［F’］ 定量，蛋白质浓度约为 = I S P R 6 ! 0@4+G,@+ 法 # " ! " # 中枢神经组织蛋白提取：预冷生理盐水冲 洗新鲜大鼠脑（脊髓）组织中的血液，用滤纸吸去 多余的液体，称重后液氮冻存 ! 混合液氮用研钵将 液氮冻存的样品研成粉末，按 F P 样品加入 ’ Y : 3样品液 4，匀浆 =’ H，再加入 F 3- 样品液 W 或 F P 样品仅加入 F Y : 3- 样品液 W，匀浆 =’ H! 组织悬液 F’ ’’’ ! 离心 F’ 3*5；上清液 SV ， F:’ ’’’ ! 离心 S: 3*5，小心避开上层漂浮的脂质层，吸取离心上 清；9V S’ ’’’ ! 再次离心 :’ 3*5，取离心上清 ! 0@4+G,@+ 法定量，蛋白质浓度约为 K P R 6 ! #"# 制胶 按表 F 配方配制凝胶液， 6\0 生产的梯度混 合器搅拌，保持一定高度重力灌制 E"E 凝胶 ! 分 别灌制成 L:’ 33 [ FK’ 33 [ ’ Y : 33 或 L:’ 33 [ FF’ 33 [ ’ Y : 33 的 E"E8聚丙烯酰胺凝胶 ! #"$ 等电聚焦电泳 将 #>? 预 制 胶 条 在 室 温 中 平 衡 F’ 3*5，在 #>? 条状电泳槽（ HC@*. /,-+)@）中加入适当的 #>? 胶条 泡 胀 液 （ FK 13 加 入 =:’ " -， FF 13 加 入 L’’ " -）后，将 #>? 胶条胶面向下放入条状电泳槽 中， 然后滴加覆盖液， 在 #>? ./,@ 上 泡 胀 F L / 以
"2/ (( < ++/ (( < / 8 2 ((
+ "
!’2
银染和 *+* 胶的保存
［=］ 参照郭尧君著 《蛋白质电泳实验技术》银
染方法，用 >?@A@B 自动凝胶染色仪编制程序染色 ! 染色后，将 9:9 胶在 +/C 甘油中浸泡 ./ (56 后， 放于 玻 璃 平 板，用 +/C 甘 油 浸 湿 的 玻 璃 纸 包 在 9:9 胶上，晾干 !
万方数据
E"E 均一胶配方见表 F ! ［&］ 银染溶液和保存液参照郭尧君著 《蛋白
"///；!4（1）
生物化学与生物物理进展
-567 8 9:6;<=>8 9:6?<@A8
・ 13L ・

上 ! 泡胀后进行等电聚焦电泳 ! 等电聚焦电泳按表 " 参数进行电泳 !
表!
#$% 胶条 +, -(
骤，对 $D+" 细胞和大鼠中枢神经组织使用了不同 的提取方法，取得了满意的 $D+" 和大鼠脑、脊髓 蛋白质 "E:F 电泳结果 ! 结果见图 + 0 图 3 !
-31! 细胞蛋白质 !,+# 图谱
*+*,-./# 参数设置（1)& ）
时相 + " ! & ’ " & () $ & ; "// ,// +// 1// "/ 3/ "/ 3/ 3/ 3/ ./ ./ # & (56 3/ +2/ ./ +//
G>. 0 +/JH #$% 胶，"2/ (( < ++/ (( < / 8 2 (( 9:9 凝胶 （+" 8 2C ，总蛋白质量 +// ! K 与泡胀液混合上样，泡胀时加 低电压，银染 !
F Y L: 3L Y ’ 3’ Y &: 3LY:" LS " : 3-
: Y ’（9 Y 97）3F Y ’（F Y ==）3: Y 9（7 Y S7）3F’（F= Y ==） " &9（FLK） " L’（=’）3L）
用 于 灌 制 L:’ 33 [ FF’ 33 [ ’ Y : 33 的 凝 胶 !
"#$ 电泳参数设置（!%& ）
! &’ ./ 0 1/ 2// + /// , /// ./ 0 1/ 2// + /// , /// " & () 2/ 2/ 2/ 2/ 2/ 2/ 2/ 2/ #&* +" + + 3 +" + + "
时相 泡胀 + " .
++ -(
泡胀 + " .
图1
!,+# 蛋白质标准图谱
刘少君 J/D： （:(:）SSY;5;9Y（ 2） ，SSY;(;:V（ 1） ； 郭尧君 J/D： （:(:）SVWWWMS5， N,@<’D： F<4_&*‘ 5S; = */C 收稿日期：5:::,:5,5Y，修回日期：5:::,:M,(:
・ 9S9 ・
生物化学与生物物理进展
+/01 2 34056782 34096:;2 表!
图0 大鼠脊髓蛋白质 !,+# 图谱
0
结
果
G>. 0 +/H #$% 胶， "2/ (( < +,/ (( < / 8 2 (( 9:9 凝胶 （+" 8 2C ） ，总蛋白质量 +// ! K 与泡胀液混合上样，泡胀时 加低电压，银染 !
我们采用 #$% 等电聚焦为第一向， 9:9 水平 电泳为第二向的电泳体系，按照上述改进的实验步 万方数据
F）
， "#$%&’’ 匀 浆 仪 （ 德 国， ()*+,-./ 公 司 ） 0)12345 6789: 超 速 离 心 机 （ 德 国， 0)12345 公 司） ， ; <==’ 紫外分光光度计（英国， ;5*143 公 司） ； #>? ./,@ 电泳单元、灌胶模具、梯度混合器、 AB-C*./,@!水平电泳单元、 D>E8=:’F 电源、循环 水浴、 (,)G)@ 自 动 凝 胶 染 色 仪 均 购 自 $3)@H/43 >/4@341*4 0*,C)1/ 公司 ! !"# 试剂和材料 .(= I F’ 线 性 （ -*5)4@， 6 ） 和 非 线 性 （ 5,5-*5)4@， J6 ） FF 13、 FK 13 #>? 预 制 胶 条、 #>? 缓冲液、 E"E 缓冲胶条、低分子质量蛋白质标 准、L8"D 蛋 白 质 标 准 试 剂 盒 均 购 自 $3)@H/43 >/4@341*4 0*,C)1/ 公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰 胺、二硫苏糖醇（ "M M ） 、尿素、=8［（=8胆酰胺丙 基）8二乙胺］8丙磺酸（ N($>E ） 、苯甲基磺酰氟 （ >AEO）购 自 E*P 34 公 司； J ， J ， JQ， JQ8四 甲 基乙二胺（ MDAD"） 、碘乙酰胺购自 O-B24 公司 ! !"$ !"$"! 溶液配制 样 品 液 4： K 3,- R 6 尿 素、 ST N($>E、 S’ 33,- R 6 M@*H， U L’V 保 存 ! 样 品 液 W： S’ 33,- R 6 M@*H、 7 3,- R 6 尿 素、 L 3,- R 6 硫 脲、 ST N($>E、 F’ 33,- R 6 "M M 、 F 33,- R 6 D"M$、 F 33,- R 6 >AEO； U L’V 保存 ! !"$"# #>? 泡 胀 储 存 液： 尿 素 K 3,- R 6、 ST 、 N($>E LT #>? 缓冲液、少量溴酚蓝， U L’V 保 存 ! 使用前加 "M M X L Y : 3- #>? 泡胀液储存液加入