胚胎干细胞培养有新法

胚胎干细胞的培养和调控胚胎干细胞是一种具有极高生物学价值的细胞。

它的特点是可以无限制地自我复制，并能够分化成人体内的各种细胞类型，包括心脏细胞、神经细胞、肌肉细胞等。

这使得胚胎干细胞成为了治疗许多疾病的有力工具，例如肌萎缩侧索硬化症、帕金森病、白血病等。

为了能够将胚胎干细胞应用于实际医疗中，必须先要掌握胚胎干细胞的培养和调控方法。

第一部分培养胚胎干细胞胚胎干细胞的培养需要一定的条件，其中最重要的是营养基质和生长因子。

营养基质是指提供细胞培养所需营养物质的培养基，生长因子则是刺激细胞增殖、分化和细胞功能发挥的非细胞因子分子。

经过多年的研究，科学家们已经掌握了许多优化的胚胎干细胞培养方法，不断改进和创新。

胚胎干细胞的培养主要分为两种方式：一种是使用人类免疫缺陷病毒（HIV）携带的重编程因子，使成人普通细胞重新向胚胎干细胞转化，这种方法的优点在于可以避免使用和浪费胚胎，并且可以根据患者自身的细胞进行个性化治疗；另一种是从人类胚胎中提取胚胎干细胞，这种方法的优点在于可以获得自体造血干细胞以及每一个器官的种子细胞，但在实际应用中受到较多的道德和法律争议。

无论哪种方式，胚胎干细胞的培养本质相同，主要包括以下几个步骤：1. 种植选取营养基质，并将干细胞种植在营养基质中。

营养基质需要包含必需氨基酸、维生素和其他生命所需营养元素。

2. 培养维持培养基的稳定状态，将培养器置于恒温室内，控制培养环境的温度、湿度和CO2浓度等。

3. 复制控制胚胎干细胞的倍数，使其以匀速增长的状态进行培养。

此过程中，应将胚胎干细胞分离至新的培养基中，以保证细胞的数量和干细胞的稳定性。

4. 检测定期检测胚胎干细胞的状态，包括细胞分裂速率、分化程度和遗传特征等，以确保其基态的维持和无突变状态的可能。

第二部分调控胚胎干细胞胚胎干细胞的应用广泛，不仅包含了生物学研究的范畴，还拥有丰富的临床应用前景。

在这个方向上，胚胎干细胞的调控成为了必不可少的一环。

干细胞治疗胚胎干细胞途径与法律限制问题评估干细胞治疗作为一种新兴的治疗方法，给人们带来了希望。

其中，胚胎干细胞被认为具有巨大的潜力，可以用于治疗一系列严重疾病和损伤。

然而，胚胎干细胞的使用涉及到诸多道德和法律限制问题。

本文就干细胞治疗胚胎干细胞途径和法律限制问题进行评估。

首先，我们需要了解胚胎干细胞的来源。

胚胎干细胞可以从早期胚胎中获得，这意味着胚胎会被摧毁。

这给了人们道德上的困扰。

在不同国家和地区，对胚胎干细胞的使用存在着不同的规定和约束。

在美国，胚胎干细胞的研究受到了限制。

2001年，美国国家卫生研究院批准了对一部分胚胎的研究使用，但对于新鲜的胚胎的使用是被禁止的。

这一政策限制了胚胎干细胞的研究进程，并引发了伦理上的争议。

然而，近年来，新兴的诱导多能性干细胞技术为该领域带来了曙光。

这项技术使得科学家可以从成人细胞中重新编程获得类似于胚胎干细胞的多能性干细胞，从而避免了涉及胚胎的伦理和法律问题。

在欧洲，对胚胎干细胞的使用存在着更为严格的限制。

欧盟立法将胚胎生命的保护置于优先地位，因此，使用新鲜胚胎的研究是被禁止的。

只有存在合法的尸胎的情况下，才能获得胚胎干细胞。

这一法律限制引发了科学界和道德界之间的激烈争议。

尽管如此，欧洲在干细胞领域的研究卓有成效。

中国是世界上最活跃的干细胞研究国家之一。

中国的法规相对宽松，允许胚胎干细胞和成人干细胞的使用。

在中国，可以通过捐赠冷冻胚胎、人类胚胎核移植和克隆技术等多种途径获得胚胎干细胞。

这使得中国成为干细胞研究和临床应用方面的领导者。

然而，也必须注意到，胚胎干细胞的使用需要受到严格的监管，以确保伦理和法律的合规性。

当前，随着干细胞技术的飞速发展，越来越多的国家和地区开始制定相关法律规定，以保护科学研究的合法性和伦理性。

这些法律限制主要是为了平衡科学研究和伦理价值观之间的关系，避免滥用和伦理冲突的发生。

可以预见，未来的法规可能会更严格并逐渐与国际接轨，以便更好地管理胚胎干细胞的使用。

胚胎干细胞的制备及研究进展摘要：胚胎干细胞(ES细胞)是从动物早期胚胎的内细胞团或原始生殖细胞分离出来的具有发育全能性的一种未分化的无限增殖细胞系。

ES细胞在动物克隆、转基因动物生产、细胞工程、组织工程、临床克隆治疗和发育生物学等方面的研究应用中起着重要的作用。

引言近年来，随着科学技术的不断发展，世界各国对胚胎干细胞的研究不断深入，取得了许多突破性的进展[1]。

科学证明小鼠ES细胞可以分化为心肌细胞、造血细胞、卵黄囊细胞、骨髓细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、内皮细胞、黑色素细胞、神经细胞、神经胶质细胞、淋巴细胞、胰岛细胞、滋养层细胞等。

人类ES细胞也可以分化为滋养层细胞、神经细胞、神经胶质细胞、造血细胞、心肌细胞等。

ES细胞不仅可以作为体外研究细胞分化和发育调控机制的模型，而且还可以作为一种载体，将通过同源重组产生的基因组的定点突变导入个体[2]。

这意味着ES细胞将在动物克隆、转基因动物生产、细胞工程、组织工程、临床克隆治疗和发育生物学等方面发挥重要作用，为人类攻克癌症等疑难杂症开辟新的道路。

1胚胎干细胞胚胎干细胞是由哺乳动物附植前早期胚胎的内细胞团细胞或附植后胚胎的原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)通过体外分离培养而建立的克隆细胞系。

它具有与早期胚胎细胞相似的形态，即胞体小、核大、胞浆少且具有正常的二倍体核型。

ES细胞最突出的特点是只生长不分化，且保持早期胚胎发育的全能性，在饲养层上或含有白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)的培养基中，可稳定传代，长期培养。

体外诱导分化可形成3个胚层的分化细胞。

另外，ES细胞还具有种系传递功能和具有培养细胞所有的特征[3]。

胚胎干细胞不但可用于研究哺乳动物胚胎早期发育和细胞谱系分化，还可对它的基因组进行操作，通过基因打靶、突变和转基因等技术，建立各种实验模型，研究发育、肿瘤、免疫以及人类遗传病等有关问题，大大推动和发展了哺乳动物生物学的研究。

小鼠胚胎干细胞体外诱导分化成GABA能神经元目的探讨小鼠胚胎干细胞在体外培养向GABA能神经元定向诱导分化的可能性。

方法将小鼠胚胎干细胞以“无血清”方法培养,用DMEM/F12、N2、B27及NT4作为诱导分化剂定向诱导分化,分化好的细胞利用免疫荧光技术、流式细胞技术和RT-PCR鉴定。

结果在胚胎干细胞诱导分化成神经元后期,免疫荧光显示有GABA能神经元存在;RT-PCR结果证实有GABA能神经元正确分化的重要调控基因Viaat、Gad1和Gad2基因表达;流式细胞仪计数结果显示GABA阳性细胞约占总细胞数的(11.49±6.86)%。

结论小鼠胚胎干细胞经体外培养可以定向诱导分化成GABA能神经元,可作为神经移植的新来源。

[Abstract] ObjectiveTo investigate the possibilities of in vitro culture and differentiation of mouse embryonic stem cell to GABAergic neurons. MethodsMouse embryonic stem cells were cultured and induced into GABAergic neurons in serum-free cultural condition. Immunofluorescence,reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) and flow cytometer assay were used to identify the properties of the differentiated cells. ResultsIn the later period of differentiation of embryonic stem cells into neurons,immunofluorescence showed that GABAergic neurons existed,RT-PCR results confirmed the important regulatory genes Viaat,Gad1 and Gad2 gene expression due to the correct differentiation of GABAergic neurons and flow cytometry analysis showed the GABA-positive cells accounted for about(11.49±6.86)% of the total cell number. ConclusionMouse embryonic stem cells can be induced into GABAergic neurons in vitro in serum-free cultural condition,providing a new source of nerve graft.[Key words]Embryonic stem cell; Induce; Differentiate; GABA干细胞移植治疗中枢神经系统疾病的研究方兴未艾,且取得了一定成果,但由于其多取材于胚脑的神经干细胞,为日后临床应用埋下了伦理道德问题之患,并且受到供体来源短缺的限制[1]。

小鼠胚胎干细胞（mES细胞）、小鼠iPS细胞培养ProtocolMEF细胞铺制：1. 在T25培养瓶中加入0.2%明胶，摇匀后覆盖底面即可，于37℃细胞培养箱至少放置15min以上。

2. 吸除0.2%明胶，加入事先水浴加热至37℃的MEF完全培养液。

一般地，一个T25培养瓶中加入5ml MEF完全培养液。

3. 按实验需要：小鼠胚胎干细胞使用KM-r P3 MEF或CF-1 P3 MEF；小鼠iPS使用ICR-rP3 MEF，复苏MEF细胞若干支。

将冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。

4. 将冻存管内细胞悬液转移至含2 ml MEF完全培养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min，离心后将上清液吸除，另加入新鲜的MEF完全培养液1 ml，重悬后按照一个T25培养瓶铺1 × 106的MEF细胞，平均加入到T25培养瓶中，轻轻摇匀后至于37℃细胞培养箱。

24 h以后可以传入小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞。

5. 复苏或传代小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞前，将T25培养瓶中的MEF完全培养液吸除，加入2 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液轻轻冲洗一遍后吸除，加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液待用。

复苏：1. 将小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中是之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。

2. 将冻存管内细胞悬液转移至含3-4 ml小鼠胚胎干细胞，小鼠iPS细胞完全培养液的15ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min。

3. 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液2 ml，吹打悬浮。

4. 重复吹打，制成单细胞悬液，尽量避免起泡。

5. 转移至1个已经铺好MEF细胞的T25培养瓶中培养。

细胞的原代培养点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园一、原代细胞培养原理原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。

借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。

• 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养• 掌握无菌操作技术• 了解小鼠解剖操作技术• 了解原代细胞培养的一般方法与步骤•了解培养细胞的消化分散• 了解倒置显微镜的使用二、实验材料• 实验动物：孕鼠或新生小鼠• 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清）0.25%胰蛋白酶平衡盐溶液70%乙醇•器材：灭菌镊子、剪刀若干把灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个吸管若干支酒精灯原代细胞培养方法三、胰酶消化法（1）胰酶消化法操作步骤——取材a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。

b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。

c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。

d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。

e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。

f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。

继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。

（2）胰酶消化法操作步骤——切割a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。

b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。

c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。

（3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。

胚胎干细胞体外培养(一)胚胎干细胞的来源目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。

其中囊胚的ICM最为常用。

(二)胚胎干细胞的分离1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。

以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。

以PGCs取ES细胞时：小鼠取12.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或13.5～14.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。

2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。

从囊胚分离ICM的方法主要有三种：(1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。

这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。

(2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。

结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。