血红蛋白的检测

一 血红蛋白的提取和分离实验的方法：

1：实验材料，仪器，试剂及试剂的配制 （1） 实验材料：新鲜的鸡血

（2） 实验仪器：离心机，烧杯（100ml），胶头滴管，玻璃棒，离心管架，漏斗，纱布等。

（3） 实验试剂：饱和（NH4）2SO4溶液（PH=6.0~7.0），柠檬酸钠溶液，生理盐水，蒸

馏水。

（4） 试剂的配制：1. 饱和（NH4）2SO4溶液的配制：100ml蒸馏水中溶解76g（NH4）2SO4，用氨水滴PH值至6.5左右；

2.生理盐水的配制：取9gNaCl溶于1000ml蒸馏水中。

3.柠檬酸钠溶液的配制：6g柠檬酸钠溶于100ml生理盐水中（可收集

100ml鸡血）。

2：实验步骤： （1） 收集并清洗鸡血：用盛有柠檬酸钠溶液的烧杯装新鲜的鸡血（防止鸡血凝固），然后

将鸡血用300ml生理盐水稀释，充分搅拌后转移到50ml离心管中，离心（V=5000rpm）5min（此步可除去血清蛋白）。

（2） 破碎鸡血细胞：小心倒掉上清，下层细胞加入50ml的蒸馏水，剧烈震荡10min，离

心（V=5000rpm）10min.。取上清溶液，即血红蛋白的溶液，用多层纱布过滤。 （3） 盐析分离血红蛋白：向滤液中逐渐加入（NH4）2SO4饱和溶液，边加边摇，约加入

与血红蛋白溶液相同体积时，溶液出现浑浊。静止20min，离心10min(v=5000rpm).。

红色沉淀就是分离出来的血红蛋白。

血红蛋白溶液通过盐析并离心后得到红色沉淀，此时上清溶液基本无色，表明该沉淀就是我

们分离得到的血红蛋白，无需用其他方式进行验证。下面就几点进行讨论;1我们购买鸡血时，为了防止鸡血凝固，把鸡血收集到事先准备好的盛有柠檬酸钠溶液的瓶子里，可以放置一白

天，若要过夜，温度须控制在4摄氏度。2我们用蒸馏水使细胞涨破而不用甲苯（有毒），

既简单又安全，同时还可以将血红蛋白溶液进行稀释。3用盐析法进行蛋白质分离试验，比

通过色谱柱，减少了实验难度，降低了试验成本，缩短的试验时间。

二、缓冲溶液

1定义

把能抵抗外加少量强酸或强碱，而维持pH基本不发生变化的溶液称为缓冲溶液。缓

冲溶液所具有的抵抗外加少量强酸或强碱的作用称为缓冲作用。多数细胞仅能在很窄的pH

范围内进行活动，而且需要有缓冲体系来抵抗在代谢过程中出现的pH变化。在生物体中有 三种主要的pH缓冲体系，它们是蛋白质缓冲系统、重碳酸盐缓冲系统以及磷酸盐缓冲系统

。每种缓冲体系所占的分量在各类细胞和器官中是不同的。

在生化研究工作中，常常需要使用缓冲溶液来维持实验体系的酸碱度。研究工作的溶液体系 pH值的变化往往直接影响到研究工作的成效。如果“提取酶”实验体系的pH值变动或大幅

度变动，酶活性就会下降甚至完全丧失。所以配制缓冲溶液是一个不可或缺的关键步骤。 2.组成

较浓的强酸和强碱也有缓冲作用，但由于这类物质酸性或碱性过强，所以很少作为缓

冲溶液使用，一般使用的缓冲溶液是由足够浓度和适当比例的共轭酸碱对所组成。习惯上把

组成缓冲溶液的共轭酸碱对称为缓冲对，缓冲溶液是由足够浓度的缓冲对组成的混合溶液。缓冲溶液之所以具有缓冲作用，是因为溶液中同时存在足量的共轭酸碱对，它们能够抵抗外 加的少量强酸或强碱，从而保持溶液的pH基本不变。如果加入大量的强酸或强碱，缓冲溶

液中的抗酸成分或抗碱成分将耗尽，缓冲溶液就丧失了缓冲能力。

常用作缓冲溶液的酸类 由弱酸及其共轭酸盐组合成的溶液具有缓冲作用。生化实验室常用的缓冲系主要有磷酸、柠檬、

酸碳酸、醋酸、巴比妥酸、Tris（三羟甲基氨基甲烷）等系统，生化实验或研究工作中要慎重地

选择缓冲体系，因为有时影响实验结果的因素并不是缓冲液的pH值，而是缓冲液中的某种离子

。如硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐和三羟甲基甲烷等缓冲剂都可能产生不需要的化学反应。 硼酸盐：硼酸盐与许多化合物形成复盐、如蔗糖。

柠檬酸盐：柠檬酸盐离子容易与钙结合，所以存在有钙离子的情况下不能使用。

磷酸盐：在有些实验，它是酶的抑止剂或甚至是一个代谢物，重金属易以磷酸盐的形式从溶

液中沉淀出来。而且它在pH7.5以上时缓冲能力很小。

三羟甲基氨基甲烷：它可以和重金属一起作用，但在有些系统中也起抑制作用。其主要缺点时温度效应。这点往往被忽视，在室温pH是7.8的Tris缓冲液，4℃时是8.4，37℃时是7.4，

因此，4℃配制的缓冲液在37℃进行测量时，其氢离子浓度就增加了10倍。在pH7.5以下，

其缓冲能力极为不理想

血红蛋白中用的是磷酸缓冲液 磷酸缓冲液配制方法：NaH2PO4•2H2O：10.86105g（或NaHPO4•12H2O：21.8502g） + NaH2PO4•2H2O：6.08595g（或NaH2PO4•H2O：10.76g），溶解，定容至1L

上述药品都是极易溶的，直接溶解就行了 附 磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（0.2mol/L）

PH值 0.2mol/lNa2HPO4溶液（mL） 0.2mol/LNaH2PO4溶液（mL） PH值 0.2mol/lNa2HPO4溶液（mL） 0.2mol/LNaH2PO4溶液（mL）

5.8 8.0 92.0 5.9 10.0 90.0

6.0 12.3 87.7 6.1 15.0 85.0

6.2 18.5 81.5 6.3 22.5 77.5

6.4 26.5 73.5 6.5 31.5 68.5

6.6 37.5 62.5 6.7 43.5 56.5

6.8 49.0 51.0 6.9 55.0 45.0

7.0 61.0 39.0 7.1 67.0 33.0

7.2 72.0 28.0 7.3 77.0 23.0

NaH2PO4•2H2O：Mr=178.05，0.2mol/L溶液为35.61g/L;

NaHPO4•12H2O：Mr=358.22，0.2mol/L溶液为71.64g/L;

NaH2PO4•2H2O：Mr=156.03，0.2mol/L溶液为31.21g/L; NaH2PO4•H2O：Mr=138.01，0.2mol/L溶液为27.6g/L。

柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液（0.1mol/L）

pH 0.1mol/L

柠檬酸/ml 0.1mol/L柠

檬酸钠/ml pH 0.1mol/L

柠檬酸/ml 0.1mol/L柠

檬酸钠/ml 3.0 18.6 1.4 3.2 17.2 2.8

3.4 16. 4.0 3.6 14.9 5.1

3.8 14.0 6.0 4.0 13.1 6.9 4.2 12.3 7.7 4.4 11.4 8.6

4.6 10.3 9.7 4.8 9.2 10.8

5.0 8.2 11.8 5.2 7.3 12.7

5.4 6.4 13.6 5.6 5.5 14.5

5.8 4.7 15.3 6.0 3.8 16.2

6.2 2.8 17.2 6.4 2.0 18.0

6.6 1.4 18.6

柠檬酸C6H8O7•H2O，Mr = 210.14，0.1mol/L溶液为21.01g/L 柠檬酸钠Na3C6H5O7•2H2O，Mr = 294.12，0.1mol/L溶液为29.41g/L

三制备好的血红蛋白样品的品质：

1. 浓度：血红蛋白浓度指单位提及(L)血液内所含的血红蛋白的量。血红蛋白又称血色素，是红细胞的主要组成部分，能与氧结合，运输氧和二氧化碳。可以用近红外光谱法无创测量

人体血红蛋白浓度。在测量血红蛋白浓度时,将光源与检测器相隔一定的距离放于体表某部

位,由光源发出的光子透过外层组织进入待测部位,经过组织的散射,总会有一小部分光子经

过曲折的迁移路径后被检测器接收。大量统计结果表明,由于散射的影响,光子从光源到检测器之间为随机迁移过程,总的传播路径呈“香蕉”形[ 3 ] 。考虑强散射介质中多次散射和衰

减, Delpy提出用下式来描述光在组织中的传播:

其中, I0 为入射光强, Ir为出射光强, A 为吸光度,ρ为光源到检测器的距离,εi为摩尔吸光系

数(取决于光的波长和吸收体性质) , Ci为被检测物质的浓度, G为背景吸收、散射引起的衰减。DPF为差分路径因子[ 4 ] 。通过测量氧合血红蛋白(HbO2 ) 浓度值rHbO2和去氧血红蛋

白(Hb)浓度值rHb,将两者相加便可得出全血红蛋白浓度值rtHb,这需要在相近的位置

λi -血红蛋白浓度（Hb）正常值：

成年男性：120～160g/L 成年女性：110～150g/L

新生儿：170～200g/L

儿童：110～160g/L 血红蛋白浓度（Hb）临床意义：血红蛋白增高、降低的临床意义基本和红细胞计数的临床

意义相似，但血红蛋白能更好地反映贫血的程度。

血红蛋白增多有以下情况：(1)生理性增多：见于高原居民、胎儿和新生儿，剧烈活动、恐

惧、冷水浴等； (2)病理性增多：见于严重的先天性及后天性心肺疾患和血管畸形，如法洛四联症、发绀型先天性心脏病、阻塞性肺气肿、肺源性心脏病、肺动脉或肺静脉瘘及携氧能力低的异常血红

蛋白病等；也见于某些肿瘤或肾脏疾病，如肾癌、肝细胞癌、肾胚胎瘤及肾盂积水、多囊肾

等。血红蛋白减少见于以下情况：(1)生理性减少：3个月的婴儿至15岁以前的儿童，主要因

生长发育迅速而致的造血系统造血的相对不足，一般可较正常人的低10%-20％。妊娠中期

和后期由于妊娠血容量增加而使血液被稀释，老年人于骨髓造血功能逐渐降低， 可导致红细胞和血红蛋白含量减少。 (2)病理性减少：

A.骨髓造血功能衰竭，如再生障碍性贫血、骨髓纤维化所伴发的贫血；

B.因造血物质缺乏或利用障碍所致的贫血，如缺铁性贫血、叶酸及维生素B12缺乏所的巨幼

细胞性贫血； C.因红细胞膜、酶遗传性的缺陷或外来因素所致红细胞破坏过多而导致的贫血，如遗性球形

红细胞增多症、海洋性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿、异常血红蛋白病、免疫性溶血性贫

血、心脏体外循环的大手术或某些生物性和

2．紫外光谱确认：血液不同成份的吸收光谱不一。在激光照射血液疗法中,选择最佳

波长进行研究。方法 用752C紫外可见分光光度计进行人血液不同成份吸收光谱的测试。

结果血清、血浆、血红蛋白、白蛋白、红细胞、淋巴细胞、血小板的吸收光谱各有差异,吸

收峰值位置亦不一致。 各成份在200～300 nm的紫外部分吸收率最高,在红外部份吸收率最

低,并逐渐下降。

材 料 与 方 法 一、材料

1.标本来源 ①正常人的血液。②福州市中心血站分离的血小板悬液。

2.试剂 ①260 g/L Na2SO4:无水Na2SO426 g加适量蒸馏水溶解后再加蒸馏水至100 ml。 ②Hank's液。③淋巴细胞分离液(上海荣盛生物试剂厂)。④血小板分离液(上海血液中

心)。

⑤肝素抗凝剂。

3.仪器 752C紫外可见分光光度计(上海第三分析仪器厂。光源：12V30W钨卤素灯、氘

灯。有关参数：波长精度±1 nm,波长重复性0.5 nm，吸光度精度±0.0004 nm，光度范围－0.03～0.3 nm，最小分辨率0.0001

nm)。仪器经国家法

定计量单位确认合格。

二、方法 1.分离血清,用生理盐水稀释。 2.血液加少量肝素抗凝,分离血浆,用生理盐水稀释。