质粒测序引物设计

引物设计原则及酶切位点选择和设计：最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后且不开，所以经常采用最通用的方法，用[整理]载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来T连入质粒中的重要目的酶切，所以感到还是直接扩增好一点。

但这就需要你仔细设计引物。

扩增出靶基因的时候在核就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR可以在质粒的图谱说明书上酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，找取相应的位点，进行设计。

（一）设计引物前应做的准备工作：准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）设计引物所要考虑的问题往往导致两个，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，两个位点应是载体上的，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。

只能切一个，酶都切不好。

因此，紧挨在一起，还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如promega的说明书上说，最好隔四个。

我看AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。

两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。

最好使用酶切效率高的。

的酶。

最好使用双酶切有共同buffer最好使用自己实验室有的酶，这样可，ecor1等），最好使用较常用的酶（如hind3，bamh1以省钱。

的问题，很多的战友都有疑惑。

其实园子里有很多的解释了。

的计算，关于TmTm大家可以理解，双链溶解所需的温度。

即是DNA叫溶解温度（melting temperature, Tm），Tm因此，的溶解是没有作用的。

而不互补的区域对DNA 这个温度是由互补的DNA区域决定的，（除时，只计算互补的区域Tm才有贡献。

计算Tm只有和模板互补的区域对对于引物的Tm，过低，是因为他们误把保护碱。

不少战友设计的引物都Tm 非你的酶切位点也与模板互补）反应的诸多困难。

引物设计原则及酶切位点选择和设计[整理]：最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后且不开，所以经常采用最通用的方法，用T载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来酶切，所以感到还是直接扩增好一点。

但这就需要你仔细设计引物。

连入质粒中的重要目的就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR扩增出靶基因的时候在核酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，可以在质粒的图谱说明书上找取相应的位点，进行设计。

（一）设计引物前应做的准备工作：准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）设计引物所要考虑的问题两个位点应是载体上的，，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个酶都切不好。

因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。

我看promega的说明书上说，最好隔四个。

还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。

两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。

最好使用酶切效率高的。

最好使用双酶切有共同buffer的酶。

最好使用较常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），最好使用自己实验室有的酶，这样可以省钱。

Tm的计算，关于Tm的问题，很多的战友都有疑惑。

其实园子里有很多的解释了。

Tm叫溶解温度（melting temperature, Tm），即是DNA双链溶解所需的温度。

大家可以理解，这个温度是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。

因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。

计算Tm时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。

不少战友设计的引物都Tm过低，是因为他们误把保护碱基和酶切位点都计算到Tm里了，最后的结果是导致了PCR反应的诸多困难。

引物设计原则及酶切位点选择和设计［整理］:最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后且不开，所以经常采用最通用的方法，用T载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来酶切，所以感到还是直接扩增好一点。

但这就需要你仔细设计引物。

连入质粒中的重要目的就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR扩增出靶基因的时候在核酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，可以在质粒的图谱说明书上找取相应的位点，进行设计。

（一）设计引物前应做的准备工作：准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）设计引物所要考虑的问题两个位点应是载体上的，，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个酶都切不好。

因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。

我看promega的说明书上说，最好隔四个。

还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG,这样的位点比较难切。

两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。

最好使用酶切效率高的。

最好使用双酶切有共同buffer的酶。

最好使用较常用的酶（如hind3, bamhl, ecorl等），最好使用自己实验室有的酶，这样可以省钱。

Tm的计算，关于Tm的问题，很多的战友都有疑惑。

其实园子里有很多的解释了。

Tm叫溶解温度（melting temperature, Tm），即是DNA双链溶解所需的温度。

大家可以理解，这个温度是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。

因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。

计算Tm时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。

不少战友设计的引物都Tm过低，是因为他们误把保护碱基和酶切位点都计算到Tm里了，最后的结果是导致了PCR反应的诸多困难。

构建重组质粒基本方法重组质粒是一种重要的遗传工程工具，用于将外源基因导入到宿主细胞中，从而实现特定基因的表达与功能研究。

构建重组质粒的基本方法可以概括为：选择质粒骨架、引物设计与合成、PCR扩增外源基因片段、DNA连接与重组、质粒扩增与提取、质粒鉴定与筛选，以下分别进行详细介绍。

一、选择质粒骨架在构建重组质粒时，首先需要选择一个合适的质粒骨架。

质粒骨架是指一个可复制的质粒DNA分子，常见的质粒骨架有pUC、pBR322、pET等。

质粒骨架上通常包含有宿主细胞可以识别的起始子和起始子附近的终止子，用于启动和终止转录过程，同时还包含选择标记基因，如抗生素抗性基因，以及其他在分子克隆中常用的诸如多克隆位点、限制酶切位点等。

二、引物设计与合成在构建重组质粒时，需要利用引物来扩增并克隆外源基因片段。

引物一般是两条DNA可控引物，其中一条是正向引物，另一条是反向引物。

引物的设计需要注意以下几点：引物的长度通常为15-30个碱基对，引物应该具有合适的Tm值，并且在引物双链的末端至少有2个碱基对是纯G或纯C。

引物可以使用商业引物合成公司合成。

三、PCR扩增外源基因片段使用引物扩增外源基因片段是构建重组质粒的一个关键步骤。

PCR反应一般包括DNA模板、引物、dNTPs和DNA聚合酶。

根据需要，可以使用特异性引物对目标基因进行PCR扩增，然后通过凝胶电泳检查PCR产物长度和纯度，并使用PCR产物进行下一步处理。

四、DNA连接与重组将PCR扩增得到的外源基因片段与质粒骨架进行连接和重组。

连接通常通过使用限制酶切和连接酶来实现。

限制酶切是利用限制酶切剪切DNA，生成具有互补粘性末端的DNA片段，然后将外源基因片段与质粒骨架进行连接。

连接酶可以使DNA片段之间的末端骨架参与phosphodiester结合反应，从而形成连体分子。

五、质粒扩增与提取将重组质粒转化到宿主细胞中，通过培养和培养基筛选来扩增质粒。

质粒扩增一般在含有抗生素的琼脂糖平板上进行，抗生素可以选择对宿主细胞有毒作用但不对重组质粒有毒的抗生素。

载体构建质粒构建步骤有哪些？载体构建过程：1、引物设计2、⽬的⽚段选取：RNA提取、RNA反转录、PCR扩增、PCR产物纯化3、双酶切4、连接:T4 DNA ligase连接或者同源重组连接（新贝⽣物：#B101、#B102）5、转化6、菌落PCR7、测序：1)摇菌；2)送样; 3)⽐对；8、菌种保存：菌种⽐对成功，则可保存菌种备⽤。

9、质粒提取：菌种⽐对成功，冻存菌种后，菌液⽤于提取质粒。

⼀、载体构建基本原理分、切、连、转、筛1、分：分离出要克隆的⽬的基因及载体。

2、切：⽤限制性内切酶切割⽬的基因和载体，使其产⽣便于连接的末端。

限制性内切酶：是⼀类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸⽔解酶。

限制性核酸内切酶根据识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性分为三⼤类。

其中Ⅱ型酶能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内切割，产⽣特异性DNA⽚段，是DNA 重组技术中常⽤的酶。

Ⅰ型酶：具有修饰和切割功能，⽆固定切割位点Ⅲ型酶与Ⅰ型类似，能识别特异位点，但切割位点在识别位点以外Ⅱ型酶特点：①识别顺序⼀般为4－6个碱基对②识别顺序具有180度的旋转对称性，呈完全的回⽂结构③Ⅱ型酶对双链DNA两条链同时切割，可产⽣两种不同末端：平末端，粘末端平末端：在识别顺序的对称轴上，对DNA同时切割形成平末端，如：SmaI5’－CCC GGG－3’ 5’－CCC GGG－3’3’－GGG CCC－5’ 3’－GGG CCC－5’5′突出粘末端：在识别序列的两侧末端切割DNA双链，于对称轴的5 ′末端切割产⽣5 ′端突出的粘性末端，如：Hind Ⅲ5’―AAGCTT―3’ 5’― A 5’－AGCTT―3’3’―TTCGAA―5’ 3’― TTCGA－5’ A―5’3′突出粘末端:与5′突出粘末端作⽤相反，产⽣3 ′端突出粘末端，如：PstI5’―CTGCAG―3’ 5’―CTGCA－3’ G―3’3’―GACGTC―5’ 3’―G 3’－ACGTC―5’3、连：将切割后的⽬的基因和载体⽤T4 DNA连接酶连接或者同源重组⽅法连接。

DNA（质粒和PCR产物）测序操作程序一、P CR反应体系标准反应体系（20 μL）试剂用量DNA X μL（根据模板确定）BigDye 8 μL引物 (3.2 pmol / μL) 1 μL灭菌去离子水补充到20 μL总体积20 μL优化反应体系（10 μL）试剂用量DNA X μL （根据模板确定）BigDye 2 μL引物 (3.2 pmol / μL) 1 μL灭菌去离子水补充到20 μL总体积10 μL测序PCR热循环条件：96 ︒C 1 min96 ︒C 10 se50 ︒C 5 sec x 25个循环60 ︒C 4 min4 ︒C保温二、测序产物纯化：10 μL反应体系，384孔板，酒精/EDTA/NaAc法1.每管加入1 μL 125 mM EDTA到管底，每管加入1 μL 3M NaAc到管底。

2.每管加入25 μL 100%酒精，铝箔封严密，震荡混匀4次，室温放置15 min。

3.1400-2000 x g离心45 min 或者2000-3000 x g离心30 min，马上倒置384孔板，离心至185 x g 停止离心（从离心机启动到达到185 x g停止离心总共1 min时间）。

4.每管加入35 μL 70% 酒精，1650 x g 4 ︒C离心15 min；马上倒置384孔板，离心至185 xg 停止离心（从离心机启动到达到185 x g停止离心总共1 min时间）。

5.重复第4步1次。

6.室温挥发净酒精，加入10 μL Hi-Di Formamide溶解DNA；或者铝箔密封后于4 ︒C保存。

7.溶解后的样品需要在 95 ︒C变性4 min，迅速置冰中冷却4 min后，上样电泳。

三、测序产物纯化：单离心管法请参照20 μL反应体系，96孔板，酒精/EDTA/NaAc法操作，只需要将“倒置96孔板，离心至185 x g 停止离心”这一操作改为用枪吸尽上清液。

1.每管加入2 μL 125 mM EDTA到管底，每管加入2 μL 3M NaAc到管底。

质粒测序引物设计
质粒测序是一种常用的分子生物学技术，用于分析质粒的基因组成和结构。

在质粒测序过程中，引物是至关重要的组成部分，其质量和设计直接影响到测序数据的准确性和可靠性。

因此，正确设计合适的引物至关重要。

设计引物的首要步骤是选择目标序列。

质粒测序通常需要分析全长或部分序列，因此需要确定目标序列的起止位置。

在选择目标序列时，还需要考虑序列的特点，如长度、GC含量和反向互补性等。

这些因素将影响引物的长度和特异性。

设计引物时，需要遵循一些基本原则。

首先，引物的长度应该在18-25个碱基对之间，以保证特异性和特异性。

其次，引物的GC含量应该在40-60%之间，以确保引物与目标序列的结合。

此外，还需要确保引物的特异性，以避免与其他序列的杂交信号。

引物设计时还需要考虑引物间的距离和方向。

引物之间的距离应该足够远，以避免重叠或杂交。

另外，正向和反向引物之间的距离应该相等，以确保扩增产物的长度均匀。

总之，正确设计引物对质粒测序的结果至关重要。

根据目标序列的特点，采用合适的引物设计策略和软件，可以设计出高质量的引物，从而获得更加准确和可靠的测序数据。

- 1 -。

一、引物设计:1,选择合适的载体。

酶切位点及其顺序（酶切位点的顺序一定不能颠倒）。

2，在NCBI上再次确认目的片段的碱基序列，进行primer blast，确定其特异性。

1，使用primer5排除目的片段里含有的酶切位点，或利用其本身含有的酶切位点，最后确定所使用的酶。

2，设计引物：primer-up：Primer-down：3，核对----送公司合成。

4，对公司合成的引物离心，10000rpm、5-10分钟、at 4℃，在超净台按照管子上标注的体积加入1*TE，为100uM，再用ddH2O稀释成10uM，-30℃保存。

二、PCR（）：（一）、引物Tm值titrate：pcr（15ul小体系）Sence：0.3ul 一般titrate5个温度值，并设一Anti sence：0.3ul 个NC（不加template）DNTP：0.3ul cDNA一般为Hela或293T Taq：0.1ul10*buffer： 1.5ulTemplate（cDNA）：1ulH2O：11.5ul（二）、pcr（50ul大体系）Sence：1ul Tm温度用titrate时得到的条带Anti sence：1ul 最亮的温度DNTP：1ulTaq：0.5ul 10*buffer：5ul Template（cDNA）：2ul H2O：39.5ul三、跑胶，胶回收:称1.2g的琼脂糖加入100ml的plasmid越小胶浓度越大）胶凝固后，即可点样跑胶。

2、跑胶：120V、40min。

3、泡EB溶液20min后，紫外灯下观察，切胶（要带防护手套和口罩）4、做胶回收:（1）加入400ul溶胶液，55℃溶胶；（2）待胶全溶后，过胶回收柱，12000rpm，1min；（3）DNA Wash Buffer 500ul，12000rpm，1min，twice；（4）开盖离心，15min；（5）换新的1.5ml EP管，加Elution Buffer 30ul，12000rpm，1min，重复吸取，12000rpm，1min；（Elution Buffer使用前65℃温热）（6）测浓度四、连接：2x Buffer 5ul10ul的体系T Vector 0.5ul 16℃水浴过夜Insert 4ulLignase 0.5ul若insert浓度较大，应加的量小于4ul，则其余部分用水补齐。