DNA在纳米金修饰聚2,6-吡啶二甲酸膜电极上的固定杂交及与3-氨基酚嘿嗪的相互作用

基于纳米金胶和磁性纳米颗粒的DNA和凝血酶蛋白质电化学检测的研究【摘要】：基因诊断已经成为分子生物学和生物医学研究中的重要领域。

人体、病毒和细菌核酸中特定碱基序列的检测在疾病诊断、食品污染、法医鉴定和环境监测等领域都将会发挥越来越重要的作用。

大规模的基因检测要求建立更简便、迅速、廉价、微型化的分析装置。

许多新的生物技术的开发，为发展高灵敏度、高特异性的基因分析检测方法注入了活力，其中利用DNA双链的碱基互补配对原则发展起来的各种DNA生物传感技术，受到生物分析工作者的高度重视。

电化学DNA检测方法以其灵敏度高、轻巧便宜、携带方便、耗能少、能与现代微电子技术联用，易于实现微型化等优点，受到了研究者们的广泛关注，俨然成为当今生物学、医学领域的前沿性课题。

随着人类基因组计划(HGP)的顺利完成，生命科学从确定核酸(DNA、RNA)序列层次深入到功能基因组研究和蛋白质组学研究上来。

如何构建高速度、高通量、集约化、有特异性的高灵敏蛋白质检测技术是目前蛋白质组学研究所面临的紧迫任务。

传统蛋白质的检测主要利用抗体一抗原的特异相互作用。

利用寡核苷酸间的严格的识别和亲和力而设计的人工合成寡核苷酸—适体(aptamer)的出现，使抗体抗原反应发生新的革命性变化，弥补了现有抗体的不足。

也为传统免疫传感器发展开辟了一条新的道路。

核酸适体对蛋白质的结合力和特异性可与抗原抗体间的作用力相媲美，且与抗体相比有许多优越性。

因此利用核酸适体构建蛋白质的电化学检测方法已引起许多科学工作者的关注。

蛋白质和核酸是组成生命的主要生物大分子，核酸具有传递遗传信息等功能，而蛋白质则贯穿所有的生命活动过程。

有关核酸与蛋白质之间的相互作用的信息的获得，将有助于对一些生命过程的的研究，进而掌握生命活动和信息传递规律并实施调节及调控。

纳米技术的出现为纳米材料在分析化学领域的发展和应用开辟了新的方向。

纳米材料的优异性能例如比表面积大、反应活性高等为分析化学开辟了新的研究途径，纳米粒子的独特性能为生物检测奠定了基础，其和核酸适体的高度特异性，电化学方法的高灵敏性相结合，使得检测的灵敏度大大提高，使其应用范围更加广阔，将为生物分析化学开辟新的领域。

Vol.34高等学校化学学报No.72013年7月 CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES 1617~1622 doi:10.7503/cjcu20121051吡啶二羧酸根敏化LaF 3∶Tb 发光纳米粒子的制备及对DNA 的测定于永丽,王丽美,徐淑坤,张秀娟(东北大学理学院,沈阳110819)摘要　采用水热法合成了水溶性良好的吡啶二羧酸根(DPA)敏化LaF 3∶Tb(DPA⁃LaF 3∶Tb)纳米粒子,该粒子的发光强度大且光学性能稳定.X 射线衍射分析表明,合成了单一相六方晶系的LaF 3晶体;透射电子显微镜结果表明,所合成粒子分散性良好,粒径约为15nm.测得合成粒子在水相中的发光寿命为2.95ms.以DPA⁃LaF 3∶Tb 纳米粒子为发光探针,基于DNA 对纳米粒子的发光猝灭,实现了对DNA 的定量测定,该方法的线性范围为0.083~13.0μg /mL;检出限为0.02μg /mL;并研究了共存物质对DNA 测定的干扰.关键词　发光;稀土纳米粒子;吡啶二羧酸;DNA;LaF 3∶Tb 中图分类号　O657.3;O614.3 文献标志码　A 收稿日期:2012⁃11⁃17.基金项目:国家自然科学基金(批准号:20875011)资助.联系人简介:于永丽,女,博士,副教授,主要从事纳米分析化学研究.E⁃mail:yongli6565@ 稀土元素具有特殊的电子层结构,使稀土发光纳米材料具有发射谱线窄㊁Stokes 位移大㊁发光寿命长㊁光学性能稳定及在可见光区域有很强的发光能力等优异的光学性能[1].作为一种新兴的生物标记材料,稀土发光纳米材料克服了有机染料光化学稳定性差㊁易发生光漂白以及进行生物分析时背景噪声较高的缺点[2].与量子点相比,其生物毒性小,没有光闪烁现象[3].因此,稀土发光纳米材料在荧光免疫分析[4,5]㊁荧光共振能量转移[6]㊁细胞成像[7]和生物分子标记[8]等方面具有非常大的应用潜力.目前,稀土发光纳米粒子的合成方法主要有水热法[9]㊁沉淀法[10]和微乳液法[11]等.其中,水热法合成的纳米粒子具有纯度高㊁晶型好㊁缺陷少㊁物相均匀㊁分散性好以及形状和尺寸可控等优点,因而得到广泛应用.在稀土材料中,氟化物基质具有声子能量低和热稳定性高等优点[12],常用的氟化物基质有NaYF 4和LaF 3等.Tb 3+是应用最为广泛的稀土发光离子之一,其吸收和发射光谱源自内层的4f 电子跃迁,由于吸收系数小,所以发光强度很弱.为提高粒子的发光强度,制备Tb 3+掺杂发光纳米粒子时通常同时掺杂Ce 3+作为敏化剂,大量文献报道了LaF 3∶Ce,Tb 纳米粒子的制备及光学性能[13~15].许多有机配体可以和稀土离子(如Tb 3+和Eu 3+)反应生成水溶性配合物,当受到紫外光激发时,配合物分子中发生配体向稀土离子的能量传递,因此配合物发射出较强的稀土离子的特征荧光[16,17].利用稀土离子的这一特点,Charbonnière 等[18]用6⁃羧基⁃5′⁃甲基⁃2,2′⁃联吡啶(bipyCOO -)与La 0.95Eu 0.05F 3纳米粒子表面的氨乙基磷酸根发生部分配体交换,制备了bipyCOO -敏化La 0.95Eu 0.05F 3纳米粒子,大大增强了La 0.95Eu 0.05F 3纳米粒子的发光强度;Cross 等[19]用吡啶二羧酸根取代LaF 3∶Eu 纳米粒子表面的柠檬酸根配体,显著地敏化了纳米粒子中Eu 3+的发光.本文首先制备了柠檬酸根修饰的LaF 3∶Tb 纳米粒子,然后用吡啶二羧酸根(DPA)取代LaF 3∶Tb纳米粒子表面少量的柠檬酸根配体,合成了DPA 敏化的LaF 3∶Tb(DPA⁃LaF 3∶Tb)发光纳米粒子.与LaF 3∶Ce,Tb 纳米粒子相比,DPA⁃LaF 3∶Tb 的发光强度增大,且最大激发波长由254nm 红移至272nm.合成粒子的发光强度增大说明粒子的光学性能更好;激发波长红移,激发光能量降低,可减小以稀土纳米粒子作为标记物用于生物分析时激发光对生物样品造成的可能损伤,对纳米粒子的应用十分有利[20].在合成DPA⁃LaF 3∶Tb 纳米粒子的基础上,研究了DPA⁃LaF 3∶Tb 粒子和鲱鱼精DNA 的反应行为.实验结果表明,DNA 对DPA⁃LaF 3∶Tb 纳米粒子的发光产生猝灭,当DNA 浓度在一定范围时,粒子的发光强度与DNA 的浓度之间符合修正的Stern⁃Volmer 方程,据此建立了DPA⁃LaF 3∶Tb 纳米发光探针测定DNA 的新方法,为稀土发光纳米材料的制备及应用开辟了新的思路.1　实验部分1.1　试剂与仪器La 2O 3和Tb 4O 7(北京有研稀土新材料股份有限公司);Ce(NO 3)3㊃6H 2O㊁柠檬酸钠㊁NH 4F 和浓氨水均为分析纯;三羟甲基氨基甲烷(Tris,纯度99.9%)(上海国药集团化学试剂有限公司);2,6⁃吡啶二羧酸(纯度99%,阿拉丁试剂公司);鲱鱼精DNA(美国Sigma 公司).实验用水为三次蒸馏水.Cary Eclipse 荧光分光光度计(美国瓦里安公司);UV⁃2100型双光束紫外⁃可见分光光度计(北京瑞丽分析仪器有限公司);Spectrum one 傅里叶变换红外光谱仪(美国PE 公司);Tecnai G 220型透射电子显微镜(美国FEI 公司);Rigaku /Dmax⁃r B 型X 射线衍射仪(荷兰PANalytical 公司);TGA /DSC 1型同步热分析仪(瑞士Mettler⁃toledo 公司).1.2　实验方法1.2.1　DPA⁃LaF 3∶Tb 纳米粒子的制备　将一定体积0.10mol /L 柠檬酸钠溶液置于锥形瓶中,在磁力搅拌下滴加一定体积浓度均为0.10mol /L 的La(NO 3)3/Tb(NO 3)3混合溶液(体积比9∶1),再滴加一定体积1.00mol /L 的NH 4F 溶液[n (柠檬酸钠)∶n (稀土总量)∶n (氟化氨)=3∶5∶20].用浓氨水调节溶液的pH 值为7.0,将其转移至硝化罐中,置于烘箱中在120℃下加热4h.反应结束后,自然冷却至室温,即制得澄清透明的柠檬酸根修饰的LaF 3∶Tb 纳米粒子(以下简称LaF 3∶Tb 纳米粒子)溶液.移取一定体积上述LaF 3∶Tb 纳米粒子溶液于锥形瓶中,向其中加入一定体积0.020mol /L DPA 溶液(二者摩尔比为2.5∶1),调节溶液pH 值为4.0.将混合溶液置于振荡器中振荡反应5min,制得DPA⁃LaF 3∶Tb 纳米粒子溶液.向溶液中加入乙醇使粒子沉淀析出并离心分离,将沉淀分散在水中,得到纯化的DPA⁃LaF 3∶Tb 纳米粒子溶液,溶液外观呈透明状.1.2.2　基于DPA⁃LaF 3∶Tb 纳米粒子的发光猝灭测定DNA　向8个比色管中分别加入1000μL 浓度为4.2×10-3mol /L 的DPA⁃LaF 3∶Tb 粒子溶液和800μL 浓度为1.50mol /L 的NaCl 溶液,再分别加入不同体积(5~780μL)浓度为100μg /mL 的DNA 标准溶液,最后用pH =8.0的Tris⁃盐酸缓冲溶液定容至6.00mL,摇匀,放置15min.在546nm 处测定以上溶液的发光强度I ,以lg I 对DNA 的浓度c 作图绘制标准曲线.2　结果与讨论2.1　DPA⁃LaF 3∶Tb 纳米粒子的制备及表征图1示出了所合成的DPA⁃LaF 3∶Tb 纳米粒子粉体的X 射线衍射谱图.与LaF 3的XRD标准谱图Fig.1　XRD pattern of as⁃prepared particles (JCPDF 卡号:01⁃074⁃1324)相比,合成样品衍射峰的位置及强度与标准谱图相吻合,且无杂峰出现,表明实验合成了单一相LaF 3晶体,该晶体属于六方晶系.图1中在2θ角为25.0°,27.6°,44.0°,50.8°和52.8°处出现较强的衍射峰,可分别指认为LaF 3的(110),(111),(300),(302)和(221)晶面衍射峰.根据图中衍射峰的数据,采用Scherrer 方程计算得到合成的DPA⁃LaF 3∶Tb 粒子的平均晶粒度为14nm.图2是合成的DPA⁃LaF 3∶Tb 纳米粒子的TEM 照片.可见,粒子形貌为类球形,分散性较好,粒度较均匀,粒径约为15nm,与XRD 测试计算所得的晶粒度相吻合.考察了DPA⁃LaF 3∶Tb 粒子的发光性能,图38161高等学校化学学报 Vol.34　Fig.2　TEM image of DPA⁃LaF 3∶Tbnanoparticles Fig.3　Excitation (a )and emission (b )spectra of DPA⁃LaF 3∶Tb colloidal solution and UVabsorption spectrum of DPA solution (c )谱线a 和b 分别是DPA⁃LaF 3∶Tb 胶体溶液的激发和发射谱图.为研究DPA⁃LaF 3∶Tb 粒子的发光机理,扫描了DPA 的紫外吸收光谱(图3谱线c ).可见,DPA⁃LaF 3∶Tb 粒子的激发波长和DPA 的紫外吸收峰波长完全相同,最大激发波长为272nm.这说明DPA⁃LaF 3∶Tb 粒子的激发是由于DPA 对紫外光的吸收产生,同时也证明在LaF 3∶Tb 粒子表面结合了DPA.从谱线b 可以看出,DPA⁃LaF 3∶Tb 粒子分别在490,546,586和622nm 处出现了4个发射峰,这是Tb 3+的特征发射峰,分别归属于Tb 3+离子电子的5D 4⁃7F 6,5D 4⁃7F 5,5D 4⁃7F 4和5D 4⁃7F 3跃迁.DPA 中含有氮原子和羧基氧原子,是一类多功能有机配体,可与稀土离子发生键合作用[19,21],本实验中DPA 与LaF 3∶Tb 粒子表面的稀土离子结合,从而修饰在粒子表面.在DPA⁃LaF 3∶Tb 纳米粒子中,DPA 接受紫外光的能量,产生了Tb 3+的特征发射.即在DPA⁃LaF 3∶Tb 纳米粒子中,发生了DPA 向Tb 3+的能量传递,从而产生了Tb 3+的发光光谱.已有文献报道,以Tb 3+为激活剂合成LaF 3发光材料时,大多掺杂Ce 3+作为敏化剂[13~15].本实验对合成LaF 3∶Ce,Tb 纳米粒子的实验条件进行了优化,在最优条件下制备了LaF 3∶Ce,Tb 纳米粒子.另外,分别合成了LaF 3∶Tb,DPA⁃LaF 3∶Tb 和DPA⁃LaF 3∶Ce,Tb 纳米粒子,合成时4种纳米粒子中Tb 3+的掺杂量相同(Tb 3+和稀土离子总量的摩尔比为1∶10),以上4种胶体溶液的发光光谱如图4所示.Fig.4　Excitation (A )and emission (B )spectra of DPA⁃LaF 3∶Tb (a ),LaF 3∶Ce ,Tb (b ),DPA⁃LaF 3∶Ce ,Tb (c )and LaF 3∶Tb (d )colloidal solutions由图4(A)可见,DPA⁃LaF 3∶Tb 纳米粒子的最大激发波长为272nm,与另外两种纳米粒子的最大激发波长254nm 相比,发生了明显的红移,表明激发光能量有所降低,当将该粒子作为标记物用于生物分析时,可以减小激发光对生物样品造成的可能损伤.图4(B)为DPA⁃LaF 3∶Tb(272nm 激发)㊁LaF 3∶Ce,Tb(254nm 激发)和DPA⁃LaF 3∶Ce,Tb(254nm 激发)的发射谱图.可见,DPA⁃LaF 3∶Tb 纳米粒子的最大发光强度分别是LaF 3∶Ce,Tb 和DPA⁃LaF 3∶Ce,Tb 纳米粒子的1.65倍和1.85倍,表明DPA⁃LaF 3∶Tb 纳米粒子的发光性能最好.由于LaF 3∶Tb 粒子的激发和发射均来自Tb 3+电子的f ⁃f 跃迁,发光强度很弱,其激发和发射谱图见图4中谱线d 所示.在图4(A)中,LaF 3∶Ce,Tb 纳米粒子的激发峰位于254nm,该激发峰是由于Ce 3+离子的外层电子9161　No.7　于永丽等:吡啶二羧酸根敏化LaF 3∶Tb 发光纳米粒子的制备及对DNA 的测定发生从4f 向5d 能级的跃迁所致.Ce 3+离子吸收紫外光后,将能量传递给Tb 3+离子,从而产生Tb 3+离子的发射光谱[22].DPA⁃LaF 3∶Ce,Tb 纳米粒子有2个激发峰,来自于Ce 3+和DPA 对紫外光的吸收,分别位于254和272nm.由图4(B)可见,DPA⁃LaF 3∶Tb 粒子的发光强度比LaF 3∶Ce,Tb 粒子的大,说明DPA 作为敏化剂比Ce 3+更有效;DPA⁃LaF 3∶Tb 粒子的发光强度比DPA⁃LaF 3∶Ce,Tb 粒子的大,这可能是因为在DPA⁃LaF 3∶Ce,Tb 粒子中有部分DPA 与Ce 3+结合,减弱了DPA 向Tb 3+的能量传递所致.DPA 作为敏化剂,在合成DPA⁃LaF 3∶Tb 纳米粒子时其加入量会影响合成粒子的发光强度,DPA 加入量对合成粒子发光强度的影响见图5.可见,随着LaF 3∶Tb 粒子和DPA 摩尔比的减小(实验中固定LaF 3∶Tb 粒子的加入量,逐渐增加DPA 用量),产物的发光强度增大,这是因为DPA 和柠檬酸根竞争占据LaF 3∶Tb 粒子表面,增大DPA 的浓度对其与粒子的结合有利.当LaF 3∶Tb 粒子与DPA 摩尔比小于2.5后,产物的发光强度基本不变.因此,实验选择LaF 3∶Tb 粒子和DPA 的最佳摩尔比为2. 5.Fig.5　Effect of the amount of DPA on the lumines⁃cent intensity of DPA⁃LaF 3∶Tb nanoparticles Fig.6　FTIR spectra of DPA⁃LaF 3∶Tb (a )andLaF 3∶Tb (b )powderDPA⁃LaF 3∶Tb 和LaF 3∶Tb 纳米粒子的红外谱图如图6所示.由图6谱线b 可见,在3438cm -1处有一宽而强的吸收峰,为缔合的O H 伸缩振动的吸收带,来自样品中未烘干的水分子;1610和1385cm -1处的谱峰分别为 COO -的对称和反对称伸缩振动峰,说明在LaF 3∶Tb 纳米粒子表面包覆了柠檬酸根.采用差热热重分析测得LaF 3∶Tb 粒子表面柠檬酸根的质量分数为10%.图6谱线a 和b 的吸收峰位置完全相同,说明DPA⁃LaF 3∶Tb 粉体表面主要是柠檬酸根包覆,只有少量DPA 存在,所以图6谱线b 中未出现DPA 的红外吸收峰.实验中合成DPA⁃LaF 3∶Tb 粒子时加入的DPA 和LaF 3∶Tb 的摩尔比为2.5∶1,DPA⁃LaF 3∶Tb 粉体的红外谱图中未出现DPA 的红外吸收峰,说明合成时加入的DPA 大部分存在于溶液中.只有当反应溶液中DPA 的浓度达到一定数值时,DPA 才能替换已经包覆在稀土粒子表面的柠檬酸根,结合在粒子的表面.为用于生物分析,合成粒子必须具有良好的水溶性.实验制备的DPA⁃LaF 3∶Tb 纳米粒子水溶性良好,粒子溶液外观呈透明状.测得合成粒子胶体溶液的发光寿命为2.95ms,远大于生物分子和量子点的荧光寿命,可用于进行时间分辨荧光分析[7].2.2　基于DPA⁃LaF 3∶Tb 纳米粒子的发光猝灭测定DNAFig.7　Emission spectra of DPA⁃LaF 3∶Tb (a )andDPA⁃LaF 3∶Tb+DNA (b )制备的DPA⁃LaF 3∶Tb 粒子具有良好的水溶性且表面修饰了有机配体,因此可将其直接用于生物分析.向DPA⁃LaF 3∶Tb 溶液体系中加入DNA 前后胶体溶液的发射光谱图如图7中谱线a 和b 所示.可见,加入DNA 对发射峰的位置没有影响,但对纳米粒子的发光强度有明显的猝灭.为探讨DNA 猝灭DPA⁃LaF 3∶Tb 纳米粒子发光的原因,考察了DNA 加入量对DPA 溶液吸收光谱的影响.结果表明,随着DNA 浓度的增大,DPA 在272nm 的吸光度降低,发生减色效应,表明DPA 与DNA 发生了嵌入作用[23,24].由于嵌入的DPA 分子中吡啶环的π*空轨道与碱基的π轨道发生偶0261高等学校化学学报 Vol.34　合,偶合后的π*轨道因部分填充电子,使π→π*跃迁几率减小,从而产生减色效应.由于DPA⁃LaF 3∶Tb 纳米粒子发光的能量来自于DPA,当DPA 和DNA 发生嵌入作用,进而脱离LaF 3∶Tb 纳米粒子表面,必然导致DPA⁃LaF 3∶Tb 纳米粒子的发光猝灭.向一系列DPA⁃LaF 3∶Tb 纳米粒子溶液中加入不同量的DNA,DNA 对粒子发光强度的猝灭符合修正的Stern⁃Volmer 方程[25]:lg(I 0/I )=1+K sv [Q],式中,I 0和I 分别为加入猝灭剂前后粒子的发光强度,[Q]为猝灭剂DNA 的浓度,K sv 为Stern⁃Volmer 猝灭常数.以lg I 对DNA 的浓度作图得到测定DNA 的标准曲线(n =8).标准曲线的线性回归方程为lg I =2.93-0.0161c ,线性相关系数R =0.9975,线性范围为0.083~13.0μg /mL.对于不加DNA 的空白体系平行测定11次,计算得到方法的检出限为0.02μg /mL(3σ).对浓度为5.00μg /mL 的DNA 溶液平行测定11次,相对标准偏差为0.11%.综上可知,该分析方法的线性范围较宽,检测的灵敏度较高.为考察所建立分析方法的选择性,测定了一些常见物质对体系发光强度的影响,结果列于表1.可见,当这些物质浓度小于实验浓度时,其干扰程度小于±5%,说明此时对DNA 的测定没有干扰.Table 1　Effects of coexistance substances on the determination of DNA *Coexistance substanceConcentration /(mol㊃L -1)Relative error(%)Coexistance substance Concentration /(μg㊃L -1)Relative error(%)Ni 2+1×10-7-4.7Adenine,guanine 0.1 1.6,-1.6Cd 2+4×10-7 2.5Urea 0.5 1.0Cu 2+1×10-6-2.4BSA,histidine 8-2.8,-4.7Fe 3+,Zn 2+2×10-6 4.8,-3.2Glycine 20-1.7Ca 2+,H 2PO -41×10-5 4.3,-3.1Glutamate,lysine 40-3.6,-1.9Mg 2+2×10-4-3.3Glucose 1000 1.4K +,NO -35×10-3 4.7,4.7HCO -33×10-24.7 *The concentration of DPA⁃LaF 3∶Tb nanoparticles is 7.0×10-4mol /L;the concentration of DNA is 8.00μg /mL.为验证本方法的实用性,配制了合成样品进行测定.合成样品含有DNA(4.00μg /mL)㊁BSA(2.0μg /mL)㊁赖氨酸(2.0μg /mL)㊁谷氨酸(2.0μg /mL)㊁腺嘌呤(0.02μg /mL)㊁鸟嘌呤(0.02μg /mL)㊁葡萄糖(5.0×10-5mol /L)㊁KNO 3(5.0×10-5mol /L)㊁MgCl 2(2.0×10-6mol /L)㊁CaCl 2(5.0×10-7mol /L)㊁尿素(5.0×10-8mol /L)㊁FeCl 3(3.0×10-8mol /L)和ZnCl 2(2.0×10-8mol /L).以DPA⁃LaF 3∶Tb 纳米粒子为发光探针测定合成样品中DNA 含量,5次测定结果的平均值为3.97μg /mL,相对标准偏差为2.8%.低标和高标回收率分别为104%和95.6%,说明本法较为准确可靠.3　结 论采用水热法合成了水溶性良好的DPA⁃LaF 3∶Tb 发光纳米粒子.与LaF 3∶Ce,Tb 粒子相比,DPA⁃LaF 3∶Tb 粒子的发光强度增大,激发波长明显红移.采用XRD,TEM 和FTIR 对合成粒子进行了表征,结果表明合成了单一相六方晶系的LaF 3,粒子的分散性良好,粒径约为15nm.以DPA⁃LaF 3∶Tb 纳米粒子为发光探针,基于DNA 对纳米粒子的发光猝灭,实现了对DNA 的定量测定.本实验合成稀土纳米粒子的反应原料价廉易得,反应条件温和,实验方法简单快速.制备的DPA⁃LaF 3∶Tb 纳米粒子具有良好的光学性能和生物相容性,在生物大分子的分析中具有良好的应用前景.在后续的研究中,将尝试采用激发波长在近紫外或可见光区的有机配体对合成的稀土粒子进行敏化,得到对近紫外或可见光响应的纳米粒子,并将其用于细胞成像和生物分析研究.参　考　文　献[1]　Zhang C.,Sun L.,Zhang Y.W.,Yan C.H.,J.Rare Earths ,2010,28,807 819[2]　Lin Z.B.,Su X.G.,Zhang J.H.,Jin Q.H.,Chin.J.Anal.Chem .,2002,30(2),237 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microscopy(TEM)image showed a good dispersion of DPA⁃LaF3∶Tb nanoparticles with nearly uniform size of about15nm.The lifetime of the particles in water was measured2.95ms.It was found that DNA could quench effectively the luminescence of the particles.Based on the luminescence quench,the de⁃termination of DNA was realized with the linear range of0.083~13.0μg/mL and the detection limit of0.02μg/mL.Moreover,the interference of coexistence substances to the determination of DNA was studied. Keywords　Luminescence;Lanthanide nanoparticles;Dipicolinate;DNA;LaF3∶Tb(Ed.:N,K) 2261高等学校化学学报 Vol.34　。

2006年第64卷化 学 学 报V ol. 64, 2006 第8期, 806～810ACTA CHIMICA SINICANo. 8, 806～810* E-mail: hujingbo@ Received July 1, 2005; revised October 24, 2005; accepted December 26, 2005.国家自然科学基金(No. 20275007)资助项目.·研究论文·柔红霉素修饰的纳米金电极的制备及其对DNA 检测郑 华 胡劲波* 李启隆(北京师范大学化学系 北京 100875)摘要 利用双硫醇分子作为连接剂, 将纳米金颗粒固定于金电极上, 用伏安法、紫外-可见光谱和电化学交流阻抗对其组装过程以及活性进行了表征. 制备的纳米金修饰电极用于DNA 测定及其对DNA 损伤的检测. DNA 的检测限为 1.2×10－9 mol/L. 该法灵敏、简便. 关键词 纳米金; 柔红霉素; DNAPreparation of Daunomycin Modified Nano Gold Electrode andIts Application to Detection of DNAZHENG, Hua HU, Jing-Bo * LI, Qi-Long(Department of Chemistry , Beijing Normal University , Beijing 100875)Abstract The modification of gold electrode with gold nanoparticles by chemical adsorption of1,6-hexanedithiol was achieved. The preparation process and activity of this interface were characterized with voltammetry, UV-Vis spectroscopy and electrochemical impedance spectroscopy. The modified elec-trode was used to detect DNA and the damage of DNA, with the detection limit of DNA to be 1.2×10－9 mol/L. This method is sensitive and convenient. Keywords gold nanoparticle; daunomycin; DNA脱氧核糖核酸(DNA)是遗传信息的承担者, DNA 分子中碱基序列的变异与人类许多遗传疾病有关. 因此, 对特定序列的DNA 的分析以及对DNA 链中碱基突变的检测在基因筛选、遗传疾病的早期诊断和治疗方面具有十分深远的意义[1]. DNA 生物传感器是进行核酸的结构分析和检测的重要手段, 在众多的杂交检测方法中, 放射性同位素标记法存在着放射性污染等弊端, 而非放射性标记法如荧光[2]、化学发光[3]和生物素[4]标记方法的检测仪器昂贵, 难以实现自动化, 而且标记过程烦琐复杂. 电化学分析技术具有仪器简单、价格低廉、测定快速准确和方法灵敏度高等特点.目前, 人们已经将金属纳米颗粒, 尤其是纳米金颗粒(GN)应用到生物体系的分析检测中来. Natan 实验室对纳米颗粒的金溶胶进行了系统的研究, 通过MPTMS(3-mercaptopropyl-trimethoxysilane), MEA (2-mercaptoe- thylamine)等实现了纳米金溶胶在金、玻璃等表面上的二维自组装[5,6], 并通过拉曼增强效应[7]、SPR [8]等手段研究了金颗粒与生物体系的相互作用. 鉴于金颗粒的量子化效应及与生物体系特别是DNA 的特殊的相互作用, 其在DNA 免疫传感器以至DNA 芯片的制作方面都有广阔的应用前景.Gao 和Wang [9]用X 射线衍射法, Stefania 等[10]用1H NMR 和31P NMR 等手段, 方禹之等[11]用电化学和光化学法研究了柔红霉素(DNR)与DNA 的作用. 方禹之等的实验表明, DNR 与单链DNA 作用时, 最先作用的位点为CpG, 而与双链DNA 作用时, DNR 最先嵌入(CpG)2碱基对之间. 本文利用双硫醇分子作为连接剂, 将纳米金颗粒固定于金电极上, 再连接L -半胱氨酸. 然后利用No. 8郑 华等：柔红霉素修饰的纳米金电极的制备及其对DNA 检测807L -半胱氨酸的羧基将抗癌药物DNR 修饰到电极上, 再让DNA 与柔红霉素相互作用, 利用DNR 的电化学信号, 实现对DNA 的检测. 此法无须对DNA 进行标记, 比较简单、方便.1 实验部分1.1 仪器和试剂CHI660型电化学分析仪(CHI Inc., USA); 三电极体系: 工作电极为金电极, 对电极为Pt 丝电极, 参比电极为饱和银/氯化银电极(Ag/AgCl). 实验中所用到的四氯金酸(HAuCl 4•3H 2O), 1,6-hexanedithiol [HS(CH 2)6SH, 本文简称为HET]购自百灵威公司; L -半胱氨酸(L -cys)、柠檬酸三钠购自北京化学试剂公司(分析纯); 柔红霉素(DNR)购自深圳万乐药业有限公司; 鱼精子DNA 购自Sigma 公司. 以4.4 mmol/L pH 7.02的磷酸缓冲溶液(K 2HPO 4-KH 2PO 4 简称PBS)为支持电解质. 实验所用水均为三次蒸馏水, 所用药品均为分析纯. 实验前通纯氮气除氧. 1.2 样品的制备金溶胶的制备参考Frens [12]法: 将100 mL 1.0×10－3 mol•L －1的四氯金酸溶液加热至沸, 向沸液中一次性地加入9.34 mL 37.8 mmol•L －1 (1%)柠檬酸三钠溶液, 保持沸腾15 min, 自然冷却. TEM 照片显示其平均粒径为14 nm.纳米金修饰电极的制备: 预处理好的金电极, 把其泡在HET 溶液中, 放置过夜. 再把修饰有HET 的金电极浸在纳米金溶胶里, 放置4 h 左右. 这样, 纳米金颗粒可以牢固地吸附在电极表面上. 再把此电极浸在L -半胱氨酸溶液中, 则L -半胱氨酸吸附在纳米金上. 然后把修饰有L -半胱氨酸的电极浸在柔红霉素的溶液中, 通过羧基与氨基的缩合反应, 把柔红霉素化学吸附在电极上. 再滴加DNA 的溶液于柔红霉素上. 检测柔红霉素的电化学信号, 以测定DNA. 具体修饰过程见图1.2 结果与讨论2.1 纳米金吸附在电极表面图2是纳米金修饰电极在1 mmol/L K 3Fe(CN)6和0.1 mol/L KCl 支持电解质溶液中的循环伏安图. 从图中可以看到, 电极表面吸附了HET 后, 阻碍了K 3Fe(CN)6在电极表面的氧化还原. 比较图2中的曲线b 和c, 可看到纳米金吸附在电极上后, K 3Fe(CN)6氧化还原峰的峰高显著地增大, 且峰的对称性增强. 因为纳米金本身的一些特殊性质, 如具有大的比表面、尺寸量子效应和化学反应活性, 所以, 它可以促进K 3Fe(CN)6在电极上的氧化还原.2.2 柔红霉素在纳米金电极上的电化学行为图3是1.05×10－5 mol/L 的柔红霉素吸附在纳米金电极上的循环伏安图. 在－0.623 V 处出现一个良好的还原峰. 同前期工作中把柔红霉素吸附在自组装膜修饰金电极上相比, 峰电流增加了近10倍. 实验测得纳米金修饰电极上柔红霉素的吸附量为7.71×10－9 mol/cm 2, 比在自组装膜修饰电极上的吸附量(6.07×10－10 mol/cm 2)也增加10倍左右. 说明纳米金修饰在电极上增加了电极表面积(裸金电极的有效面积是0.0446 cm 2, 纳米金修饰电极的有效面积是0.0741 cm 2), 提高了柔红霉素的吸附量.2.3 柔红霉素电极反应参数 n , α和k s 的测定对于不可逆波, 其E P 与扫速v 的关系式[13]为: E P ＝E º＋RT /αnF ln k s －RT /αnF ln v式中E P (V)为峰电位, E ° (V)为电极反应的表观电位, k s (s －1)为电极反应速率常数, α电子转移系数, n 为反应电子数, F (C/mol)为法拉第常数, R (J•mol －1•K －1)为气体常数, T (K)为绝对温度, v (mV/s)为扫描速度. 作ln v ～E P 关系图(如图4), 在一定范围内呈直线关系. 斜率为RT /αnF ＝0.028, 截距为－0.480. 由v ～E P 关系曲线, 外推可得E °＝－0.563 V. 代入上式, 得电极表面吸附反应速率常数k s ＝0.052 s －1. 由斜率求得αn ＝0.92, 因为 0＜α＜0.5, 所以得n ＝2, α＝0.46.图1 电极修饰过程Figure 1 Process of electrode modification808化 学 学 报 V ol. 64, 2006图2 裸金电极、双硫醇修饰电极和纳米金修饰电极在铁氰化钾中的循环伏安图Figure 2 CVs of HET/AuE (a), bare AuE (b) and NG/HET/AuE (c) in 1 mmol/L K 3Fe(CN)6 and 0.1 mol/L KCl solutionscan rate: 100 mV/s图3 柔红霉素修饰电极在磷酸缓冲溶液中的循环伏安图 Figure 3 CVs of the DNR/L -cys/NG/HET/AuE in 1.0×10－5 mol/L DNR and 4.4 mmol/L phosphate buffer solution (pH 7.02)scan rate: 100 mV/s图4 ln v -E p 图Figure 4 Plot of the ln v vs. E p2.4 吸附量和吸附等温式测量吸附伏安峰所覆盖的面积求出DNR 在电极上还原所需的电量Q , 利用公式Г＝Q /(nFA ), 测量DNR 在单位面积上的吸附量. A 为电极面积(纳米金修饰电极的有效面积), F (96478 C/mol)为法拉第常数, n 为电子转移数. 吸附量随着DNR 浓度的增加而上升, 当达到 3.2×10－5 mol/L 时, 达到吸附稳定(如图5). 计算出DNR 在纳米金修饰电极上达到吸附稳定时的吸附量Г＝7.71×10－9 mol/cm 2. 假设吸附的DNR 分子间无空隙, 且为单分子层吸附, 则求得在电极上单个DNR 分子所占的面积为2.20×10－16 cm 2.图5 吸附量与柔红霉素浓度的关系图Figure 5 Plot of Γ vs. c DNR假设被吸附的DNR 分子间的相互作用可以忽略,且符合单分子层吸附条件, 则其符合Langmuir 吸附等 温式: 1c θβθ＝－, 作1θθ－～c DNR 曲线, 如图 6. 由图可见,1θθ－与c DNR 具有线性关系, 说明DNR 吸附符合 Langmuir 吸附等温式, 吸附系数β＝9.26×105 L/mol.由β＝exp(－ΔG °/RT )可求得25 ℃时的吸附自由能, ΔG °＝－34.04 kJ/mol. 表明反应物具有较大的吸附自发性.2.5 柔红霉素和DNA 的相互作用在4.4 mmol/L pH 7.02的磷酸缓冲溶液中, 在本实验条件下, 柔红霉素是具有电活性的, 而DNA 则是非电活性物质. 实验表明, 在柔红霉素中引入DNA(在吸附了柔红霉素的电极表面再滴加DNA 溶液, 在37 ℃下恒温1.5 h), 柔红霉素和DNA 发生相互作用, 使得柔红霉素的峰电流下降.如图7, a 曲线是没有加入DNA 时的柔红霉素的氧化还原峰. c 曲线是加入正常DNA 后的柔红霉素的氧化还原峰. 可见, DNA 与柔红霉素作用后, 柔红霉素的峰No. 8郑 华等：柔红霉素修饰的纳米金电极的制备及其对DNA 检测809图61θθ－与柔红霉素浓度的关系图 Figure 6 Plot of1θθ－ vs . c DNR图7 柔红霉素在磷酸缓冲溶液中的循环伏安图Figure 7 CVs of the DNR/L -cys/NG/HET/AuE (a), deDNA- DNR/L -cys/NG/HET/AuE (b) and DNA-DNR/L-cys/NG/HET/ AuE (c) in 4.4 mmol/L pH 7.02 phosphate buffer solutionscan rate: 100 mV/s电流明显减小, 且峰电位略微有点负移. 说明作用后产生了无电活性物质阻碍了柔红霉素的氧化还原. b 曲线是加热变性后的DNA (deDNA, 放在水中煮沸10 min, 然后放在冰水中冷却10 min), 与柔红霉素相互作用. 柔红霉素的峰电流同样有所下降, 峰电位有所负移, 只是下降和负移的幅度比正常DNA 小. 因而可以根据柔红霉素和DNA 作用后峰电流下降的大小, 判断DNA 是否受到损伤.2.6 柔红霉素与DNA 作用的光谱证据如图8所示, 在4.4 mmol/L pH 7.02磷酸缓冲溶液中, 柔红霉素在可见区的最大吸收峰位于480 nm; DNA 在可见区无吸收峰. 柔红霉素中加入DNA 后, 柔红霉素的吸收峰降低, 并红移至508 nm, 表明柔红霉素与DNA 发生相互作用.图8 柔红霉素和DNA 作用的紫外光谱图Figure 8 Ultraviolet and visible absorption spectra of 5.00× 10－5 mol/L daunomycin in the absence (a) and the presence (b) of3.90×10－4 mol/L DNA2.7 分析应用根据加入DNA 后DNR 峰电流的降低, 定量测定DNA. 在此条件下, DNA 浓度与DNR 峰电流的降低在3.8×10－6～1.0×10－7 mol/L 和1.0×10－7～2.5×10－9 mol/L 范围内呈线性关系, 线性回归方程分别为I P /μA ＝14.7＋1.05c /(μmol•L －1)和I P /μA ＝5.17＋2.60c /(μmol•L －1), 相关系数分别为0.9987和0.9990, 检出限为1.2×10－9 mol/L. 测定结果和回收率实验示于表1. 由表可见, 相对标准偏差在0.76%～2.3%之间, 回收率在98.0%～100.9%之间. 表明该方法用于DNA 的测定是可行的. 同自组装膜修饰电极相比(DNA 的检出限为 9.5×10－9 mol/L, 用于样品测定, 得到的相对标准偏差在0.54%～2.2%之间, 回收率在98.3%～101.3%之间), 表明纳米金修饰电极的灵敏度较好.表1 样品测定结果Table 1 Results of sample determinationsSampleConcentration added/(mol•L －1)Concentrationfound/(mol•L －1)Recovery/%RSD/%fsDNA 16.45 6.38 98.9 1.26.45 6.50 100.7 2.3 6.45 6.36 98.6 1.5 fsDNA 210.2 10.3 100.9 0.7610.2 10.25 100.5 0.9 10.2 10.0 98.0 1.42.7 电化学交流阻抗(EIS)在电极修饰过程中, EIS 能给出电极表面阻抗的变化. 图9a 是裸金电极的EIS, 正像报道的那样[14], 它有非常小的半圆直径, 表明裸金电极对氧化还原探针有非常小的电子转移阻抗. 当用HET 修饰后, HET 单分子层810化学学报V ol. 64, 2006有较高的阻抗(图9b), 表明HET单分子层阻碍了电子传递. 当HET修饰电极被浸泡在金胶中, 发现纳米金/HET修饰的金电极的交流阻抗接近于裸金电极(图9c),说明了纳米金/HET修饰的金电极的传导性与金电极本质上是一致的, 或者是固定在HET上的纳米金起着类似于导电丝或电子导电隧道的作用, 使它更易发生电子转移.再将纳米金/HET修饰电极浸泡到L-cys溶液中, 这样获得L-cys/纳米金/HET修饰电极. 此时电极的界面阻力增加(图9d). 再把电极浸泡在柔红霉素和DNA溶液中时, 电极的界面阻力都增加(图9e和9f). 电极的界面阻力大小见表2.表2由Nyquist曲线拟合得到的电极表面的阻力值Table 2 Values of R ct obtained from the fit to the Nyquist plots电极HET修饰电极L-cys修饰电极DNR吸附在电极上DNA吸附在电极上R ct/kΩ 2.30 6.20 9.55 13.3图9 裸金电极、双硫醇修饰电极、纳米金修饰电极、L-半胱氨酸修饰电极、柔红霉素修饰电极和吸附有DNA的修饰电极, 在铁氰化钾和亚铁氰化钾溶液中的交流阻抗图Figure 9 Nyquist plots of (a) bare AuE, (b) HET/AuE, (c) NG/HET/AuE, (d) L-cys/NG/HET/AuE, (e) DNR/L-cys/NG/ HET/AuE and (f) DNA-DNR/L-cys/NG/HET/AuE in 25 mmol/L K3Fe(CN)6-K4Fe(CN)6 solution with frequency of 0.1～105 kHz电极修饰过程交流阻抗的变化可有力地证明DNR 被吸附到电极表面, 同时证明了DNA与DNR在电极表面发生相互作用.综上所述, 加入DNA后, 柔红霉素的峰电流明显降低, 甚至几乎消失, 而峰电位也发生移动, 表明柔红霉素与DNA发生了作用, 形成了非电活性物质; 加入DNA后, 柔红霉素480 nm的紫外吸收峰降低, 并红移至508 nm, 也表明柔红霉素与DNA发生了作用. 柔红霉素是平面型分子, 主要以嵌插方式结合在DNA双螺旋的碱基之间. DNA链的疏水环境使已嵌入DNA链中的柔红霉素的电活性降低, 难被还原成半醌自由基, 而未嵌入的柔红霉素则易被还原. 根据加入DNA后柔红霉素峰电流的降低可以用于检测DNA. 变形后的DNA 与柔红霉素作用后, 峰电流降低较少, 也可用于检测DNA的损伤.3 结论纳米金引入电极表面后, 增加了电极表面有效面积, 又由于纳米颗粒本身特殊的性质, 如大的比表面积、尺寸量子效应和化学反应活性等, 可以提高电极的灵敏度. 本文把柔红霉素吸附在纳米金修饰电极上, 利用柔红霉素峰电流的降低, 检测DNA. 本法简单, 快速, 而且无需标记DNA.References1Pang, D.-W.; Yan, W. Chem. J. Chin. Univ. 2001, 22, 389 (in Chinese).(庞代文, 颜蔚, 高等学校化学学报, 2001, 22, 389.)2Part, P. O.; Lopez, E.; Mathis, G. Anal. Biochem. 1991, 195, 283.3Ci, Y. X.; Zheng, Y. G.; Tie, J.; Chang, W. Anal. Chim. Acta 1993, 282, 695.4Forster, A. C.; McInnes, J. L.; Skingle, D. C.; Symons, R.H. Nucleic Acids Res. 1985, 13, 745.5Grabar, K. C.; Allison, K. J. Langmuir1996, 12, 2353.6Baker, B. E.; Kline, N. J. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 8721.7Freeman, R. G.; Grabar, K. C. Science1995, 267, 1629.8Lyon, L. A.; Musick, M. D. Sens. Actuators, B 1999, 54, 118.9Gao, Y. G.; Wang, A. H. J. J. Biomol. Struct. Dyn. 1995, 13, 103.10Stefania, M.; Rosanna, M.; Enzio, R. J. Chem. 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中国药科大学学报Journal of China Pharmaceutical University2003,34(2):184~189#综述#纳米金标记法在DNA检测及基因芯片技术中的应用谷宇,何农跃*(东南大学国家教委分子与生物分子电子学重点研究实验室,南京210096)=摘要>近年来DNA介导的纳米金颗粒的组装研究受到广泛重视,烷巯基修饰的寡核苷酸可与纳米金共价结合,形成的探针可与目的多核苷酸序列杂交,纳米金颗粒被可逆组装成超分子结构,聚集过程伴有红色到蓝色的颜色变化,由此衍生出比色法检测特定DNA序列的新方法。

该方法具有极高的选择性和较好的灵敏度,与银染法结合更提高了检测的灵敏度,可用于斑点杂交、芯片检测等领域。

本文对该方法的原理、操作过程及研究进展作一简要介绍。

=关键词>纳米金;比色法;银染;DNA检测=中图分类号>Q81=文献标识码>A=文章编号>1000-5048(2003)02-0184-061引言随着人类基因组测序工作的初步完成,基因物质的杂交、错配检测等,因其在病理学、药理学、免疫学、遗传学、分子生物学等方面的广泛应用,已受到了各国科学家的普遍重视。

已开发的主要技术包括等离子共振(SPR)、聚合酶链式反应(PC R)、荧光和电化学分析等,并发展了DNA芯片和核酸生物传感器技术[1]。

以往的方法大多是建立在标记有放射性、荧光和化学发光物质等报告基团的探针与靶序列杂交的基础上。

放射性标记法有放射性活性探针的处理问题和贮藏寿命短的问题,因此,放射性原子被越来越多的非放射性基团替代并通过比色、荧光或化学发光的方法进行检测[2]。

这些方法各有其优缺点,目前还没有一个普遍接受的最好的方法。

基于荧光标记的检测体系近年来在DNA芯片中的重要作用已经获得认同,并且在基因差异表达、基因突变、基因多态性研究和基因诊断等领域得到了应用,但其寡核苷酸阵列的制作以及后续的杂交检测都有较高的仪器设备要求,荧光标记物也比较昂贵。

纳米金标记DNA的生物传感器罗贵华,徐怀德3,高志贤3①,胡志华,周焕英①,刘楠①(西北农林科技大学食品科学与工程学院,陕西杨凌712100) 摘要:目的利用纳米金标记DNA以提高传感器的检测灵敏度,为建立方便、快速、准确地检测食品中李斯特菌的方法提供依据。

方法利用自组装法,将5′端巯基修饰的单链DNA固定在金电极上,然后与纳米金标记的探针进行杂交。

结果传感器与标记有胶体金的探针杂交频率减少了207H z,与未标记有胶体金探针杂交频率(减少了52H z)相比提高了3倍。

结论采用纳米金标记的探针可提高传感器的检测灵敏度,在食品安全检测中具有重要意义。

关键词:　生物传感器;　纳米金标记DNA;　DNA固定;　杂交 中图分类号:Q523 文献标识码:A 文章编号:1001-5248(2007)02-0091-03 压电传感器已广泛应用于生物传感领域〔1〕。

纳米材料在传感器中的应用使DNA杂交检测的灵敏度大大提高,成为研制DNA传感器的首选材料〔224〕。

我们用纳米金标记DNA后再与传感器上固定的探针进行杂交,以便更好地检测食品中细菌。

1　材料与方法1.1　试验材料　固定液(10mm ol・L21Tris-HCl,0.2 m ol・L21NaCl);Piranha液(浓硫酸:30%双氧水=3∶1);10mm ol・L21磷酸缓冲液;K3Fe(C N)6;K4Fe(C N)6。

李斯特菌毒力基因片段(上海生工):5′-SH-GG C AAC CTC GG A G AC TT A CG C-3′(P21),5′-SH-G CG T AA G TC TCC G AG G TT G CC-3′(P21′)。

CHI401A电化学工作站(CHIInstrument,US A)。

1.2　试验方法　(1)电极先用超声波清洗10min,取出后用纯净水冲洗,然后将Piranha液滴于金电极表面反应10min,去离子水反复冲洗后再用丙酮和用无水乙醇冲洗,最后用纯净水冲洗干净,N2干燥后测其频率f0。

基于β―环糊精碳纳米片修饰电极的伏安传感器快速检测磺胺嘧啶摘要采用超声电解的方法制备碳纳米片（CNS），通过超声分散法将β-环糊精（β-CD）负载在CNS上，再通过滴涂法将β-CD-CNS纳米复合材料固载在玻碳电极表面，构建磺胺嘧啶（SD）伏安传感器。

以差分脉冲溶出伏安法（DPSV）研究SD传感器的电催化性能，考察和优化了pH值、修饰量、扫描速度、搅拌速度和时间、沉积电位和时间等参数的影响。

结果表明，β-CD-CNS纳米复合材料在中性溶液对SD具有良好的催化活性，能显著提高SD的电流响应。

在优化的条件下，SD在+0.87 V产生一个灵敏的氧化峰，氧化峰电流ip（μA）与SD的浓度在0.05～13.5 μmol/L范围内呈良好的线性关系，相关系数为0.999，检出限为12.2 nmol/L（S/N=3）。

本方法成功应用于水和牛奶中SD残留检测，加标回收率为80.0%～102%，RSD≤5.2%。

关键词磺胺嘧啶；电化学检测；碳纳米片；β-环糊精；差分脉冲溶出伏安法1 引言磺胺嘧啶（Sulfadiazines，SD）是一种广谱抗菌药物，广泛应用于预防和治疗人类、水产和动物养殖等细菌感染[1，2]。

如果滥用或不正确使用会导致SD在人体、水产品、动物食品、环境中残留并累积，危及人体健康。

我国《无公害水产品中渔药残留限量》（NY5070-2002）和《农业部第235号公告-动物性食品中兽药残留最大限量》规定水产品、动物性食品中SD最高残留限量（MRLs）为100 μg/kg[3，4]。

因此，开发快速、灵敏和低成本的检测环境水域和动物产品中SD残留对保护公众健康至关重要。

目前已报道的用于SD残留检测的方法有很多，如高效液相色谱法（HPLC）[5，6]、毛细管电泳法[7，8]、流动注射化学发光法[9]、紫外光度法和荧光法[10，11]、免疫分析法[12]、电化学传感器[13～17]等，其中HPLC和电化学传感器应用最广泛。

纳米金修饰电极对沙丁胺醇与蛋白结合作用的研究魏瑞丽;李晓霞【摘要】利用纳米金修饰碳糊电极研究了沙丁胺醇与牛血清蛋白的结合作用,并对牛血清蛋白进行了定量测定.结果发现,在pH 7.0 PBS缓冲溶液中,当加入不同浓度牛血清蛋白后,0.6V处沙丁胺醇的氧化峰电流降低,牛血清蛋白的线性范围是2.47×10-7mol/L ～2.00×10-5 mol/L,检出限为8.23×10-8mol/L.沙丁胺醇与牛血清蛋白形成了1:1的结合物,结合常数为2.84×105 L/mol.紫外光谱表明沙丁胺醇使牛血清蛋白的紫外吸收峰发生红移且有增色效应.4种常见金属离子Zn2+,Mg2+,Fe3+和Cu2+对沙丁胺醇与牛血清蛋白的结合起抑制作用.红外光谱表明沙丁胺醇与牛血清蛋白分子中氨基酸残基的硫及氮原子形成键合作用.【期刊名称】《延安大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2019(038)001【总页数】4页(P60-63)【关键词】沙丁胺醇;牛血清蛋白;纳米金修布电极;紫外光谱;红外光谱【作者】魏瑞丽;李晓霞【作者单位】延安大学化学与化工学院,陕西延安716000;铜川市环境监测站,陕西铜川727031;延安大学化学与化工学院,陕西延安716000【正文语种】中文【中图分类】O657.1沙丁胺醇(Salbutamol,Sal)为选择性受体激动剂，是体育赛事中国际奥组委限制使用的违禁药品[1]。

在现代养殖业中作为瘦肉精，用于分解动物体内的脂肪，但残留的Sal被摄入会严重危害人类健康[2,3]。

血清蛋白作为血浆中含量最丰富的载体转运蛋白，能与许多内源及外源化合物发生结合作用[4-6]。

因此，研究沙丁胺醇与血清蛋白的结合作用对药物代谢、食品安全和人类健康都具有重要意义。

本文采用纳米金修饰碳糊电极研究了沙丁胺醇(Sal)与牛血清白蛋白(BSA)的结合作用，测定了两者作用的结合常数及结合比。

纳米金修饰玻碳电极在抗坏血酸共存下选择性测定去甲肾上腺
素
张宏;金葆康
【期刊名称】《分析化学》
【年(卷),期】2002(030)011
【摘要】利用电沉积的方法制得纳米金修饰玻碳电极,该修饰电极对去甲肾上腺素(NE)氧化反应有催化作用.去甲肾上腺素在纳米金修饰玻碳电极上有很强的吸附作用.研究了磷酸缓冲溶液的pH值和浓度对NE的电化学行为的影响.从去甲肾上腺素和抗坏血酸在纳米金修饰电极的循环伏安图上可观察到两个明显分开的氧化峰,峰电位差达到131mV,因此,可利用该修饰电极在抗坏血酸存在下选择性测定去甲肾上腺素,线性范围为1×10-4～5×10-6 mol/L.
【总页数】4页(P1285-1288)
【作者】张宏;金葆康
【作者单位】安徽大学化学化工学院,合肥,230039;阜阳师范学院化学系,阜
阳,236032;安徽大学化学化工学院,合肥,230039
【正文语种】中文
【中图分类】O65
【相关文献】
1.Nafion修饰碳纤维微电极在抗坏血酸共存下选择性测定去甲肾上腺素 [J], 李梅;陈慧;伍雪巍;农燕婷;陈思伶;唐旻奕;程寒
2.Nafion修饰碳纤维纳米电极在抗坏血酸共存下选择性测定多巴胺 [J], 程寒;陈敏;杨沫;孙欣欣;韦光汉;兰嘉峰
3.聚缬氨酸修饰电极在抗坏血酸共存下选择性测定去甲肾上腺素 [J], 马心英;林宪杰
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重庆大学硕士学位论文金纳米粒子及其DNA修饰的荧光及电泳分析姓名：***申请学位级别：硕士专业：分析化学指导教师：***20060401摘要直径在纳米级的金纳米粒子具有很多宏观粒子所不具备的小尺寸效应、表面效应、光学效应以及特殊的生物亲和效应，这些效应使得金纳米粒子广泛应用于临床医学、材料学等领域，在医学检验领域金标记技术已经成为目前的第四大标记技术。

在对金纳米粒子进行研究的过程中需要对这种微观材料的表面性质及状态进行精确研究才能更好的指导应用，表面修饰了核酸或蛋白质的金纳米粒子目前主要用电镜、荧光淬灭等技术对其进行表征，但是这些技术手段操作相对较烦琐、条件苛刻、仪器昂贵。

这就需要发展一些相对简单的方法对金纳米粒子及修饰后的复合物进行表征。

本论文发现金纳米粒子在荧光素溶液中间可以增强荧光染料的荧光强度。

在荧光素溶液中间加入低浓度的金纳米粒子可以增强荧光素溶液的荧光3－10倍，在氨甲基芘溶液中加入金纳米粒子可以增强氨甲基芘的荧光强度30倍，逐渐增大金纳米粒子的浓度又会引起这种荧光增强的减弱直至荧光淬灭，这种荧光增强和荧光淬灭之间的联系无人提及。

荧光淬灭目前已经广泛应用于核酸和蛋白质的定性、定量研究、利用荧光供体和受体之间距离变化所引起的能量转移作为标尺对纳米尺度的距离进行测量等方面。

如果将荧光物质的荧光强度先增强再利用荧光淬灭来对物质定性或者定量检测将会进一步提高检测下限，这相当于不增加检测试剂的量而引起响应信号的增加。

在未涂附的毛细管中可以将40nm和70nm两种粒径的金纳米粒子混合溶液进行分离，虽然实验结果显示这两种粒径的金纳米粒子在紫外检测器中间并未完全分开，但是利用毛细管电泳可以将粒径有差异的金纳米粒子进行区分，这给表面修饰后的金纳米粒子的分离提供了新的思路。

表面修饰后的金纳米粒子在电学性质上将有更大的差异这对于分离就更加有利，不失为一种金纳米粒子修饰的新分离手段。

后续实验将对这种分离的条件进一步摸索。

苝酐-纳米金修饰电极同时检测抗坏血酸、多巴胺和尿酸的研究归国风;宋鹏;孙小媛【摘要】多孔结构的3,4,9,10-苝四甲酸二酐(PTCDA)作为骨架,用抗坏血酸做还原剂制备纳米金(GNPs),制备了高催化活性的PTC-GNPs复合纳米材料.将该材料用于玻碳电极的修饰(GCE),制得PTC-GNPs复合材料修饰的电极(PTC-GNPs/GCE).该修饰电极能够同时对尿酸(UA)、多巴胺(DA)和抗坏血酸(AA)进行检测.分别使用循环伏安法(CV)和差分脉冲伏安法(DPV)对UA、DA和AA和在修饰电极上的电化学行为进行研究.实验结果表明,在pH=5.0的PBS缓冲体系中,该修饰电极对UA、DA和AA的线性响应范围分别为0.002～0.462 mol/L、0.002～0.352 mol/L和0.04～1.54 mol/L.该传感在临床医学检测领域具有一定的应用前景.【期刊名称】《化学传感器》【年(卷),期】2014(034)004【总页数】5页(P34-38)【关键词】苝四甲酸二酐;纳米金;多巴胺;尿酸;抗坏血酸;伏安法【作者】归国风;宋鹏;孙小媛【作者单位】贵州工程应用技术学院化学工程学院,贵州毕节551700;贵州工程应用技术学院化学工程学院,贵州毕节551700;贵州工程应用技术学院化学工程学院,贵州毕节551700【正文语种】中文生物活性小分子物质在哺乳动物及人类体内发挥着重要的作用。

不同的活性小分子物质在细胞信号转导、基因表达调控和生物学效应上形成复杂的调节网络，承担着调节机体稳态的重要使命。

目前，在电化学领域研究比较多的生物活性小分子物质主要有H2O2[1]，多巴胺（DA）[2]，抗坏血酸（AA）[3]，尿酸（UA）[4]等。

其中DA是一种重要的神经递质[5]，UA是人体最基础的代谢产物[6]，AA是维持人体健康必需的维生素[7]，三者作为生物活性小分子同时存在于体液当中，其含量对于人体的健康有着极大的影响。