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原位杂交技术的操作详解及小贴士原位杂交技术是一种基因组分析方法，用于确定一些特定DNA序列在细胞或组织中的位置。
该技术可以帮助研究人员了解基因组的结构和功能，以及基因在不同细胞类型中的表达模式。
下面将详细介绍原位杂交技术的操作步骤及一些建议。
操作步骤：1.准备DNA探针：首先需要选择合适的DNA探针，用于与目标DNA序列杂交。
DNA探针可以是标记有荧光分子或放射性同位素的DNA序列，用于在杂交后的图像检测或放射计数。
2.制备标本：从目标细胞或组织中提取DNA，并进行适当的处理步骤以便于杂交反应。
其中的处理步骤包括固定、裂解、脱氧核酸酶处理等。
3.杂交反应：在杂交缓冲液中，加入DNA探针和标本DNA，并进行杂交反应。
杂交条件（包括温度、时间和盐浓度等）会根据探针和目标序列的碱基配对特性进行选择。
对于不同的实验目的，例如检测靶基因在组织中的表达模式，杂交条件需要根据实验要求确定。
4.洗涤：在杂交反应结束后，需要进行洗涤步骤以去除非特异杂交的DNA。
通过在高温、高盐浓度或低温条件下进行洗涤，可以选择性地去除未与目标DNA序列配对的DNA。
5.可视化和成像：根据DNA探针的标记方式，采用不同的方法进行可视化和成像。
对于荧光标记的探针，可以使用荧光显微镜观察，并通过分析图像来确定特定DNA序列的位置。
对于放射性标记的探针，可以使用辐射自显像片、液闪仪或放射计数仪等设备进行检测和计数。
小贴士：1.选择合适的探针：为了获得准确的结果，选择合适的探针非常重要。
探针的特异性和亲和力会直接影响到杂交的特异性和效率。
因此，在设计和合成探针时，需要考虑目标DNA序列的长度、特异性和亲和力等因素。
2.优化杂交条件：杂交条件的优化对于获得准确的结果非常重要。
温度、盐浓度和杂交时间是影响杂交反应的重要因素。
通过调整这些条件，可以增强目标DNA和探针的碱基配对能力，提高杂交特异性和效率。
3.正确选择洗涤条件：洗涤步骤的正确选择可以帮助去除非特异杂交的DNA。
原位杂交实验具体步骤及详细方法原位杂交组织(或细胞)化学(In situ Hybridization Histochemistry，ISHH) 简称原位杂交(In Situ Hybridization)，属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。
根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。
根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。
直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。
间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。
原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。
尽管同位素标记(如35S，3H，32P 等)仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展(尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针)，更引起科技工作者的极大兴趣。
一、基本要求组织取材：组织取材应尽可能新鲜。
由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30min内固定。
固定目的是：(1)保持细胞结构；(2)最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；(3)使探针易于进入细胞或组织。
最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂(如戊二醛)不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。
增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：(1)稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。
组织和细胞标本亦可用0.2M HCl处理10min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。
(2)去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是Triton X-100。
原位杂交实验操作步骤撰写人：范为民一、实验原理原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。
现在原位杂交已经成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生，发展和调控等根本性问题的有力工具。
二、试剂盒本实验室常用的原位杂交试剂盒是博士德公司生产的敏感加强型原位杂交检测试剂盒，此试剂盒分为两种，一种为过氧化物酶（POD）检测（MK1030型），一种为碱性磷酸酶(AP)检测系统（MK1032型），用于mRNA的杂交。
过氧化物酶（POD）检测的最终信号为棕黄色，而碱性磷酸酶(AP)检测的信号为紫色，因后者信号比较突出，所以一般采用后一种检测方法。
两种检测方法的实验步骤相差不多，所用洗脱缓冲液也大同小异。
用于杂交的探针也可以分为两种，一种是DNA探针，即是用DNA与组织中的mRNA杂交，另一种是RNA 探针，即用RNA与组织中的mRNA杂交。
DNA探针处理操作简单，但杂交信号一般不如RNA探针强烈，所以条件允许的话一般采用RNA探针。
下面先介绍碱性磷酸酶(AP)检测试剂盒，采用RNA作为探针的操作步骤。
三、实验步骤原位杂交实验主要包括三大部分，即组织冰冻切片、RNA探针标记、原位杂交三部分。
（一）组织冰冻切片1. 实验准备（1）原位杂交专用载玻片：用多聚赖氨酸处理后的载玻片，使切片紧密粘附在玻片上，可以用于后面的洗脱。
一般一张载玻片上可以贴至多十张切片（可以是不同组织的切片），所以需要玻片的数目需要根据实验的要求而定。
这种专用载玻片可以从中杉金桥公司购买，目前价格是每片2.2元，玻片有一面的一端是毛玻璃，用于标记组织名称等，切片应该贴在此面，切勿贴到反面。
（2）缓冲液配备1.1器具准备剪刀、镊子各三把，开壳钳一把，100ml量筒一个，磁力搅拌子一个；100ml试剂瓶一个，250ml试剂瓶三个。
以上器具均洗净后置于180摄氏度以上烘烤6小时以上。
铅笔、显微镜、冰、吸水纸、一次性塑料手套等。
原位杂交操作流程1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天1)二甲苯于37°C脱蜡2次，每次15分钟；2)无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；3)95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；4)PBS清洗3分钟；5)2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6)PBS清洗10分钟；7)加入胃蛋白酶25ul/ml,37°C孵育15分钟；8)PBS清洗2次，每次3分钟；9)0.2N的HCl孵育30分钟；10)PBS清洗2次，每次3分钟；11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12)PBS清洗2次，每次5分钟；13)预杂交缓冲液孵育30分钟；14)准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85°C加热5分钟，置于冰块中10分钟；15)杂交；第二天16)将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；17)PBS清洗3分钟；18)RNA酶A溶液中(或0.1-1ng/mlPBS中)，37°C孵育30分钟；19)PBS清洗5分钟；20)室温，2XSSC清洗10分钟；21)37°C，1XSSC清洗10分钟；22)37°C，0.5XSSC清洗10分钟；23)缓冲液A孵育10分钟；24)缓冲液A(1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100)孵育30分钟；25)加入抗地高辛抗体(1/200的上述缓冲液，来自BoehringerMannheim)，37°C孵育3小时；26)缓冲液A清洗2次，每次10分钟；27)缓冲液B清洗2次，每次5分钟；28)制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时;29)停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；30)固红，脱水以及封片进行核的复染。
2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天1)二甲苯于37C脱蜡2次，每次15分钟；2)无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；3)95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；4)PBS清洗5分钟；5)2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6)PBS清洗5分钟；7)加入胃蛋白酶25ul/ml，37C孵育10分钟；8)PBS清洗2次，每次5分钟；9)0.2N的HCl孵育30分钟；10)PBS清洗2次，每次5分钟；11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中以去除封片；17）室温，2XSSC清洗10分钟；18）37°C,1XSSC清洗10分钟；19）37°C,0.5XSSC清洗10分钟；20）缓冲液A孵育10分钟；21）缓冲液A孵育30分钟；22）加入抗地高辛抗体37C孵育3小时；23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟；24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；27）固红，脱水以及封片进行核的复染。
原位杂交（In situ hybridization）是一种用于检测核酸序列在细胞或组织中的位置和表
达水平的技术。
下面是原位杂交技术的一般步骤：
1.样品固定：首先，准备需要检测的细胞或组织样品，并将其进行固定。
常用的固定方法包括使用乙醛、乙酸、甲醛等。
2.使DNA或RNA标记：选择适当的探针，它可以是DNA或RNA序列，用于与目标
核酸序列杂交。
标记的方法通常使用荧光染料、酶或同位素等。
3.制备与标记探针配对的杂交缓冲溶液：制备含有探针的杂交缓冲溶液，其中包含适当的盐和添加剂，以提供最佳的杂交条件。
4.杂交：将标记的探针加入样品中，让其与目标序列进行杂交。
这一步可以在高温条件下进行，以增加探针与目标序列的特异性结合。
5.洗涤：进行一系列洗涤步骤，以去除未结合的探针和非特异结合物，提高信号的特异性。
6.反应可视化：根据所使用的标记方式，进行合适的染色或检测步骤，以显示杂交信号。
这可以是荧光显微镜观察、酶反应染色或同位素探测等。
7.结果分析：通过显微镜观察或其他适当的图像分析方法来解读和分析杂交结果。
评估信号的位置、强度和特异性。
这些步骤仅为一般原位杂交的基本流程，具体的实验条件和步骤可能会根据研究目的
和样本类型的不同而有所调整。
原位杂交技术在生物医学研究等领域广泛应用，可以
帮助研究者了解基因表达和变化的空间定位和时序关系。
原位杂交步骤-⾃⼰整理的1荧光原位杂交试剂及其配制⽅法（以下试剂均需⽤RNase-free⽔配制）：1×PBS：NaCl 8g⁄L、KCl 0.2 g⁄L、Na2HPO4 1.44 g⁄L、KH2PO4 0.24 g⁄L，溶于DEPC处理的去离⼦⽔中，⽤pH 计测其pH，再⽤NaOH调其pH为7.4；PBST：PBS加0.1%吐温-20；LiCI：配4M LiCI 100ml需要LiCI．H20 25.6g，配好后加⼊千分之⼀的DEPC，37℃，12h放置，⾼温灭菌。
4%多聚甲醛（4%PFA）：准确称取40g多聚甲醛，溶于1000ml的1×PBS中，避光于摇床（37℃，160r⁄m）上，待其全部溶解后，⽤棕⾊瓶分装成⼩体积包装，保存于－20℃。
（注：本⽅法与其他⼀些⽂献⽤NaOH和HCl先后调节pH⽽促其溶解的⽅法略有不同，因是考虑到pH的稳定性；另外之所以采⽤上述⽅法使多聚甲醛缓慢溶解⽽没有采⽤⽂献中提及的⽤NaOH调节其pH⾄10促其溶解后再⽤HCl调节pH的原因，除了⽤⼀般的pH试纸测量配置好的4%多聚甲醛的pH不够准确外，也因为不能⽤pH计对其酸碱度进⾏测量，因为它会损坏pH 计）。
取以上各成分，溶于DEPC处理过⼀定量的纯⽔（或双蒸⽔）中，测定其pH(放置⼀段时间待其pH稳定后)，据此以HCl或NaOH来调节其pH值⾄7.4，定容⾄所要求的体积。
（注：根据实际情况，因DEPC处理过的⽔其pH会下降，故本实验中实际上是⽤1mol⁄L的NaOH来调节其pH）。
75%甲醇／PBST：将⽆⽔甲醇按75%（V／V）⽐例溶于PBST；50%甲醇／PBST：将⽆⽔甲醇按50%（V／V）⽐例溶于PBST；25%甲醇／PBST：将⽆⽔甲醇按25%（V／V）⽐例溶于PBST；HYB－溶液：50%甲酰胺（V／V）、5×SSC（终浓度）、0.1%吐温-20（终浓度）、RNase-free⽔（－20℃）pH6.2HYB＋溶液：HYB－溶液、500ug／ml酵母tRNA、50ug／ml（终浓度）肝素，（－20℃）；pH6.250%甲酰胺／2×SSCT：50%甲酰胺（V／V），2×SSCT（终浓度）；2×SSCT：2×SSCT（终浓度），0.1%吐温-20；MAB马来酸缓冲液（Maleic acid buffer）：100mM maleic acid，150mM NaCl，pH 7.5(20℃)，溶于双蒸⽔，⽤浓缩或固体的NaOH调节pH 为7.5，并过滤除菌（sterile）MABT:MAB，使⽤前加⼊0.1%吐温-20；10×Blocking reagent（阻断剂）：将阻断试剂（Blocking reagent）溶于马来酸缓冲液中，摇晃并在加热器或微波炉上加热，使其终浓度为10％（w/v）；此储存液（原液）需⾼温除菌？（is autoclaved）并分装后保存于－20℃。
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种用于确定DNA或RNA序列在细胞或组织中的位置的技术。
下面将详细介绍荧光原位杂交的具体步骤和相应的详细说明。
1.细胞准备首先，需要准备细胞样本。
可以选择使用原代细胞，细胞悬液或切片等。
2.固定将细胞固定在载玻片或载玻片上面。
固定通常使用的试剂是乙酸乙酯和甲醇的混合物，通常比例为1:33.水合将载玻片中的组织或细胞水合处理。
这一步可以通过将载玻片浸泡在去离子水或缓冲液中进行。
4.处理将载玻片进行预处理，以使DNA或RNA序列更易于杂交。
常用的预处理方法有：-煮沸：将载玻片浸泡在2×SSC（1×SSC：0.15MNaCl,0.015MNa3C6H5O7·2H2O,pH7.0）中，然后置于热盖板上加热至100°C，持续约10-20分钟。
-碱性水解：将载玻片浸泡在10%NaOH中，进行碱性水解，然后在盐溶液中冲洗。
5.杂交探针准备荧光探针或荧光标记的引物。
探针的选择取决于要检测的DNA或RNA序列。
探针的设计通常基于目标序列的序列信息，并且通过化学修饰和荧光标记以增加其杂交效率和检测灵敏度。
6.杂交将探针加到载玻片上的样本上，并与目标序列进行杂交。
杂交过程中，探针与目标序列进行互补配对，形成探针-目标复合物。
杂交的温度取决于探针的碱基组成和目标序列的GC含量。
7.洗涤将载玻片在洗涤缓冲液中进行洗涤，以去除未与目标序列杂交的探针。
8.检测使用荧光显微镜观察载玻片上的标记。
荧光标记的探针将通过荧光显微镜检测获得荧光信号。
根据荧光信号的数量和强度，可以确定目标序列的位置和数量。
9.成像和分析通过拍摄荧光显微镜图像来记录荧光信号。
使用图像处理软件进行图像分析，包括亮度分析和定量信号分析。
总结：荧光原位杂交是一种用于确定DNA或RNA序列在细胞或组织中位置的强大技术。
原位杂交实验操作步骤撰写人：范为民一、实验原理原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。
现在原位杂交已经成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生，发展和调控等根本性问题的有力工具。
二、试剂盒本实验室常用的原位杂交试剂盒是博士德公司生产的敏感加强型原位杂交检测试剂盒，此试剂盒分为两种，一种为过氧化物酶（POD）检测（MK1030型），一种为碱性磷酸酶(AP)检测系统（MK1032型），用于mRNA的杂交。
过氧化物酶（POD）检测的最终信号为棕黄色，而碱性磷酸酶(AP)检测的信号为紫色，因后者信号比较突出，所以一般采用后一种检测方法。
两种检测方法的实验步骤相差不多，所用洗脱缓冲液也大同小异。
用于杂交的探针也可以分为两种，一种是DNA探针，即是用DNA与组织中的mRNA杂交，另一种是RNA 探针，即用RNA与组织中的mRNA杂交。
DNA探针处理操作简单，但杂交信号一般不如RNA探针强烈，所以条件允许的话一般采用RNA探针。
下面先介绍碱性磷酸酶(AP)检测试剂盒，采用RNA作为探针的操作步骤。
三、实验步骤原位杂交实验主要包括三大部分，即组织冰冻切片、RNA探针标记、原位杂交三部分。
（一）组织冰冻切片1. 实验准备（1）原位杂交专用载玻片：用多聚赖氨酸处理后的载玻片，使切片紧密粘附在玻片上，可以用于后面的洗脱。
一般一张载玻片上可以贴至多十张切片（可以是不同组织的切片），所以需要玻片的数目需要根据实验的要求而定。
这种专用载玻片可以从中杉金桥公司购买，目前价格是每片2.2元，玻片有一面的一端是毛玻璃，用于标记组织名称等，切片应该贴在此面，切勿贴到反面。
（2）缓冲液配备1.1器具准备剪刀、镊子各三把，开壳钳一把，100ml量筒一个，磁力搅拌子一个；100ml试剂瓶一个，250ml试剂瓶三个。
以上器具均洗净后置于180摄氏度以上烘烤6小时以上。
铅笔、显微镜、冰、吸水纸、一次性塑料手套等。
原位杂交原位准备工作：1、不锈钢与玻璃器皿180度烘12小时以上2、需DEPC处理的三蒸水约8升（听说可以用灭菌三蒸水代替）3、双蒸水可以用一馏水（即蒸馏水）代替4、所用枪头可以灭一个小时烘干用（也可用烘好的移液管）5、所用蜡片温度不能过高，防止材料变形6、切片一定要尽量吸干，并且烘12小时以上（但不能过长），以防脱落7、实验所需试剂的量要略作变动，大缸约600ml，小缸约500ml8、所有试剂除储备液外，最好都现配现用，请备好足够的烘好的量筒及容器最后强调杂交之前配试剂、融蜡与加蜡所用一切器皿器具都要180度处理，请戴乳胶手套（尽量避免接触其它地方）以防组织RNA降解下次做需买的东西：1、t RNA（一个100u的加50ul水，较粘稠吸取时应慢些，并看一下是否吸到）2、BSA（一次约需15克）3、多聚甲醛（一次约需20克）4、非去离子甲酰胺（一次约需200多ml）5、RNAse（实验室可能有）6、最好领2个2L的三角瓶7、乳胶手套8、无水乙醇（一次约需12瓶，有些地方应该可以95%的代替）做之前请认真检查所需一切用品是否到位I．组织固定和包埋在本实验室条件下推荐使用FAA（50% ethanol, 5% acetic acid, 3.7% 甲醛）固定材料，似乎比4%多聚甲醛固定时抽气更彻底。
FAA固定液（400ml），室温保存：无水乙醇 200ml冰醋酸 20ml37%甲醛 40ml水（DEPC） 140ml1L水加1mlDEPC，37℃过夜（最好一直慢摇或剧烈摇晃后再放入），灭菌第一天：组织固定（下午4、5点取材）将装有2/3体积固定液的青霉素小瓶（小瓶预先在180℃烘过）置于冰上，取新鲜材料投入，冰上真空抽气。
缓慢抽气冒气泡后保持真空15分钟后缓慢放气，如此数次至材料沉底即可，以达到快速彻底固定。
换新鲜固定液，4℃过夜（12～16小时）。
（用DEPC-H2O配酒精）第二天：脱水以上所有步骤中每换好一步乙醇均置于4℃冰箱等待，并不时轻摇。
原位杂交实验步骤专业2010-04-27 19:48:18 阅读17 评论0 字号：大中小订阅1质粒的转化和扩增1.1制备XL1-Blue感受态细菌1．取400uL XL1-Blue菌种加入到含200ml LB培养基的锥形瓶中，37 ℃、100rpm 培养4h，离心，倒置，以冰冷的0.1 mol／L CaCl_2重悬细菌，冰浴30 min，离心，弃上清，倒置，再加4ml(含15％甘油)冰冷的CaCl2重悬细菌，分装(200 μ／tube)，-80 ℃保存。
2．转化：在冰浴中将1管XL1-Blue感受态菌解冻，将浓度为2ng／μ1的质粒DNA4μ1加入到8Oμ1感受态菌中。
3．轻轻摇匀，冰浴30 min。
4．42 ℃热激9O秒，然后迅速冰浴2 min。
5．加入LB培养液(无氨苄青霉素)0.8ml，在37 ℃，100转／min水浴孵育60 min。
6．取200μl菌液铺于琼脂板上(涂有X-Gal(20mg／ml)-IPTG(200mg／ml)的LB-氨苄青霉素50 mg／ml,1μl／ml培养基)，待菌液全部被吸收后，倒置平板于37 ℃培养12-16h。
1.2鉴定和挑选含重组质粒的菌落1．用无菌牙签挑取单菌落，接种到10 ml含氨苄青霉素的LB培养液的离心管中，于37 ℃，200转／分培养2h，取1 ml之一Eppendorf离心管，加50μl10mmol／L EDTA(pH 8.0)。
2．加入50μl新配置的0.2mol／L NaOH、0.5％SDS、20％蔗糖溶液后，振荡3O 秒。
3．在70 ℃温育5 min，然后冷却到室温。
4．加1.5μ14mol／L KCl和0.5μ1含0.4％溴酚兰染液，振荡3O秒后，冰浴5min。
5．12000g，4 ℃离以3 min，以除去细菌碎片。
6．制备1％的琼脂糖凝胶(含EB0.5μg／ml)，取50μl上清液加入到样品孔中，其中一孔加入中等分子量DNA Marker。
恒压50V，进行电泳。
7．当溴酚兰迁移到凝胶全长的2／3-3／4时，停止电泳，在紫外灯下检查质粒DNA 分于量的大小是否与转入质粒相符。
1.3质粒的扩增和纯化1．用无菌牙签分别挑取单个白色菌落移入含30ml LB-氨苄青霉素(50μg／ml)培养液的聚丙烯管中，于37 ℃，200转／分培养3h。
2．将菌液转入含70 ml LB-氨苄青霉素培养液的250ml锥形瓶中，37 ℃，200转／分培养过夜(12-16h)，细菌浑浊。
3. 菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇，100ml菌液加入0.5ml氯霉素溶液，终浓度为170 μ／ml)。
37 ℃，200转／分培养12-16h。
4. 将培养的细菌倒入50ml的离心管中，6000rpm，4 ℃离,th,15 min，沉淀细菌。
5. 弃净上清夜，用2ml预冷的溶液I，悬浮菌体沉淀，剧烈振荡，于室温静置5 min6. 加入新配制的溶液II 4ml，快速用手晃动10秒，颠倒数次后，于室温静置10 min。
7. 加入预冷的溶液III 3ml，温和振荡l0秒，于冰上静置10 min，出现白色絮状沉淀。
8．6000rpm，4 ℃离心15 min，保留上清。
9．将上清(若带细菌残片，则再次离心)移入另一50ml的离心管中，加入O.6倍体积的异丙醇混匀，于室温静置10 min。
(或-20 ℃4h，或4 ℃过夜，可便核酸沉淀) 10.12000 rpm，4 ℃离心15 min，回收核酸。
小心弃去上清，倒置离心管使残兼上清液流尽。
11．于室温用70％的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000 rpm离心，15 min，充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。
12．用500μl TE(pH8.0)溶解核酸沉淀，转移至1.5 ml Eppendorf管中。
13．加入用冰预冷的5mol／L的LiCl溶液600μl，充分混匀。
12000 rpm，4 ℃离心15 min，以沉淀高分子量的RNA。
14.将上清转移到另一1.5 ml Eppendorf管中，加等量异丙醇，充分混匀，于室温静置10min。
15.12000 rpm,4 ℃离心15 min，回收核酸。
小心弃去上清，倒置离心管使残余上清液流尽。
16．于室温用70％的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000 rpm离心，15 min，充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。
17.400μl含无DNA酶的RNA酶(20μg/ml)的TE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀，将溶液转移到另－1.5 ml Eppendorf管中，室温放置1.5ml Eppendorf管中30min。
18．加入400μl13％(v／v)的PEG 8000-NaCl(1.6 mol／L)，混匀，4 ℃12000rpm 离心5 min以回收质粒DNA，弃去上清。
19．加入400μl TE缓冲液(pH 8.O)溶解沉淀，再分别用等体积的Tris饱和酚、酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)、和氯仿各抽提一次。
20．将水相(上清)移入另一1.5ml Eppendorf管中，加入O.1体积(约50μ13M的醋酸钠(pH 5.2)和2倍体积(大约1 ml)的无水乙醇，充分混匀后于4℃放置30 min。
21．于4 ℃12000 rpm离心5 min回收沉淀的质粒DNA。
尽可能弃去上清，敞开管口，置工作台上使残留的痕量乙醇蒸发殆尽。
22．加入400 μl处于4 ℃的70％乙醇，稍加振荡，漂洗沉淀，4 ℃12000 rpm离心2 min。
23．吸去上清，室温敞开管口，直到乙醇完全挥发。
24．用100μl TE缓冲液(pH 8.0)溶解沉淀。
25．取4μl溶液1：100稀释后，测定其OD260、OD280，以确定质粒DNA的纯度和浓度(OD260／D280>1.8。
OD260／OD280对DNA而言其值大约为1.8，高于2.0则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。
；DNA浓度=OD260 X 0.05 X稀释倍数(μg／μl)。
26．质粒DNA溶液于-20 ℃保存待用。
二、cRNA探针的标记1．将质粒DNA，用相应的限制性内切酶线性化，通过琼脂糖凝胶电泳以确保完全线性化。
2．线性化后的DNA按“质粒的纯化”步骤19-24进行纯化，作为cRNA探针标记的模板，用相应的RNA聚合酶合成地高辛标记的反义和正义RNA探针。
3．进行体外转录，步骤如下：4．在冰上将各试剂加入一1.5 ml无RNA酶的Eppendorf管中。
DEPC处理的三蒸水8μl质粒DNA模板0.05μg／μl1μl10 x NTP地高辛标记混合物 1 x 2μl0.1 M DTT溶液10 mM 2μl5 x转录缓冲液1 x 4μlRNAse抑制剂2U／μl1μlRNA聚合酶2U/μl2μl反应体系总体积20μl5．加入上述各试剂后，混匀，简短离心后在37 ℃孵育2h。
6．加入2μl无RNA酶的DNA酶I(10U／μ1)，37 ℃孵育15 min降解模板DNA。
7．加入0.2M EDTA(pH 8.0)溶液2μl终止反应。
8．加入2.5μl的4 M Licl和7.5μl冷的无水乙醇，混匀，-20 ℃放置2h。
9．12000g下离以15 min，弃上清，小心地用50 μl冷的70％乙醇洗涤沉淀。
1O．室温下稍干燥，溶于100μ1 DEPC处理过的三蒸水中，混匀分装，-20 ℃下保持备用。
三、原位杂交3.1冰冻切片与杂交前预处理1．将子宫样品从-80 ℃取出，用OCT包埋，在-23 ℃(切片机腔体温度)平衡至少30 min。
将包埋好的样品固定在样品头上，切10μm厚的连续组织切片，平铺于涂有多聚赖氨酸(1mg／m1)的玻片上(玻片预先经180 ℃干烤6小时)，保存于-70 ℃冰柜备用。
2．冰冻切片经室温干燥10 min后，在4％的多聚甲醛-PBS(pH 7.4)固定lOmin。
3．活跃的DEPC-PBS(未高压的0.1％DEPC-1XPBS溶液)洗2次，每次5 min。
4．在0.2M的盐酸作用中作用10 min后，重复步骤4)。
5．在切片上滴加蛋白酶K(0.1μg／m1)，37 ℃孵育15 min，重复步骤4)。
6．经0.1M TEA(三乙醇胺)作用5min后，再在新配制的0.25％AA／0.1M TEA (乙酸酐／三乙醇胺，pH 8.0)中乙酰化10 min。
(在大多数实验中，步骤4，5，6省略)7． 5 x SSC中平衡15 min。
3.2杂交8．在脱水后的玻片上滴加预杂交液(约100 μl／玻片)，置于放有湿盒液(50％甲酰胺v／v；0.3 M NaCl；1Mm EDTA；10 mM Tris-Cl，pH 8.O)的湿盒中，55～58 ℃下的烘箱中预杂交2 h。
9．甩掉预杂交液，地高辛标记的反义或正义cRNA探针(浓度1-2ng／μl)经70 ℃变性1O分钟，置冰上1 min，玻片上滴加预杂交液(约60μl／玻片)，覆盖parafilm膜，放湿盒中在48～58 ℃下杂交18-30 h。
3.3杂交后处理1O．取出玻片，小心去掉Parafilm膜，甩掉杂交液，用52 ℃预热的5×SSC洗30 min。
11．在无DNA的RNA酶A(20μg／ml)溶液中37 ℃下孵育30 min。
12．分别依次用52 ℃预热的2 X SSC，1 X SSC和O.1 X SSC洗2次，每次30 min。
3.4杂交信号检测13．在缓冲液A(0.1M Tris-HC 1 pH 7.5，0.15M NaC1)中平衡5min。
14．在玻片上滴加碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(1：500～1:2000稀释于含0.5％阻断液的缓冲液A中)，室温反应2h。
15．用缓冲液A洗2次，每次15 min。
16．在缓冲液B(0.1M Tris-HCl；0.1M NaCl；0.05M MgCl_2，pH 9.5)中平衡5min。
17．硝基四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚氧磷酸盐(BCIP)溶于缓冲液B中，每ml 缓冲液B含有4.5μ1 NBT和3.5μ1 BCIP。
在玻片上滴加混合染液在湿盒中显色过夜。
18．充分显色后，用EDTA(1 mM EDTA，pH 8.0)洗15 min终止反应。
19．在95％乙醇中洗l h以除去非特异的背景。
20．用蒸馏水洗15 min除去可能存在的结晶体。
21．脱水、透明，用中性树胶封片。
22．充分干燥后在显微镜下观察、照相。
