实验三革兰染色法

实验三细菌涂片的制备及革兰氏染色[实验目的]1、掌握细菌涂片的制备方法及革兰氏染色。

2、学习无菌操作，树立无菌观念。

[实验原理]细菌细胞微小，无色而半透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须借助染色使菌体着色（由于毛细管、渗透、吸附和吸收等物理作用以及离子交换、酸碱亲和等化学作用，染料能使细菌着色，并且因细菌细胞的结构和化学成分不同而有不同的染色反应）后，使其与背景形成明显的色差，从而能较清楚的观察到细菌的基本形态和结构。

根据不同的染色反应，可作为鉴别细菌的一种依据。

微生物染料是一种带苯环的有机化合物，其分子上具有发色基团和助色基团。

前者给化合物以特有的颜色，但不能与细菌结合；后者使化合物具成盐的性质，能和菌体结合。

分为碱性染料、酸性染料和中性染料三类。

根据细菌个体形态观察的不同要求，可将染色分为三种方法即简单染色、鉴别染色和特殊染色。

革兰氏染色：1884年由丹麦病理学家C.Gram创立。

此法可将所有细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。

是细菌学上最常用的鉴别染色法，有着重要的理论和实践意义。

其染色过程是先用草酸铵结晶紫进行初染，再加媒染剂-革兰氏碘液，以增加染料和细胞的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成相对分子量较大的复合物，然后用脱色剂-乙醇脱色，最后用沙黄液复染。

凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色（紫色）者即为G+菌，反之，脱色后染上复染剂颜色（红色）者即为G-菌。

其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同，通过染色加以鉴别。

革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，且类脂质含量少，经乙醇处理发生脱水作用后反而使其孔径缩小，通透性降低，结晶紫-碘形成的复合物保留在细胞内而不被脱色，结果细胞呈现紫色。

而革兰氏阴性菌的的肽聚糖层薄，网状结构交联少，而且类脂质含量较高，经乙醇处理后，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，结果细菌被脱色，再经沙黄复染后呈现红色。

革兰氏染色法实验报告篇一革兰氏染色法是一种常用的细菌染色方法，可用于鉴定细菌的类型和形态。

以下是一份革兰氏染色法的实验报告范例，包含实验目的、实验原理、实验步骤、实验结果和结论等部分。

实验目的： 1.了解革兰氏染色法的原理和步骤； 2.掌握细菌的革兰氏染色方法； 3.观察细菌在革兰氏染色中的反应，并进行鉴定。

实验原理：革兰氏染色法是根据细菌细胞壁的特性而设计的一种染色方法。

细菌细胞在染色过程中会根据细胞壁的结构不同，分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

革兰氏阳性菌具有较厚的细胞壁，含有较多的革兰氏染色阳性物质（如染色时用的紫檀碱），因此在染色后会呈现紫色。

革兰氏阴性菌细胞壁较薄，不含有革兰氏染色阳性物质，染色时使用的碘酒（革兰氏碘化酒）能使它产生复合革兰氏染色阳性物质（碘靛紫），再用酒精脱色，再用洋红着色，使其产生颜色变化，最终呈现红色。

实验步骤： 1.准备好菌液：选取需检测的菌株，用无菌盘收集少量菌落，用少量生理盐水悬浮，制备菌液。

2.片玻璃片：在清洁无菌玻璃片上滴上一滴菌液。

3.烘干：将玻璃片架起，自然风干。

4.固定：将玻璃片的细菌涂片在火焰上迅速烘烤，使其牢固地附着在玻璃片上。

5.染色：将烘烤后的玻璃片放入紫檀液中，染色1分钟。

6.脱色：用酒精脱色10-30秒。

7.洗净：用自来水清洗片上的超染色剂。

8.再染：将片浸入碘靛紫溶液中，染色1-2分钟。

9.脱色：用酒精脱色10-30秒。

10.洗净：用自来水清洗片上的超染色剂。

11.观察：利用显微镜观察和比较细菌的形态和染色情况。

12.记录：记录细菌的形态、颜色等观察结果。

实验结果：通过观察细菌的形态和颜色，我们可以得出以下结论：•革兰氏阳性菌在染色后呈现紫色；•革兰氏阴性菌在染色后呈现红色。

结论：革兰氏染色法是一种常用的细菌染色方法，通过染色反应可以初步鉴定细菌的类型。

本次实验中，我们成功地使用革兰氏染色法对细菌进行了染色和鉴定，观察到了不同细菌的染色结果，并且将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两类。

《微生物学》实验报告开课时间室：A区文科楼510 2012年11月29日学院生物工程学院年级、专业、班10级生工01班姓名吕亚慧成绩课程名称微生物学实验实验名称细菌简单染色法革兰氏染色法指导教师李苹教师评语教师签字：年月日实验目的：1．巩固油镜的使用方法；2．学习微生物涂片、染色基本技术，掌握细菌的简单染色法；3．学习、掌握细菌的革兰氏染色法；4．建立“无菌操作”的概念，学习其技术。

实验原理简单染色法：是利用单一染料对细菌进行染色的方法，常用碱性染料。

只能观察微生物的大小、形状、和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。

复染色法：用两种或两种以上染色液进行染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称鉴别染色法。

常用的有：、抗酸染色法、芽孢染色法、鞭毛染色法等。

革兰氏染色法：G－肽聚糖层较薄，交联度低，含较多脂质，故用乙醇等有机溶剂脱色时融解了类脂质，增加了细胞的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，经沙黄复染呈红色。

G ＋细胞壁结构致密，用脱色剂处理后，肽聚糖层孔径缩小，通透性降低，故细菌仍保留初染时的紫色。

光学显微镜是利用光学原理，把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，以供人们提取微细结构信息的光学仪器。

显微镜是利用凸透镜的放大成像原理，将人眼不能分辨的微小物体放大到人眼能分辨的尺寸，其主要是增大近处微小物体对眼睛的张角（视角大的物体在视网膜上成像大），用角放大率M表示它们的放大本领。

因同一件物体对眼睛的张角与物体离眼睛的距离有关，所以一般规定像离眼睛距离为25厘米（明视距离）处的放大率为仪器的放大率。

显微镜观察物体时通常视角甚小，因此视角之比可用其正切之比代替。

显微镜由两个会聚透镜组成，光路图如图所示。

物体AB经物镜成放大倒立的实像A1B1，A1B1位于目镜的物方焦距的内侧，经目镜后成放大的虚像A2B2于明视距离处。

实验器材变形杆菌、表皮葡萄球菌载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。

实验三简单染色法和革兰氏染色法实验三简单染色法和革兰氏染色法（一）细菌的简单染色法1实验目的1.1熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能1.2学习微生物涂片、染色的基本技术1.3掌握细菌的简单染色法1.4初步认识细菌的形态特征，学习油镜的使用方法和无菌操作技术2 实验原理细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。

细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。

利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。

此法操作简单，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。

用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。

一般使用碱性染料进行简单染色。

碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。

因细菌蛋电质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。

经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。

常用作简单染色的燃料有美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等。

酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。

当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。

染色前必须固定细菌，其目的有二：一是杀死细菌并使菌体黏附于玻片上；二是增加对染料的亲和力。

常用的有加热和化学固定两种方法。

固定时尽量维持细胞原有的形态。

3实验材料3.1菌种金黄色葡萄球菌约18h营养琼脂斜面培养物，大肠杆菌24h营养琼脂斜面培养物。

3.2染色剂草酸铵结晶紫染液，番红染液。

3.3仪器或其他用具显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、无菌牙签等。

4 流程涂片干燥固定染色水洗干燥镜检5 步骤5.1涂片在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴生理盐水或无菌蒸馏水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约1～1.5cm2。

实验三细菌革兰氏染色法【目的要求】了解革兰氏染色原理；掌握革兰氏染色的方法。

【基本原理】革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884 年由丹麦医师Gram 创立。

未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。

染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。

革兰氏染色法可将细菌分成革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-）两种类型，细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。

革兰氏染色的主要步骤包括初染、媒染、脱色和复染。

首先利用草酸铵结晶紫初染，所有细菌都会着上结晶紫的蓝紫色。

然后利用卢戈氏碘液作为媒染剂处理，由于碘与结晶紫形成碘-结晶紫复合物，增强了染料在菌体中的滞留能力。

之后用95%乙醇作为脱色剂进行处理时，两种细菌的脱色效果不同。

革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低，肽聚糖本身并不结合染料，但其所具有的网孔结构可以滞留碘-结晶紫复合物，现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。

而革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低，交联度低，壁薄且脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增加，原先滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来，菌体变为无色。

而在最后用复染步骤（染色剂为番红），染色后变为复染剂颜色（红）。

【实验器材】1.革兰氏染色液：①草酸铵结晶紫甲液：结晶紫（2 g）、乙醇（95%）（20 mL）;乙液：草酸铵（0.8 g）、蒸馏水（0.8 mL）;将甲、乙两液混合，静置48h 后使用，该染液稳定，在不透气的棕色瓶中可存储数月。

②卢戈氏碘液碘（1 g）；碘化钾（2 g）；蒸馏水（300 mL）先将KI溶于少量（3-5 mL）蒸馏水中，再放入碘，待碘全溶后，加水至300 mL。

此液稳定，可在不透气的棕色瓶中保存数月。

③脱色液：95%乙醇④复染液：即2.5%蕃红（沙黄）水溶液。

实验三 细菌的简单染色和革兰氏染色一、目的与要求1、掌握细菌涂片标本的制备2、掌握革兰氏染色法的步骤和关键点3、识别细菌革兰氏染色结果二、实验原理：细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。

为什么要对细菌染色？细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。

用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。

简单染色法可用以观察微生物的形状、大小及细胞排列状态，是微生物技术中应用广泛，操作简便的染色法。

革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G )和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。

其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。

革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性降低，结晶紫与碘形成的大分子复合物保留在细胞壁内使细胞呈蓝紫色，而革兰氏阴性菌肽聚糖层薄，网状结构交联少，且类脂含量较高，经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，再经番红复染后细胞呈红色。

三、实验器材1、菌种 牛肉膏琼脂斜面28℃培养24h 的大肠杆菌(Escherichia coli)斜面菌种，牛肉膏琼脂斜面28℃培养16h 的枯草杆菌(Bacillus subtilis)斜面菌种；2、仪器 显微镜；3、材料 载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，染色缸等。

4、染料 草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液； 细菌的简单染色步骤：细菌的革兰氏染色步骤：涂 片,干 燥,固 定,结晶紫染色,水洗,碘液媒染,水 洗,乙醇脱色,水 洗,番红复染,水 洗,干 燥,镜 检.五、实验关键步骤和注意点：1、玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。

2、挑菌量宜少，涂片宜薄，过厚则不易观察。

革兰染色法实验报告一、引言革兰染色法是细菌学常用的染色方法之一，通过染色剂革兰碘紫和酒精洗脱，可以将细菌分为革兰阳性和革兰阴性两类。

本实验旨在通过革兰染色法的操作步骤，熟悉该方法的原理和应用。

二、实验材料与方法1. 实验材料：- 细菌培养液- 革兰染色试剂：革兰碘紫、酒精、脱色剂、碘酒解、碘酒液- 玻璃片- 非吸水性棉签- 显微镜2. 实验步骤：1）取一片玻璃片，用酒精擦拭消毒。

2）取一支无菌棉签，蘸取适量的细菌培养液。

3）将棉签涂抹在玻璃片上，制备细菌涂片。

4）将涂片在室温下晾干。

5）将晾干的涂片固定在火焰上烘烤杀菌。

6）将固定的涂片放入革兰碘紫中浸泡，静置1分钟。

7）将涂片取出，用酒精洗脱涂片，直到洗脱液不再有颜色。

8）用脱色剂洗涤涂片，直到洗涤液变为浅紫色。

9）将涂片放入碘酒解中浸泡3-5分钟。

10）用酒精洗涤涂片，直到洗脱液不再有颜色。

11）用碘酒液洗涤涂片，洗涤液变为深紫色。

12）将涂片晾干，观察细菌染色效果。

13）使用显微镜在1000倍放大下观察细菌形态和染色效果。

三、结果与讨论经过革兰染色法处理后，观察涂片下显微镜图像，可以得出以下结论：1. 革兰阳性菌：染色后呈紫色或紫黑色，细胞形态较大，常呈固定形状，比如球菌球状、链球菌链状等。

2. 革兰阴性菌：染色后呈红色或粉红色，细胞形态较小，形状多样，比如杆菌、弧菌等。

革兰染色法的原理是基于细菌细胞壁的差异。

革兰阳性菌细胞壁含有较多的胆固醇和肽聚糖，革兰碘紫可以与其结合形成革兰碘紫-胆固醇-肽聚糖复合物，导致细胞呈紫色。

而革兰阴性菌细胞壁则较薄，革兰碘紫不易穿透，但可以通过酒精洗脱后，用碘酒解中的碘酒液再次染色，使细胞呈红色。

革兰染色法的优点在于简单、快速，可以初步判断细菌的类型。

但也存在一些限制，比如对于某些特殊菌株的染色效果不明显，或者存在某些变构菌株，其细胞壁在革兰染色过程中可能出现异常表现。

四、实验总结通过本次实验，我们成功地进行了革兰染色法的操作，并观察到了不同类型细菌的染色效果。

实验三革兰氏染色法一目的要求了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法二、基本原理革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。

它是1884年由丹麦医师Gram创立的。

革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G＋表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G－表示。

细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分不同而造成的。

革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫－碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫－碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。

革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorsing）和复染液（counterstain）。

碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。

媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。

脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不用，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethanol）。

复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分为G＋和G－两大类群，常用的复染液是番红。

四、操作步骤1.涂片2.染色（1）.初染（2）媒染（3）脱色（4）复染（5）镜检（6）对比革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色的程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染成阴性；脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。

实验三细菌的革兰氏染色及显微镜油镜的使用实验三细菌的革兰氏染色及显微镜油镜的使用革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884 年由丹麦医师Gram创立。

显微镜各接物镜的放大率可由其外形辨认，镜头长度越大，镜片直径越小，放大倍数大 ; 反之，放大倍数小。

油镜头长低、高倍镜，镜头下缘一般刻有一圈黑线或白线，并刻有100×等字样。

细菌体积微小，在细菌的形态学研究中，经常需要借助显微镜油镜，才能比较清楚地进行观察。

实验目的 : 掌握革兰氏染色的方法与油镜的使用方法染色原理 :通过结晶紫初染和碘液媒染后，在内形成了不溶于水的结细胞壁晶紫与碘的复合物。

G，菌 : 细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫- 碘复合物在细胞膜上。

呈紫色。

Gˉ菌 : 肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高, 乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫- 碘复合物溶出细胞，番红复染后呈红色。

油镜的使用原理 : 油镜的透镜很小，光线通过玻片与油镜头之间的空气时，因介质密度不同，发生折射或全反射，使射入透镜的光线减少，物象显现不清。

若在油镜与载玻片之间加入和玻璃折射率(n=1.52) 相近的香柏油 (n=1.515) ，则使进入透镜的光线增多，视野亮度增强，使物象明亮清晰。

实验器材 : 大肠杆菌、枯草杆菌、染液、香柏油、二甲苯、显微镜等染色步骤1、涂片 :2、干燥 : 自然3、固定 : 首先玻片要洗干净，然后在中间滴一滴菌液，涂匀，自然晾干，注意不要用火烤 ( 变形 ) 。

干后方法是，快速在酒精灯上过3， 4 次固定，要使有菌的一面向上。

4、结晶盖涂面染 1 分钟。

5、水洗。

6、加碘液覆盖涂面媒染约 1 分钟。

7、水洗。

8、滴加 95%酒精进行脱色， 20 秒，马上水洗。

9、番红染液覆盖涂面 1 分钟。

10、水冲。

11、干燥，油镜观察。

注意事项 :1、涂片不能过厚，以便于观察;2、菌龄要适宜，枯草杆菌培养约18h, 大肠杆菌 24h。