液相色谱基础知识及方法开发

液相色谱教程液相色谱方法开发液相色谱(Liquid Chromatography，简称LC)是一种常用的分离和分析技术，广泛应用于化学、生物、医药等领域。

液相色谱方法的开发是为了解决特定问题和满足特定需求而进行的，本文将介绍液相色谱方法开发的一般步骤和注意事项。

液相色谱方法的开发步骤如下：1.确定分离目标：首先确定需要分离和分析的目标化合物，包括确定化合物的物理化学性质和分离特性等。

2.选择色谱柱：根据分离目标，选择合适的色谱柱。

色谱柱的选择应考虑样品的性质、分离机理、应用要求等因素。

3.选择流动相和梯度条件：根据分离目标，选择合适的流动相（包括溶剂和缓冲剂等）和梯度条件（包括流动相的组成和梯度程序等）。

4.优化色谱条件：通过改变流动相组成、流速、柱温等参数，优化色谱条件，达到最佳分离效果。

5.建立分析方法：根据样品的特点和分析需求，建立分析方法。

包括确定检测器的波长或离子选择器、设置进样量和检测浓度范围等。

6.方法验证：对开发的液相色谱方法进行验证，包括准确度、精密度、线性范围、检出限等指标的确定。

液相色谱方法开发过程中需要注意的事项如下：1.样品制备：样品的制备要充分考虑到样品的性质和分析方法的要求，如需要进行前处理、提取、洗脱、浓缩等。

2.色谱柱保养：液相色谱柱的保养对于保证色谱方法的重复性和稳定性至关重要。

包括定期清洁、适当的保存和使用。

3.流动相准备：流动相的配制要严格按照要求，注意流向的调整、PHA值的调节、气泡和杂质的排除等。

4.柱温控制：柱温对色谱分离的效果有很大影响，需要根据分析需求对柱温进行控制和调节。

5.检测器选择：根据分析的目标和样品的特性，选择合适的检测器，如紫外检测器、荧光检测器、质谱检测器等。

6.数据处理：对色谱结果进行正确的数据处理和解释，包括峰面积计算、峰识别和归一化等。

总结来说，液相色谱方法的开发是一个系统的工程，需要综合考虑样品特性、分析需求和分离机理等因素。

一、基本原理高效液相色谱（HPLC）法是以高压下的液体为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。

高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。

在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用高效液相色谱来分析。

高效液相色谱和气相色谱在基本理论方面没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质的差别。

二、高效液相色谱分析原理（1）、高效液相色谱分析的流程：由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。

被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。

废液流入废液瓶。

遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。

这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。

（2）、高效液相色谱的分离过程：同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。

它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。

开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。

分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。

分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。

组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。

若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。

不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。

其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。

1 液相色谱基础知识1.1 液相色谱名词术语Mobile phase：流动相，在色谱柱中存在着相对运动的两相，一相为固定相，一相为流动相。

流动相是指在色谱过程中载带样品（组分）向前移动的那一相。

Stationary phase：固定相，柱色谱或平板色谱中既起分离作用又不移动的那一相。

Gradient elution: 梯度洗脱,一个分析周期中，按一定程序不断改变流动相的浓度配比, 使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。

Detection wavelength：检测波长，retention time：保留时间，被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间Peak:峰Peak Base：峰基线，经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。

一般应平行于时间轴Peak Height：峰高，色谱峰顶点至峰底的距离。

Peak Width：峰宽，色谱峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点间的距离Peak Width at Half Height：半峰高宽Peak Area：峰面积Tailing Peak: 后沿较前沿平缓的不对称峰Leading Peak:前沿较后沿平缓的不对称峰Ghost Peak: 假峰，并非由试样所产生的峰Baseline Drift:基线漂移Baseline Noise:基线噪音Band Broadening:组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象. 1.2 流动相1.2.1 流动相类型正相液相色谱流动相：一般正相色谱固定相极性大于流动相极性，采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。

常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等），极性小的组分先出柱。

反相液相色谱流动相：一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。