引物的设计原则

设计pcr引物遵循的原则聚合酶链反应（PCR）引物的设计是PCR实验成功的关键因素之一。

以下是一些设计PCR引物时应遵循的原则：1. 特异性：引物应具有高度特异性，以确保它们只与目标DNA序列结合，而不与其他非目标序列结合。

这有助于避免非特异性扩增产物的形成。

2. 长度：引物的长度通常应在18到25个碱基对之间，过长或过短的引物可能导致扩增效率降低。

引物长度的一般建议是20-22个碱基对。

3. GC含量：引物的GC含量应在40-60%之间。

这有助于确保引物的熔解温度适中，提高引物的特异性。

4. 熔解温度（Tm）：引物的Tm是引物与模板DNA结合和解离的温度。

引物的Tm应该在50-65°C之间，以确保在PCR循环中引物能够特异性结合到模板。

5. 避免自相互或异相互二聚体：引物的设计应防止引物之间或引物与模板之间发生意外的二聚体形成，这可能导致PCR反应的不稳定性。

可以使用在线工具预测引物之间和引物与模板之间的二聚体。

6. 避免重复序列：引物应避免含有重复序列，以防止非特异性扩增。

7. 避免剪切位点：引物不应该包含酶切位点，以防止在PCR扩增过程中被酶切。

8. 引物对的选择：在PCR反应中，通常需要一对引物。

这对引物应该相互配合，以确保它们在同一温度下工作，并且扩增产物大小符合实验要求。

9. 考虑引物的位置：引物应设计在目标序列内部，而不是在末端。

这有助于确保扩增产物包含目标区域的完整信息。

10. 检查SNP和突变：引物的设计需要考虑可能存在的单核苷酸多态性（SNP）或突变。

确保引物能够区分目标序列中的变异。

在进行PCR引物设计时，通常使用一些在线工具或软件来辅助，这些工具可以帮助评估引物的特异性和其他参数。

mi引物设计原则1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。

2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。

引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。

3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。

不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。

另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。

5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。

4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。

上下游引物的GC含量不能相差太大。

5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。

Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。

6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。

应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG 值相对较高的引物。

引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。

7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。

8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。

引物序列应该都是写成5-3方向的，Tm之间的差异最好控制在1度之内，另外我觉得扩增长度大一些比较好，500bp左右。

要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。

同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。

mi引物设计原则1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74C，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。

2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3'端相似性较高的序列，否则容易导致错配。

引物3'端出现3个以上的连续碱基，如GG(或CCC也会使错误引发机率增加。

3. 引物3'端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。

不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3'端使用碱基A。

另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。

5'端序列对PCF影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。

4. 引物序列的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。

上下游引物的GC含量不能相差太大。

5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72E左右可使复性条件最佳。

Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm= 4(G+C)+ 2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the n earest n eighbor method) 。

6. AG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。

应当选用3'端4G值较低(绝对值不超过9)，而5'端和中间△ G值相对较高的引物。

引物的3'端的4G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。

7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol )易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。

8. 对引物的修饰一般是在5'端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。

引物序列应该都是写成5-3方向的，Tm之间的差异最好控制在1度之内，另外我觉得扩增长度大一些比较好，500bp左右。

引物设计原则
1.合适的引物长度：引物长度通常在18-30个碱基对之间，过长或过
短的引物都不利于PCR扩增的稳定性。

2.适当的引物GC含量：引物的GC含量应在40%-60%之间，过高或过
低的GC含量都会影响引物和模板DNA的特异性结合。

3.引物特异性:引物应具有高度特异性，可以通过引物序列在数据库
中进行BLAST分析来评估引物的特异性。

4.避免引物自身的二聚体和结构性：引物序列中要避免出现自身二聚
体和结构性，这会干扰PCR扩增的效果。

5.选择高峰结构引物：在引物设计时，优先选择会形成高峰结构的引物，这有助于提高扩增效率。

6.引物末端碱基的特异性：在引物末端碱基选择时，尽量使用能够增
强特异性和避免非特异性扩增的碱基。

7.引物的熔解温度（Tm）：引物的熔解温度直接影响PCR扩增反应的
特异性和效率，应根据目标DNA的长度和序列来确定引物的Tm。

8.避免引物之间的交叉杂交：在多引物PCR反应中，引物之间的交叉
杂交会干扰扩增效果，可以通过软件模拟或实验确认引物之间没有相互杂交。

9.引物序列中避免多个重复碱基：引物序列中的多个重复碱基可能导
致非特异性扩增，应避免在引物序列中出现连续的多个重复碱基。

10.引物设计的可操作性和经济性：引物设计时，要考虑到引物合成
的成本和操作的方便性，选择价格适中的合成方法，并确保引物容易操作。

以上是引物设计的原则和考虑因素，通过合理设计和优化引物序列，可以提高PCR扩增实验的特异性、敏感性和效率，从而获得准确和稳定的实验结果。

我最近合成了几十对引物，，在实战中多多少少有些心得，拿出来给大家分享。

我感觉想把引物合成的比较好，除了前引物和后引物的Tm不能相差太大，我们还要重点考虑以下因素：一、GC% GC含量对于PCR反应来说GC含量在40%—60%，一般50%左右比较合适；而对于测序引物和杂交探针来说GC含量至少应为50%。

产物中GC含量最好大于引物中的GC含量。

二、Degeneracy 多义性当设计多义引物时应尽量减少引物多义性，这样会带来更好的特异性，应尽量避免3末端的多义性，因为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸。

三、3’ End Stability 3 末端稳定性引物稳定性影响它的错配效率，一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5 末端和相对稳定性较弱的3 末端。

如果引物3 稳定性强，有可能在即使5 末端不配对的情况下造成错配，形成非特异性扩增条带（secondary bands）。

而3 末端稳定性低的引物较好的原因是在引物发生错配时，由于3 末端不太稳定引物结合不稳定而难以延伸。

四、GC Clamp GC钳引物与目的位点的有效结合需要有稳定的5 末端。

这一段有较强稳定性的5 末端称为GC钳。

它保证引物与模板的稳定结合。

选择有合适稳定性的引物能在确保不产生非特异性条带的前提下尽量降低退火温度。

五、Secondary Structures 二级结构二级结构是引物设计中必须考虑的一个重要因素。

二级结构能显著影响反应中能与模板正确结合的引物数量，发卡结构的存在能限制引物与目的位点的结合能力，从而降低扩增效率，形成发卡环的引物则不能在PCR扩增中发挥作用。

六、Hairpin 发卡结构发卡结构的形成是由于引物自身的互补碱基分子内配对造成引物折叠形成的二级结构，并由于发卡结构的形成是分子内的反应,仅仅需要三个连续碱基配对就可以形成。

发卡结构的稳定性可以用自由能衡量。

自由能大小取决于碱基配对释放的能量以及折叠DNA形成发卡环所需要的能量，如果自由能值大于0 则该结构不稳定从而不会干扰反应，如果自由能值小于0 则该结构可以干扰反应。

引物设计原则：引物的3’端决定着PCR反应产物的特异性，而5’端限定着PCR产物的长度。

（1）引物序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列。

这样可以减少引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性。

在模板内最好具有单一性，也就是说在模板内部没有错配，特别是3’端，一定要避免连续4个以上的碱基互补错配。

（2）引物的长度一般为15-30 bp，最好在18~24 bp，因为太短易形成错配，降低特异性，而太长也会降低特异性，并且影响PCR反应效率。

引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。

（3）引物的碱基应尽可能随机分布，避免出现数个嘌呤或嘧啶的连续排列，G+C含量在40%~75%之间，且上下游引物序列GC含量的差异不要太大，3’端最后5个碱基最好不要富含GC，特别是连续3个的G或C。

DNA双链形成所需的自由能AG，应该以5’端向3’端递减（4）引物的内部应避免形成稳定的引物二聚体和发夹结构，特别是引物的末端应无回文结构。

上下游引物不应有互补序列，特别是3’端应避免互补，以免形成引物二聚体。

（5）如果以DNA为模板设计引物，产物长度在100—600 bp比较理想。

而以mRNA为模板设计引物时，产物长度在150—300 bp比较理想。

（6）5’ 端对PCR影响不太大，可以引进修饰位点和标记物。

（7）引物3’端的头1~2个碱基会影响T aqDNA聚合酶的延伸效率，从而影响PCR反应的扩增效率及特异性。

一般的PCR反应中，引物3’末端的碱基最好选T、C、G而不选A，A错配时会影响合成效率。

（8）引物3’端应为保守氨基酸序列，即采用简并密码子少的氨基酸如Met、Trp，且避免三联体密码第三个碱基的摆动未知位于引物的3’端。

3’端不应终止于密码子的简并碱基。

十条PCR引物的设计原则：①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

②产物不能形成二级结构。

③引物长度一般在15~30碱基之间。

引物设计原则（汇总）普通引物设计（适用于从载体上扩增模板）：1. 普通引物长度一般在20-30bp之间，常用24-28bp左右以保证基因特异性；2. 下载基因序列到Vector NTI；3. 找到所需安装载体序列；4. 将基因序列的CDS高亮标记；5. 寻找载体序列中常用酶切位点，一般为EcoRI、BamHI、HindIII、XhoI等等，比对检测基因序列中是否有这些位点，有的话舍弃，最后选择两个酶切位点，最好离得远一点，并且最好buffer用一样的。

酶切位点一般是6bp的回文序列；6. 从基因ATG开始往后选择10-20bp均可（我的习惯是27bp-6bp酶切位点-2bp保护碱基-xbp 补齐序列），但最好保证最后两个是G或者C，以减少错配率；7. 将上游酶切位点序列补在A TG前方，并根据载体对框情况补足两者之间的空缺，再根据序列的GC含量和TM值在酶切位点前补足保护碱基，以保证GC和AT的含量不能过高。

注意，所有的补齐不能用到终止密码子；8. 检测上游序列的结构情况，理论上不要太多二级结构以及3’端匹配即可；不过重复的序列也不能太多，以免移码；9. 从下游终止密码子开始向前选择10-20bp均可，但最好保证最后两个是G或者C，以减少错配率；10. 选择complementary sequence，在N端补齐下游酶切位点，如果tag在C端（即下游），则在第9点中应该从终止密码子前开始选择（即舍弃终止密码子），并且下游引物也要对框，如果tag在N端，则下游引物不需要对框，只要在N端加上下游酶切位点，再根据情况加上2个保护碱基，然后检测二级结构，原则上3’端部匹配即可。

不过重复的序列也不能太多，以免移码；11. 将设计好的上下游引物放在一起检测二级结构，原则上3’端部匹配即可。

不过重复的序列也不能太多，以免移码；12. 最后在NCBI的primer Blast网站上比对引物序列，看是否基因特异性的。

1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。

DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。

在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。

2.引物长度一般在15~30碱基之间。

引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。

GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。

上下游引物的GC 含量不能相差太大。

另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。

有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。

若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

4.引物3′端不能选择A，最好选择T。

引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。

5. 碱基要随机分布。

引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。

降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。

尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

6. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。

这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。

引物是在PCR实验中起到核酸扩增的关键作用的短片段DNA序列。

在sybr green染料法中，引物的设计对实验结果有着直接的影响。

为了保证PCR反应的准确性和稳定性，引物的设计是至关重要的。

以下是sybr green染料法的引物设计原则：一、引物长度1. 引物长度一般在18-24个碱基对之间。

过长的引物可能使PCR反应失败，而过短的引物可能导致非特异性扩增。

二、引物Tm值2. 引物的Tm值应该尽量接近。

Tm值的计算可以通过一些软件如OligoCalc或Primer3进行预测。

Tm值的差异过大可能会导致引物的不对称性，从而影响PCR扩增效果。

三、引物的GC含量3. 引物的GC含量应该控制在40-60之间。

GC含量过高或过低都会导致引物与靶序列的亲和性下降，从而影响PCR扩增效果。

四、引物的特异性4. 引物设计时需要保证引物与靶序列的特异性。

在设计引物时，应该避免引物与非靶序列的亲和性过高，以及引物与靶序列的亲和性过低。

五、引物的位点选择5. 引物的位点选择应该避免靶序列中存在的SNP、插入或缺失等多态性位点，以免影响PCR扩增效果。

六、引物的序列和结构6. 引物序列应尽量避免存在二聚体、自反互补等结构，以免影响PCR扩增效果。

七、引物的设计工具7. 在实际引物设计中，可以借助一些专门的引物设计软件，如OLIGO Primer Analysis Software、Primer Premier等，来进行引物设计和预测。

八、引物的实验验证8. 在引物设计完成后，需要进行实验验证，验证引物的效果和特异性，以保证PCR反应的准确性和稳定性。

在sybr green染料法中，引物的设计是影响PCR反应结果的重要因素。

合理设计引物可以提高PCR扩增效率，减少非特异性扩增，保证实验结果的准确性。

在PCR实验中需要严格遵循引物设计原则，选用合适的引物进行实验，最大程度地提高实验的成功率。

九、引物的扩增效率1. 引物的选择也会影响PCR反应的扩增效率。

1.引物设计的基本原则是什么？引物设计的下列原则供您参考：1)引物最好在模板cDNA 的保守区内设计。

2)引物长度一般在15-30碱基之间。

3)引物GC含量在40%-60%之间，Tm值最好接近72℃。

4)引物3′端要避开密码子的第3位。

5)引物3′端不能选择A，最好选择T。

6)碱基要随机分布。

7)引物自身及引物之间不应存在互补序列。

8)引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。

9)引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。

10)扩增产物的单链不能形成二级结构。

11)引物应具有特异性。

2.常用引物设计软件有哪些？常用的软件有Oligo6和Primer Premier5.0。

引物设计软件是根据引物设计的指导意见设计而成。

其实，PCR扩增的成败最关键的是反应模板的制备和反应条件的控制。

引物设计软件的缺点是，有时判断为该基因没有一段区域满足标准引物的要求。

金斯瑞为您提供以下引物设计相关软件：引物计算工具引物设计工具测序引物设计软件Real-time PCR引物设计软件3.文献上找到的引物和探针序列能否直接使用？通常国外的文献可信度比较高，可直接使用；但为了保险起见，最好用blast对引物探针的序列进行必要的验证；或者再进一步用引物设计软件对引物探针的二级结构和退火温度进行分析，这样更有利于您对整个实验的把握。

4.如何计算引物的Tm值？Tm值的概念：DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度，亦即DNA变性过程中，紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度(Tm)。

金斯瑞采用以下方法计算Tm 值：长度为20mer及以下的引物，Tm计算公式为：Tm=4℃(G+C)+2℃(A+T)。

但这个公式只适用于14~20个碱基的引物，引物的TM值还与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲溶液的离子强度等有关。

对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm=0.41(%of GC)–675/L+81.5注：L：引物碱基数；%of GC：引物GC含量；%of GC=GC个数/引物总碱基数5.常见的引物修饰的有哪些?修饰说明3)强烈建议用RNase-free的TE(pH8.0)buffer溶解探针，这样得到的探针溶液更稳定，保存时间更长。

测序引物设计原则测序引物是在DNA或RNA测序实验中使用的一段短链核酸片段，用于在PCR扩增过程中特异性地诱导DNA复制。

引物的设计的好坏直接影响到测序实验的结果准确性和可重复性。

以下是一些常用的测序引物设计原则：1.特异性：测序引物应具有足够的特异性，能够只扩增目标DNA或RNA序列而不引发其他杂交事件。

多个引物对不同的目标序列进行扩增，可以提高特异性。

2.不形成二聚体或高级结构：测序引物不应该形成二聚体或高级结构，以免影响PCR反应的效率。

引物之间的二聚体或高级结构可以通过计算引物的熔解温度和引物之间的相互作用来预测。

3.熔解温度适中：测序引物的熔解温度应该适中，既不能太高也不能太低。

如果熔解温度太高，引物与模板DNA的结合将变得较弱，如果熔解温度太低，引物会与非特异性DNA序列结合。

通常，引物的熔解温度应在50-60摄氏度之间。

4.没有引物互相互补：在一个反应中使用的引物不能互相互补。

因为在引物互相互补的情况下，在PCR反应过程中会发生非特异性扩增，从而导致结果的偏差。

5.引物长度适中：测序引物的长度应该适中，通常在18-30个碱基对之间。

太短的引物可能会导致非特异性扩增，而太长的引物则可能会导致特异性较差。

6.避免引物与引物序列的互补性：引物序列本身也应避免与其他引物序列的互补性。

当引物与自身或其他引物形成互补结构时，会干扰PCR反应，降低扩增效率。

7.避免引物与其他非特异性DNA序列的互补性：除了引物之间互补性的避免外，引物也应避免与其他非特异性DNA序列（如非目标DNA序列中的重复序列）的互补性。

这样可减少非特异性扩增的发生。

8.引物设计要考虑GC含量和碱基组合的均匀性：引物的GC含量和碱基组合的均匀性也会影响PCR反应的效率。

通常，引物的GC含量应在40-60%之间，并且应尽量避免连续的GC或AT序列。

9.引物设计要考虑DNA二级结构：DNA二级结构可以影响引物与模板DNA的结合和扩增效果。

引物设计的要求
以下是 8 条关于引物设计的要求：
1. 特异性得强啊！比如说咱设计的引物就像一把精准的钥匙，只能打开特定的那扇门，而不是乱开其他的门呀。

就像你要找到特定的基因，而不是随便什么都能匹配上。

2. 那稳定性可得有保障呀！就好比盖房子，根基不稳怎么行呢？设计的引物要是不稳定，后面的实验不就全乱套啦。

3. 长度要合适吧！不能太长也不能太短，这不就跟穿衣服一样嘛，尺码得合身呀。

你想啊，太长或太短都不好用呀。

4. 避免引物自身形成二聚体啊！要是它们自己玩嗨了，还怎么好好工作呢？这就像两个人自顾自地抱在一起，就不搭理其他事儿啦。

5. GC 含量也得合适呀！这就好像做菜放盐，多了少了味道都不对。

GC 含量不对，那引物的效果能好吗？
6. 扩增效率得高呀！低效率怎么行？就像跑步，慢悠悠的肯定跑不快呀。

高效的引物才能让实验快速推进。

7. 不能有太多的错配呀！一次错配可能就像千里之堤毁于蚁穴，小问题可能引发大麻烦呀。

8. 要容易合成呀！这就跟买东西一样，要是特别难买，那多烦人呀。

容易合成的引物让实验准备也更轻松呢。

我的观点结论就是：引物设计真的太重要啦，这些要求一个都不能马虎呀！。

PCR引物设计原理及原则PCR引物设计是指在聚合酶链反应（PCR）中使用的引物的设计过程。

PCR引物起到了在PCR扩增过程中特异性识别和引导DNA复制反应的作用。

因此，PCR引物的设计直接影响PCR反应的成功与否。

以下是PCR引物设计的原理及原则。

一、PCR引物设计的原理1.引物长度：引物的长度通常为18-25个碱基对。

引物过短可能导致非特异性引物结合，引物过长可能导致反应条件不佳。

较长引物（20-25个碱基对）通常用于扩增目标DNA较长的片段，而较短引物（18-20个碱基对）通常用于扩增较短的目标DNA片段。

2.引物序列：引物的序列应与目标DNA序列互补，以确保引物与模板DNA的特异性结合。

引物序列应尽量避免重复序列或序列中的碱基。

此外，引物序列的催化部位（3'端）应该具有高度的特异性与模板DNA序列匹配，以确保PCR反应的特异性。

3.引物的Tm值：引物的Tm值是指反应温度下引物和目标DNA序列的熔解温度。

引物的Tm值应相似，通常在56-64℃之间，以保证引物与目标DNA序列结合的特异性和稳定性。

4.引物的GC含量：引物的GC含量对PCR反应的效率和特异性有重要影响。

引物的GC含量应控制在40-60%之间，过高或过低的GC含量可能导致引物结合能力不佳。

二、PCR引物设计的原则1.引物特异性：引物应与目标DNA序列的特异区域互补，以确保特异性扩增。

在设计引物时，应避免引物与非目标序列互补或有任何交叉杂交现象。

2.引物长度：引物长度通常为18-25个碱基对，过短或过长的引物可能导致PCR反应效果不佳。

3.引物序列中避免重复序列：引物序列中避免过多的重复序列，以免引发非特异性引物结合。

4.引物催化部位特异性：引物的催化部位（3'端）应具有高度的特异性与模板DNA序列匹配，以确保PCR反应的特异性。

5.引物的Tm值匹配：引物的Tm值应相似，通常在56-64℃之间，以确保引物在反应温度下与模板DNA序列结合的稳定性。

mi引物设计原则1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。

2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。

引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。

3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。

不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。

另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。

5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。

4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。

上下游引物的GC含量不能相差太大。

5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。

Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。

6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。

应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG 值相对较高的引物。

引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。

7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。

8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。

引物序列应该都是写成5-3方向的，Tm之间的差异最好控制在1度之内，另外我觉得扩增长度大一些比较好，500bp左右。

要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。

同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。

引物设计原则最全汇总1.特异性：引物应与所需扩增的目标序列特异性结合，避免与非目标序列发生非特异性结合，以确保产生准确结果。

2.高GC含量：引物的GC含量应高于50%，以增加引物与目标序列的稳定性和特异性。

3.避免酶切位点：在引物设计过程中，应避免引物与目标序列中的酶切位点重叠，以防止扩增产物的酶切降解。

4.引物长度：引物的长度通常在18至30个核苷酸之间，过长的引物会降低特异性，而过短的引物则可能导致非特异性扩增。

5.引物的Tm值匹配：引物的熔解温度（Tm）应在同一PCR反应中保持一致，以确保引物能同时结合于目标序列并发挥作用。

6.避免互补性：在引物设计过程中，应避免引物之间存在互相互补的情况，以防止互补引物之间的杂交，从而导致错误的扩增结果。

7.引物末端修饰：常用的引物末端修饰包括磷酸化、末端标记和引物的截断，通过这些修饰可以提高引物的选择性和特异性。

8.引物的GC平衡：引物的GC含量应在一定范围内均衡，以避免在PCR反应中产生二聚体或无效的扩增。

9.引物序列的重复性：引物设计中应避免引物序列的重复性，以防止引物产生二聚体或与非目标序列互补结合。

10.引物的独特性：在引物设计中，应确保引物序列在目标基因组中的唯一性，避免与非目标序列存在相似区域。

11.引物的结合位点：引物的结合位点应尽可能位于目标序列的保守区域，以增加引物与目标序列的稳定性和特异性。

12.引物的交叉反应：在引物设计中，应避免引物之间存在交叉反应，即两个不同引物同时与同一目标序列结合。

13.引物与模板序列的一致性：在引物设计过程中，应将引物与目标序列进行比对，确保引物与目标序列的一致性，避免在扩增过程中形成不可扩增的结构。

14.避免自相互补性：在引物设计过程中，应避免引物序列存在自相互补性，防止引物自结合或形成不稳定的结构。

15.引物的GC间隔：在引物设计中，应使引物中的GC核苷酸尽可能均匀分布，以避免形成不稳定的结构。

16.引物的无副产物性：在引物设计过程中，应避免引物产生具有毒性或干扰扩增的副产物。

引物设计原则和注意事项
以下是 6 条关于引物设计原则和注意事项：
1. 嘿，咱可得记住了，引物长度要合适呀！就像穿衣服要合身一样，太长或太短都不行呢。

比如说设计 DNA 扩增的引物，如果长度不合适，那扩增效果能好吗？所以呀，得精心挑选合适的长度呢。

2. 哇塞，特异性可太重要啦！这就好比你要找一个特别的人，可不能随随便便就认定了。

如果引物特异性不强，那岂不是会引发很多不必要的麻烦呀，扩增出一堆杂七杂八的东西。

就像去超市买东西，你得准确找到你想要的那个物品才行呀！
3. 哎呀呀，引物的稳定性也不能忽视呀！这就像盖房子，根基得稳稳的呀。

如果引物不稳定，很容易就出问题了呢。

好比你搭积木，要是不牢固，一下子就塌了，那多郁闷呀！想想看，如果在实验中因为引物不稳定导致结果不准确，多让人懊恼呀！
4. 嘿，你知道吗，GC 含量也是有讲究的哟！这相当于做菜放调料，得恰到好处。

要是 GC 含量不合适，就像菜的味道怪怪的。

比如说在设计引物时，不考虑这个，那最后可能得出的结果就像一道失败的菜肴，让人失望呀！
5. 哇哦，避免引物内部形成二级结构很关键哦！这就好像走路不能有绊脚石一样。

要是引物自己形成了二级结构，那不就像路上有个大坑，走起来困难重重嘛。

你想想，要是在实验中遇到这种情况，多耽误事儿呀！
6. 哎哟喂，引物之间可不能有互补呀！这跟两个人不能相互拆台是一个道理呀。

如果有互补，那可就乱套啦。

就好比一个团队里有人互相捣乱，那工作还能顺利进行吗？在引物设计中一定得杜绝这种情况才行呢！
我的观点结论就是，这些引物设计原则和注意事项真的都超级重要啊，每一个都不能掉以轻心，得好好对待才行呀！。

引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1) 引物长度约为16-30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。

太长则比较浪费,且难以合成。

(2) 引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度Tm＝4(G+C)+2(A+T).(3) 四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。

(4) 引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应, 以减少由于密码子摆动产生的不配对。

(5) 在引物内, 尤其在3'端应不存在二级结构。

(6) 两引物之间尤其在3'端不能互补, 以防出现引物二聚体, 减少产量。

两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。

(7) 引物5'端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。

(8) 引物不与模板结合位点以外的序列互补。

所扩增产物本身无稳定的二级结构, 以免产生非特异性扩增,影响产量。

(9) 简并引物应选用简并程度低的密码子, 例如选用只有一种密码子的Met, 3'端应不存在简并性。

否则可能由于产量低而看不见扩增产物。

一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。

引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产量。

利用紫外分光光度计, 可精确计算引物浓度, 在1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算：X mol/L＝OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)X: 引物摩尔浓度,A、C、G、T: 引物中4种不同碱基个数。

分子生物学实验作的并不多，我的几点经验，1 直接查文献照搬别人成功的引物最省事。

首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。

围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primer length）、产物长度（product length）、序列Tm 值(melting temperature)、ΔG值(internal stability)、引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）、错误引发位点（false priming site）、引物及产物GC 含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。

以使用Oligo 软件分析设计引物为例，总结出以下的要点：1. 引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq 酶的最适温度。

2. 引物3’端的序列要比5’端重要。

引物3’端的碱基一般不用A（3’端碱基序列最好是G、C、CG、GC），因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。

另外引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。

5’端序列对PCR 影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。

3. 引物的GC含量一般为40-60%，以45-55％为宜，过高或过低都不利于引发反应。

有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC 含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火温度的选择。

如果G-C比例超出，则在引物的5’端增加As或Ts；而如果A-T比例过高，则同样在5’端增加Gs或Cs。

但也有认为：原来普遍认为PCR引物应当有50%的GC/AT比率的观点其实是不对的，以人基因组DNA为模板，用81%AT的引物可以产生单一的、专一的、长250 bp，含有70% AT的产物。

PCR引物设计的11条黄金法则1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。

DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。

在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件〔比方DNAman〕比对〔Alignment〕，各基因相同的序列就是该基因的保守区。

2.引物长度一般在15~30碱基之间。

引物长度〔primerlength〕常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。

3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。

GC含量〔composition〕过高或过低都不利于引发反应。

上下游引物的GC含量不能相差太大。

另外，上下游引物的Tm值〔meltingtemperature〕是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。

有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。

假设按公式Tm=4〔G+C〕+2〔A+T〕估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最正确。

4.引物3′端要避开密码子的第3位。

如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

5.引物3′端不能选择A，最好选择T。

引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C 错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。

6.碱基要随机分布。

引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发〔Falsepriming〕。

降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。

尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。