分子生物学实验基础知识

分子生物学实验1. 幸免长时刻的培养，大年夜肠杆菌一样培养12个小时就能够挑取克隆子进行验证了。

主假如因为培养时刻过长，专门是含有Amp抗性的质粒。

重组菌能够或许渗出酶降解Amp，造成平板中局部Amp浓度太低。

其他未重组菌在Amp存在的情形下只是进展受克制而非逝世亡，当Amp浓度降低时就能够进展了。

卫星菌落，因为阳性菌落大年夜量分化抗生素，造成四周区域抗生素浓度降低，则无抗性的菌也进展出来了。

一句话，你的板子培养时刻过长了。

这是amp抗性质粒特有的卫星菌落，确实是又抗性的E col渗出beta内酰胺酶分化四周的amp，从而使没有抗性的e coli进展。

2.3.乙醇能够或许清除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团裸露出来。

Na＋之类的均衡离子能够或许与这些带电基联结合，在沉淀形成部位降低多核苷酸链之间的排斥感化。

是以只有在阳离子的量足以中和裸露的磷酸残基的电荷时才会产生乙醇沉淀。

1.什么缘故用无水乙醇沉淀DNA？用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。

乙醇的长处是能够随便率性比和水相混溶，乙醇与核酸可不能起任何化学反响，对DNA专门安稳，是以是幻想的沉淀剂。

DNA溶液是DNA以水合状况稳固存在，当参加乙醇时，乙醇会夺去DNA四周的水分子，使DNA掉水而易于聚合。

一样实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混淆，其乙醇的最终含量占67％阁下。

因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。

然则加95％的乙醇使总体积增大年夜，而DNA在溶液中有必定程度的消融，因而DNA损掉也增大年夜，专门用多次乙醇沉淀时，就会阻碍收得率。

折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步调要应用无水乙醇。

也能够用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。

一样在室温下放置15－30分钟即可。

2.在用乙醇沉淀DNA时，什么缘故必定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？在pH为8阁下的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加必定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，削减DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当参加的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，如许就造成DNA沉淀不完全，当参加的盐溶液浓度太高时，其后果也不行。

分子生物学实验（1）琼脂糖凝胶电泳进行DNA分离原理琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。

DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。

DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。

具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。

相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子泳动速度不一样。

最前沿的是SCDNA,其后依次是L DNA和OC DNAEB（溴化乙锭）的作用是染色剂，可以插入到DNA的双链中，在紫外线的作用下，会发出白光电泳缓冲液的PH在6~9之间，离子强度0.02~0.05最合适，琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，。

（2）SDS法提取植物基因组DNA的原理利用含高浓度SDS的抽提缓冲液在较高温度（55~65度）条件下裂解植物细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后提高盐浓度（KAc）和降低温度（冰上保温）的办法沉淀除去蛋白质和多糖（在低温下KAc与蛋白质及多糖结合成不溶物），离心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。

（3）DNA回收试剂盒回收DNA原理从琼脂糖凝胶中回收DNA片段．可得到大小一致的DNA片段。

先使凝胶被溶胶液溶解，然后DNA与HiBindTM DNA柱子结合，再从HiBindTM DNA柱子中洗脱出DNA片段。

HiBindTM DNA柱子可以在某种适宜的情况下高效而可逆地结合DNA/RNA，除去蛋白质及其他杂质，而被结合的核酸能很容易地被去离子水或低盐缓冲液洗脱出来。

（4）利用PCR扩增目的基因原理利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的扩人工复制，在很短时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验室所需的遗传物质不再受限于活的生物体。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

分子生物学实验分子生物学实验是一种研究生物体分子结构、功能和交互作用的实验方法。

本文将介绍分子生物学实验的一般步骤和常用技术，并以DNA提取和PCR扩增为例，详细描述了实验的具体步骤和操作。

分子生物学实验一般包括以下几个步骤：实验前的准备、生物样品的采集和处理、核酸提取、酶切和电泳、PCR扩增、蛋白质表达等。

实验前的准备包括实验设计、试剂的准备和设备的调试。

根据实验目的和问题，确定实验设计和具体操作步骤，选择适当的试剂和设备，并对实验条件进行优化。

生物样品的采集和处理是分子生物学实验的基础。

根据研究对象不同，可以采集细胞、组织、血液等生物样品，并进行预处理，如细胞培养、组织切片、离心等。

核酸提取是从生物样品中分离出核酸的步骤。

核酸提取可以使用化学方法或基于特定原理的商业试剂盒。

其中，常用的方法有酚/氯仿法、骨架蛋白法、磁珠法等。

酶切和电泳是分子生物学实验中常用的技术手段。

酶切是通过限制性内切酶对DNA进行特异性切割，生成特定大小的DNA片段。

电泳是利用电场对DNA片段进行分离和检测，可通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行。

PCR扩增是一种重要的分子生物学实验技术。

PCR通过不断循环的变性、退火和延伸过程，在体外扩增DNA序列。

PCR 需要DNA模板、引物、核苷酸和聚合酶等关键试剂。

PCR扩增过程包括初始变性、循环扩增和最终延伸。

扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和检测。

蛋白质表达是研究蛋白质功能和结构的重要实验手段。

常用的蛋白质表达系统包括原核表达系统和真核表达系统。

表达载体经过构建和转染后，利用细胞的表达机制使蛋白质在体内合成。

总之，分子生物学实验是研究生物体分子结构和功能的重要方法。

通过实验前的准备、生物样品的采集和处理、核酸提取、酶切和电泳、PCR扩增、蛋白质表达等步骤，可以获得关于生物体分子结构和功能的有价值的信息。

分子生物学基本实验操作1.DNA提取：DNA提取是分子生物学中的基础实验操作，目的是从生物组织或细胞中提取出纯净的DNA样品。

常用的DNA提取方法包括酚氯仿法、盐法和商业化提取试剂盒。

该实验操作通常包括细胞破碎、蛋白质去除、DNA沉淀和洗涤等步骤。

2.PCR：聚合酶链反应（PCR）是分子生物学中常用的方法，用于扩增特定的DNA片段。

PCR通过加入DNA模板、引物、碱基和聚合酶，利用循环反应的方式在体外合成特定序列的DNA。

PCR通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。

3.凝胶电泳：凝胶电泳是一种分离和分析DNA、RNA和蛋白质的常用方法。

通过将待测样品加载到凝胶中，然后通过电场使DNA、RNA或蛋白质在凝胶中迁移，可以根据迁移速度和分子大小进行分离和定性。

4. Western blot：Western blot是一种用于检测特定蛋白质的方法。

该方法通过将待测样品进行电泳分离，然后将蛋白质转移到膜上，并用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后再用染色剂或化学发光来检测目标蛋白质的存在。

5.DNA克隆：DNA克隆是将DNA片段插入到载体DNA中的过程，用于研究和重组DNA。

常用的DNA克隆方法包括限制性内切酶切割、连接酶反应和转化。

通过将DNA片段插入载体中并转化至宿主细胞，可以大量复制目标DNA并随后进行研究。

6.基因测序：基因测序是确定DNA或RNA序列的方法，用于分析基因组、转录组和序列变异。

常用的基因测序方法包括链终止法（Sanger测序）和下一代测序（NGS）。

通过测序，可以获取DNA或RNA的序列信息，并进一步研究基因功能和变异。

7.基因表达分析：基因表达分析通过检测RNA水平来研究基因的表达情况。

常用的方法包括实时定量PCR、Northern blot和转录组测序。

这些方法可以定性和定量地研究基因的表达水平，并帮助解析基因调控和信号通路。

这些是分子生物学的一些基本实验操作。

当然，随着技术和方法的不断发展，分子生物学领域中还有许多其他的实验操作，用于研究生物分子结构和功能。

基因组学研究方法分子生物学实验的基础技术基因组学研究是分子生物学领域中的一个重要分支，它致力于研究生物体基因组的组成、结构、功能和调控等方面。

为了深入了解和揭示生物体基因组的奥秘，科学家们提出了一系列的实验方法和技术来开展基因组学研究。

本文将对基因组学研究方法中的一些基础技术进行介绍和解析。

一、DNA提取技术DNA提取是基因组学研究的第一步，也是最为基础的技术之一。

DNA提取的目的是获得样本中的DNA分子，并使其保持完整和纯净。

常用的DNA提取方法有酚-氯仿法、离心柱法以及磁珠法等。

在DNA提取过程中，关键的步骤包括细胞裂解、蛋白质沉淀和DNA分离等。

二、PCR技术PCR（聚合酶链式反应）是一种高度敏感、高效、简便的基因组学研究技术。

它可以通过扩增DNA分子，使之在数量上呈指数级增加。

PCR技术的基本原理是不断重复三个步骤：变性、退火和延伸。

PCR可以用于基因克隆、基因型分析、突变检测和DNA测序等多个研究领域。

三、基因测序技术基因测序是基因组学研究中最为核心和关键的技术之一。

它可以对DNA序列进行准确的测定，揭示生物体基因组的结构和功能。

目前常用的基因测序技术主要有Sanger测序和新一代测序技术。

新一代测序技术的发展使得基因组学研究进入了一个全新的时代，大大提高了基因测序的速度和精准度。

四、蛋白质组学技术蛋白质组学研究是基因组学研究的重要组成部分，它关注生物体中蛋白质的表达、结构、功能以及相互作用等方面。

蛋白质组学技术包括二维凝胶电泳、质谱分析、蛋白质互作研究等。

这些技术可以帮助科学家们了解蛋白质组的整体特征，并揭示蛋白质在生物体中的重要功能。

五、基因编辑技术基因编辑技术是现代基因组学研究中的一项重要技术，它可以对生物体基因组进行精确的编辑和改造。

常用的基因编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、TALENs以及ZFNs等。

这些技术的发展使得基因组学研究具有更大的灵活性和可操作性。

通过DNA提取、PCR、基因测序、蛋白质组学技术以及基因编辑技术等基础技术的应用，基因组学研究取得了长足的进步。

分子生物学实验基础知识分子生物学是在生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科，在核酸、蛋白质分子水平研究发病、诊断、治疗和预后的机制。

其中基因工程（基因技术，基因重组）是目前分子生物学研究热点，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物，使微量的研究对象达到分析水平，是研究基因调控和表达的方法，也是分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。

转化（trans formation）、转染、转导、转位等是自然界基因重组存在的方式，也是人工基因重组常采用的手段。

基因重组的目的之一是基因克隆（gene clone），基因克隆可理解为以一分子基因为模板扩增得到的与模板分子结构完全相同的基因。

使需要分析研究的微量、混杂的目的基因易于纯化，得以增量，便于分析。

外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化（transformation），以噬菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染（transfection）。

利用载体（噬菌体或病毒）把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导（transduction）。

一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位（transposition），这些游动的基因叫转位子。

一、基因工程的常用工具（一）载体载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。

载体有质粒（plasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。

载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。

质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完全裸露，很少有蛋白质结合。

质粒有严紧型和松弛型之分。

严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。

而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。

《生化与分子生物学》实验讲义天津医科大学生物医学工程系2005年实验一自抗凝血中提取哺乳动物细胞基因组DNA一、实验目的1、了解核酸的基本特性。

2、掌握DNA提取和鉴定的方法。

二、实验原理核酸的分离与提取是分子生物学研究中很重要的基本技术，核酸样品的质量可能直接关系到后续实验的成败。

核酸包括DNA、RNA两种分子，在真核细胞中都是以与蛋白质相结合的状态存在（DNA与组蛋白形成核小体，再折叠缠绕成染色体），真核生物基因组DNA 为双链线性分子，存在于细胞核内。

基因组DNA的提取需经过DNA的释放（破膜）、DNA与蛋白质的分离，DNA的沉淀等过程。

分离纯化核酸的总原则：1、保证核酸一级结构的（核苷酸序列）的完整性，全部的遗传信息均储存在一级结构中。

2、排除其它分子的污染。

a)对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子。

b)生物大分子：蛋白质、多糖和脂质。

c)其它核酸分子：RNA.三、实验试剂1、TKM缓冲液10 mmol/L Tris-HCl pH 7.6 （Tris 三羟甲基氨基甲烷）10 mmol/L KCl2 mmol/L EDTA4 mmol/L MgCl22、TE缓冲液10 mmol/L Tris-HCl1 mmol/L EDTA pH 8.03、10％SDS4、饱和氯化钠四、实验步骤1、取0.5ml EDTA抗凝的全血于清洁的1.5ml Eppendorf离心管中。

2、加入0.5ml TKM缓冲液，13μl Triton X-100（终浓度为1.2％），颠倒混匀。

在台式离心机上离心，5,000rpm×10分钟。

（低渗破红细胞膜）。

3、倾去上清液，在离心管中加入1.0ml TKM缓冲液，混匀后离心，5,000rpm ×10分钟，重复步骤3两次。

（清洗）4、于沉淀中加入200μl TKM缓冲液和15μl 10％SDS（终浓度为0.7％），混匀后于55℃保温20分钟。

（破白细胞膜）注：此步中可加入少量蛋白酶K。

分子生物学基础实验实验一质粒DNA的小量制备一、实验原理载体:要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。

载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。

作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA 链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。

细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。

质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb 之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。

质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。

它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。

质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。

前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。

每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。

后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。

通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。

小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。

在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。

实验一：质粒DNA的提取——碱裂解法1、质粒是细菌细胞内一种自我复制的闭合环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代。

（在一定条件下也会可逆的整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代）2、质粒DNA的基本特征：(1) 自主复制性：能独立于染色体DNA外自主复制；(2) 可扩增性：严紧型复制-复制1-5个拷贝；松弛型复制-复制数十个拷贝；(3) 可转移性：通过细菌结合作用从一个宿主细胞转移到另一个宿主细胞；(4) 不相容性：具有相似复制子结构特征的两种不同质粒不能稳定地存在于同一受体细胞内。

3、质粒的三种构型(1)超螺旋DNA；(2) 开环DNA ；(3) 线状DNA 。

4、LB培养基成分：酵酵母浸提物，胰蛋白胨，N a Cl5、溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris•H Cl组成.(保护、缓冲)①葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的机械剪切作用,防止破坏质粒. (保护作用)②EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对质粒分子的降解作用。

（保护作用）③Tris•HCl 能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用）溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与NaOH 组成(裂解、变性)①SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性（裂解细胞和蛋白质变性作用）②NaOH（PH>12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用）溶液III：HAC(乙酸)和KAC(乙酸钾)组成的高盐溶液(复性，分离)①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。

②KAC会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。

6、DNA如何保存？加入适量TE缓冲液混匀，-20℃保存7、提取质粒DNA实验中要去除哪些杂质，如何去除？答：含有的杂质有蛋白质、染色体DNA和不稳定的大分子RNA，往培养液中加入溶液I II III 混合使染色体RNA和蛋白质变性，通过离心除去不稳定的大分子RNA，加等量的酚\氯仿\异丙醇检测是否还有杂质，最后再加异丙醇使质粒DNA沉淀。