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一株发酵床接种用枯草芽孢杆菌的分离鉴定刘涛;黄保华;石天虹;魏祥法;艾武;武彬;李桂明;曹顶国【摘要】从发酵床养殖垫料堆体中分离筛选到一株细菌,再次接种锯末、稻壳与鸭粪的混合物,与空白对照组相比,堆积时间缩短3天,单位发酵垫料对粪污的处理能力增加,垫料在使用28～49天间,氨气排放降低30%～50%.经16S rDNA序列比较,该菌为枯草芽孢杆菌.【期刊名称】《山东农业科学》【年(卷),期】2010(000)011【总页数】4页(P71-73,76)【关键词】发酵床;枯草芽孢杆菌;接种剂【作者】刘涛;黄保华;石天虹;魏祥法;艾武;武彬;李桂明;曹顶国【作者单位】山东省农业科学院家禽研究所,山东,济南,250023;山东省农业科学院家禽研究所,山东,济南,250023;山东省农业科学院家禽研究所,山东,济南,250023;山东省农业科学院家禽研究所,山东,济南,250023;山东省农业科学院家禽研究所,山东,济南,250023;山东省农业科学院家禽研究所,山东,济南,250023;山东省农业科学院家禽研究所,山东,济南,250023;山东省农业科学院家禽研究所,山东,济南,250023【正文语种】中文【中图分类】Q939.11+8发酵床养殖技术起源于日本和巴西的自然养猪法,主要是将锯末、稻壳等材料接种生物菌种后堆积发酵后用做垫料,使粪污分解产生的臭味物质转化为菌体固定下来,达到降低养殖舍内有害气体浓度、减少养殖污染排放的目的。
选择合适的菌种是发酵床是否能够成功应用的基础与前提,只有使发酵床垫料中具有生理特性的菌种达到一定数量,才能保证发酵垫料的使用效果。
粪便与发酵床的周边环境中同样存在多种微生物,必须向发酵床中接种合适的菌种才能达到减少污染排放的目的。
其中,最值得关注的是两个方面:第一,接种的微生物必须具备旺盛的蛋白质代谢能力。
谢金防等 (2008)[1]指出动物粪便中各种营养成分十分丰富,放置在自然环境中时,会因微生物快速生长代谢而放出大量恶臭气体,因此提出需要筛选的菌株必须具备较高的蛋白酶产生活力,以促进有机物降解,加速粪污腐熟进程,同时还有利于消除致臭物质,减轻对环境的污染[1]。
枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种广泛存在于自然环境中的细菌，具有重要的应用价值，被广泛应用于农业生产中的抗病、增产、改善土壤等方面。
因此，对枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法进行研究具有重要意义。
以下将介绍枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法。
一、枯草芽孢杆菌分离方法：1. 样品采集：根据研究需要，选择合适的样品，如土壤、植物组织、水等。
采集样品时要注意避免外源性污染，尽量避免使用过多的抗生素。
2. 样品处理：将采集到的样品进行处理，如土壤样品需要经过悬浮液稀释法进行样品制备，植物组织需要进行消毒处理等。
3. 分离培养基选择：根据枯草芽孢杆菌的生长特性，选择合适的分离培养基。
通常可以选用液体培养基（如TSA、LB培养基）或固体培养基（如TSA、PDA培养基）。
固体培养基还可以添加适当的抑菌剂来抑制其他细菌的生长。
4. 分离培养：将样品制备好后，均匀涂布在选择的培养基上，然后进行培养。
液体培养基需要在适当的温度和速度下进行摇床培养，固体培养基需要静置培养。
培养时间一般为24-48小时。
5. 子培养：在培养基上出现孤立的菌落后，用离心管吸取菌落，再划线接种到新的培养基上，进行连续传代培养。
一般选择形态特征明显、菌落形状规则的菌落进行子培养。
6. 纯化：通过连续传代培养，最终获得纯种的枯草芽孢杆菌。
纯化的细菌可以通过形态观察、生理生化特性检测等方法进行初步鉴定。
二、枯草芽孢杆菌鉴定方法：1. 形态观察：观察菌落形态、色素、菌体形态等。
枯草芽孢杆菌的菌落通常呈乳白色或灰白色，形状为圆形或不规则形。
2. 胞内酶活性检测：通过检测枯草芽孢杆菌的胞内酶活性来鉴定，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等。
常用方法为利用不同培养基的酶基质进行相关酶活性检测。
3. 生理生化特性检测：包括对枯草芽孢杆菌的耐温、耐酸碱性、氧化还原反应等生理生化特性的检测。
4. 分子生物学鉴定方法：利用分子生物学方法，如PCR、16S rRNA基因测序等来鉴定枯草芽孢杆菌。
枯草芽孢杆菌的分离纯化和初步鉴定方案3班第3组周三15:30-17:00周四08:30-09:50组长：刘晨阳组员：吕宛容，韩晴，董春燕，邢爽，高倩倩，薛琳琳，邵宇婷，吴子侥枯草芽孢杆菌的分离纯化和初步鉴定一、目的要求1、掌握分离、纯化枯草芽胞杆菌的方法。
2、掌握如何鉴别所得菌是否为枯草芽胞杆菌的方法。
二、实验原理芽孢杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。
单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。
无荚膜，周生鞭毛，能运动。
革兰氏阳性菌，芽胞0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽胞形成后菌体不膨大。
菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。
其分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。
由于其能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。
但是许多芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。
例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。
又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。
芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。
无荚膜，周生鞭毛，能运动。
革兰氏阳性菌，有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。
其菌落变化很大，芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。
在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。
菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。
芽孢杆菌能产生芽孢，芽孢具有较强的抗高温能力在沸水中加热不会失去生理活性，但是不能产生芽孢的细菌会失去活性，因而得到芽孢菌属，经过进一步的分离纯化及生理生化鉴定得到芽孢杆菌。
山东农业科学 2010,11:71~73,76Shandong Agricu ltural Sc iences收稿日期:2010-07-27基金项目:国家科技支撑计划项目 沿南四湖鸭鹅养殖废弃物最低入湖排放技术研究与示范 (2007BAD87B05);济南市科技局高校院所自主创新项目 肉鸡无臭养殖技术的研究与推广应用 (200906024-3);济南青年科技明星计划(2010年第一批) 环保养殖垫料原位发酵生态模型的构建及推广应用 项目资助。
作者简介:刘 涛(1982-),男,研究实习员,主要从事微山麻鸭的选育及饲养模式研究工作。
E -m a:i li u t aoj n @163 co m *通讯作者,E -m a i :l w ubin791008@163 co m一株发酵床接种用枯草芽孢杆菌的分离鉴定刘 涛,黄保华,石天虹,魏祥法,艾 武,武 彬*,李桂明,曹顶国(山东省农业科学院家禽研究所,山东济南 250023)摘 要:从发酵床养殖垫料堆体中分离筛选到一株细菌,再次接种锯末、稻壳与鸭粪的混合物,与空白对照组相比,堆积时间缩短3天,单位发酵垫料对粪污的处理能力增加,垫料在使用28~49天间,氨气排放降低30%~50%。
经16S r DNA 序列比较,该菌为枯草芽孢杆菌。
关键词:发酵床;枯草芽孢杆菌;接种剂中图分类号:Q 939 11+8 文献标识号:A 文章编号:1001-4942(2010)11-0071-04Isolati on and Ide ntification of a Strai n of Bacill us subtilis forInocul ati ng i n Ferm e ntation BedLIU Tao ,HUANG Bao -hua ,SH I T ian-hong ,WE I X iang-fa ,A IW u ,WU B i n *,LI Gui-m ing ,CAO D ing-guo(Institute of Poultry Science ,Shandong A cade my of Agr ic u ltural Sciences,J inan 250023,China )Abst ract A bacteriu m w as iso lated fro m culture-padd i n g p ile body i n fer m entati o n bed Then itw as in oculated i n the m ixture o f sa wdus,t r i c e husk and duck ex cre m en t The resu lts sho w ed that the accum ulation ti m e w ith bacteriu m decreased by 3days than that w ith no bacteri u m The treat m ent capacity of unit fer m ented padd i n g to feces i n creased The re l e ased a mm on ia decreased by 30%~50%w hen the fer m ented padd i n g w as used for 28~49days The 16S r DNA sequence co m parision resu lts show ed that t h e bacteri u m w as B acillus s ubtilisK ey w ords Fer m entati o n bed ;Bacillus subtilis ;Inoculant 发酵床养殖技术起源于日本和巴西的自然养猪法,主要是将锯末、稻壳等材料接种生物菌种后堆积发酵后用做垫料,使粪污分解产生的臭味物质转化为菌体固定下来,达到降低养殖舍内有害气体浓度、减少养殖污染排放的目的。
选择合适的菌种是发酵床是否能够成功应用的基础与前提,只有使发酵床垫料中具有生理特性的菌种达到一定数量,才能保证发酵垫料的使用效果。
粪便与发酵床的周边环境中同样存在多种微生物,必须向发酵床中接种合适的菌种才能达到减少污染排放的目的。
其中,最值得关注的是两个方面:第一,接种的微生物必须具备旺盛的蛋白质代谢能力。
谢金防等(2008)[1]指出动物粪便中各种营养成分十分丰富,放置在自然环境中时,会因微生物快速生长代谢而放出大量恶臭气体,因此提出需要筛选的菌株必须具备较高的蛋白酶产生活力,以促进有机物降解,加速粪污腐熟进程,同时还有利于消除致臭物质,减轻对环境的污染[1]。
第二,接种的微生物必须适应发酵床的生理生化环境。
发酵床温度在40~50!,堆积时最高超过70!,在此条件下大量微生物营养细胞死亡,只有耐受高温的微生物能够生存或者转化为休眠的孢子等待合适的温度萌发[2]。
因此,进行发酵床接种菌的筛选时,必须考虑该菌对高温环境的耐受性。
笔者从发酵垫料的堆积物中筛选具有高效粪污降解能力的优势菌株,有望获得适应现有发酵床使用环境的接种剂。
1 材料与方法1 1 材料鲜鸭粪由山东省农业科学院家禽研究所鸭舍现场采集,鸭粪含水量80%左右,干燥后粗蛋白含量20%~24%。
稻壳、锯末购自济南周边农村。
大肠杆菌DH5 为山东省农业科学院家禽研究所禽病诊断与免疫重点实验室保存。
细菌染色体提取试剂盒购自Ta K a Ra公司,UN I Q-10柱式DNA凝胶回收试剂盒购自上海生工,其它试剂均为分析纯。
1 2 游离氨气测定方法垫料中锯末与稻壳的比例为1∀1,加入发酵菌剂后,调节含水量在50%~60%,添加垫料干重30%的鸭粪后搅拌均匀,堆积厚度为80c m,室温20~30!。
控制蛋鸭饲养密度,每天向垫料中排放垫料干重10%的鸭粪,每天均匀翻动一次,每周测定垫料附近空气的氨气含量。
垫料剖面挖成后,纵向每隔10c m取垫料样品,每层采用氨气比色管法测5点。
即将垫料取样后,立即置于500m l烧杯中,密封放置1h,以氨气测定管测定烧杯内空气中氨气含量。
1 3 优势菌的筛选及计数取发酵垫料1g,在超净工作台中,加10m l 双蒸水浸泡10m i n,无菌纱布过滤除渣,后将浸泡液采用10倍比递增稀释至10-8,将10-1## 10-8的不同稀释度取100 ,l分别在LB培养基上均匀涂板,每个稀释度重复3次,37!恒温培养36h后,进行细菌计数。
1 4 优势菌16S r DNA的提取与序列测定方法细菌16S r DNA通用引物,由济南博尚生物有限公司合成(P1:5∃-AGAGTTTGATCCTGGCT C AG-3∃;P2:5∃-GGTTACC TTGTTACGACTT-3∃)。
发酵床优势菌以LB液体培养基扩大培养,采用细菌染色体提取试剂盒提取染色体DNA,以其为模板,以P1、P2为引物进行PCR扩增。
PCR 扩增条件:94!预变性2m i n;然后94!变性1 m in,48!退火50s,72!延伸2m in,共30个循环,最后于72!延伸10m in。
以UN I Q-10柱式DNA凝胶回收试剂盒对PCR产物电泳条带进行回收和纯化。
回收产物与P MD18-T载体体外连接,之后转化感受态细胞大肠杆菌DH5 ,将阳性菌送上海博亚生物技术有限公司测序。
2 结果2 1 优势菌的筛选堆积过程中,从垫料表面到50c m处温度随垫料深度而升高,而整个垫料主体发酵温度在28 ~70!之间。
长时间堆积发酵能充分杀灭垫料中的有害微生物。
堆积完成后,未检测到沙门氏菌,大肠杆菌检测浓度为100个/g,主要检测到一种菌,通过对该发酵垫料进行梯度稀释,检测到该种菌的浓度为105个/g土。
图1 堆积发酵5天后不同深度垫料的温度变化2 2 优势菌的生长特点在平板上的菌落形态为表面不规则、边缘不整齐的白色菌落。
取单菌落接种到LB培养基中,37!震荡培养10h,后取50 l接种在4m l LB培养基中,在不同温度下震荡培养6h,测OD600值。
在堆积发酵的过程中,该菌在较高温度下,图2 温度对优势菌和大肠杆菌生长速度的影响72山东农业科学 2010年具有良好的生长与存活能力。
在20~44!之间,发酵物中大肠杆菌的量高于优势菌,而在44~54!之间,发酵物中优势菌的量高于大肠杆菌(图2)。
而在75~80!下保温12h ,该菌的孢子仍能够萌发,因此,适应堆积发酵的高温环境。
2 3 优势菌的鉴定经PCR 可测得优势菌16S r DNA 的大小为1500bp(图3),与目的片段大小一致。
测序结果如图4所示,与GenB ank 中编号为gb |FJ876834 1|的枯草芽孢杆菌EBS05菌株的核糖体RNA 序列相似性在99%以上,因此判断本研究分离得到的发酵床优势菌株为枯草芽孢杆菌。
注:M 为DNA M arker 2000;1为优势菌基因组DNA图3 发酵优势菌基因组PCR产物电泳结果图4 优势菌的16S r DNA 测序结果2 4 枯草芽孢杆菌作为发酵剂的应用效果采用分离到的枯草芽孢杆菌作为发酵剂与无接种剂的对照组相比,堆积发酵过程中,堆体升温速度显著提高,升温至50!所需时间缩短3天左右;以该方法堆积获得的垫料在28~49天时,氨气的排放量降低30%~50%(图5)。
3 结论与讨论好的发酵菌剂能够耐受堆积发酵的高温环境,并且获得生长优势。
在发酵垫料的使用过程中,具有较高的生长速度和蛋白降解能力,能够有效缩短堆积时间,提高发酵垫料的使用效果。
菌体的筛选通常在需要降解(下转第76页)73第11期 刘 涛等:一株发酵床接种用枯草芽孢杆菌的分离鉴定的年份,小绿叶蝉越冬成虫存活率会受到影响,造成来年春季虫口数量明显减少。
另外,由于崂山茶区春季气温回升缓慢,气温偏低,小绿叶蝉的发育速率慢,繁殖代数少,不能很快形成较大的种群。
进入7月份以后,气温较高,适合小绿叶蝉的生长发育,经过几代的繁殖,在8月下旬或9月上中旬,形成较大的种群,构成全年发生高峰期。
进入10月,气温下降,茶树叶片老化,不利于害虫发生,成虫开始寻找越冬场所。
本研究仅仅调查了茶树越冬后小绿叶蝉在田间的发生规律,未涉及到该虫的越冬问题。
据报道,该虫以成虫主要在茶丛内或茶园周围的草丛内越冬[2],但在研究中发现,早春在茶树落叶和草丛中很难找到越冬虫态。
据王连翠等(2006)[5]报道,在沂蒙山区,茶小绿叶蝉(Em p oasca flavescens )以成虫在落叶、树皮缝、杂草或低矮绿色植物中越冬,翌春桃、李、杏发芽后出蛰,飞到树上刺吸汁液,经取食后交尾产卵,卵多产在新梢或叶片主脉里。
