降解木质素混合菌种的选育和应用

细菌降解木质纤维素的研究进展戴芸芸;钟卫鸿【摘要】木质纤维素结构的复杂性导致其生物降解需要多种微生物协同完成。

细菌具有生长快、结构简单、适宜酸碱性条件生长等特点，在降解木质纤维素方面具有潜在应用前景。

介绍了近年来报道的降解木质纤维素的细菌种类，综述了细菌对木质纤维素的降解机理及木质纤维素含量的测定方法。

%The biodegradation of lignocellulose needs the participation of synergism of multi-microorganisms due to its complexed natural structure.Bacteria have potential application prospects in degradation of lignocellu-lose due to their characteristics,such as rapid growth,simple structure,suitable for acid and alkaline conditions. The types of bacteria for degrading lignocellulose in recent years are introduced,and the degradation mechanism and detection methods for content of lignocellulose are summarized.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2016(033)006【总页数】6页(P11-16)【关键词】细菌;木质素;纤维素;生物降解【作者】戴芸芸;钟卫鸿【作者单位】浙江工业大学生物工程学院，浙江杭州 310032;浙江工业大学生物工程学院，浙江杭州 310032【正文语种】中文【中图分类】TQ352.78;X172生物质作为一种可再生资源，其开发利用是解决目前人类能源危机的重要途径之一，但是其主要成分天然纤维质原料的结晶性和木质化限制了其可利用性[1]。

纤维素降解菌的分离和筛选1.实验目的：1.掌握纤维素降解菌的的分离和筛选的方法2.学会会培养基的制备3.再次了解菌落的形态2.实验原理：从美术楼后面树林中取适量的土壤，用无菌水将得到的样品经适当稀释, 在37℃下培养1d后，稀释10-6、10-7、10-8三个浓度，分别接种于鉴别培养基中培养, 每组3个平行，在37℃下培养2-3 d，然后进行初筛，重复以上步骤，直至获得纯的菌株。

最后镜检。

3.试验方法：1. 取样先从树林中取10g土壤(10—15cm深)。

用灭菌的塑料袋盛装。

2．饥饿培养秤取10g土壤，置于250ml的装有90ml无菌水的锥形瓶中，摇匀，在37℃下培养1d。

3.梯度稀释所需仪器：试管（8支）、洗耳球、移液管。

需要先经高压蒸气灭菌的仪器：试管（每只内装9ml蒸馏水）、移液管。

用移液管从饥饿培养土壤液中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的试管中充分混匀。

然后用移液管从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1,10-2,10-3, 10-4,10-5,10-610-7,10-8不同稀释度的土壤溶液。

4.选择培养○1刚果红培养基的制备所需要的仪器有：500ml锥形瓶、天平、药匙、玻璃棒、电炉、200ml培养基，用2层纱布加棉花做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层报纸，用线绳扎紧，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。

灭菌后，倒9个灭菌平板，凝固后待用。

○2涂布平板将上述已倒培养基的9个平板底面分别用记号笔写上10-6、10-7、10-8 3种稀释度（每个稀释度划3个平板）。

然后用移液管分别由10-6、10-7,10-8三管土壤稀释液中各吸取0.2ml对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌涂布器在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5~10min，使菌液吸附进培养基。

38℃倒置培养2-3d，至菌落长出，菌落周围将会出现透明圈。

○3菌落形态观察菌圈直径（0.3~0.6cm）○4划线分离PDA待凝固后，从以上涂布的9个平板当中取出1个菌落周围的透明圈比较大的平板。

第23卷　第1期中　南　林　学　院　学　报V o l.23　N o.1　2003年2月JOU RNAL O F CEN TRAL SOU TH FOR ESTR Y UN I V ER S IT Y Feb.2003　Ξ[文章编号]1000-2502(2003)01-0079-07木质素生物降解及其应用研究进展陈立祥1,章怀云2(1.湖南农业大学动物科技学院,湖南长沙410128;2.中南林学院,湖南株洲412006)[摘　要]　木质素生物降解可广泛应用于造纸工业、环境保护、饲料工业、酒精发酵以及生物肥料等领域.综述了木质素及木质素降解酶系的分子结构、木质素降解的机理、降解木质素的微生物种类、木质素降解酶类的分子生物学特征等方面的研究进展以及木质素降解在生产中的应用情况.[关键词]　生物科学;生物工程;木质素;生物降解;造纸工业;环境保护;综述[中图分类号]　Q55;TQ351.01+3 [文献标识码]　ARecen t Research Advances on the L ign i nB iodegrada tion and Appl ica tion sCH EN L i2x iang1,ZHAN G H uai2yun2(1.Co llege of A ni m al Science and T echno logy of H unan A griculture U niversity,Changsha410128,H unan,Ch ina;2.Central South Fo restry U niversity,Zhuzhou412006,H unan,Ch ina)Abstract:T h is review introduces our recent research p rogress of lignin bi odegradati on and its app licati ons.It analyzes and illustrates the structure of lignin and lignin2degrading enzym es,the mo lecular bi o logy of ligno lytic o rganis m s and the enzym es they create,and the app licati on of lignin2bi odegradati on to paper industry and environm ental p ro tecti on.Key words:eco logical science;eco logical engineering;lignin;bi odegradati on;paper2m ak ing industry;environm ental p ro tecti on;review木质素是植物细胞壁的重要组成部分,约占植物体干质量的20%,在自然界中含量仅次于纤维素.据估测,全球每年可产生约6×1014t木质素,主要以造纸工业废水和农作物废弃秸杆形式存在[1].与纤维素相比,木质素的组成单位、空间结构都要复杂,这种结构的复杂性决定了降解木质素需要多种酶的协同作用.在自然界中能彻底降解木质素的生物种类不多,在降解木质素的微生物中,真菌起主要作用,但其降解速度大都缓慢,这样应用传统的微生物方法来降解木质素就会遇到许多困难.而分子生物学的发展为解决这一问题提供了新的途径,应用DNA重组技术能使木质素降解酶相关基因进行克隆表达,这是该领域近二十年来的一个研究热点[2～4].1　木质素的结构与木质素降解酶1.1　木质素的结构木质素的基本结构是由苯丙烷( C—C—C)通过醚键和碳碳键联结而成的复杂的、无定形的三维空间结构,依苯丙烷的侧链取代基不同,它又可分为松柏醇、芥子醇和对香豆素3种不同形式,其结构式如下:Ξ[收稿日期]2002210212[作者简介]陈立祥(1963-),男,湖南邵阳人,副教授,博士研究生,现从事分子生物学研究.CH OHCHCHOCH 3O H CH OHCHCHOCH 3O H OCH 3　CH OHCH CHOH 松柏醇 香豆素 芥子醇(con ifergl alcoho l ) (coum argl alcoho l ) (sinapyl alcoho l )各基本单元连接的方式主要有Β2O 24,Β25,Β21等,图1为木质素局部结构[5].图1　一段木质素的结构F ig .1　The structure of lign i n不同的植物种类,植物不同的生长阶段,其木质素的含量和成分是不同的,由于重复单元间缺乏规律性和有序性,迄今为止,人们仍没能把整个木质素分子以其完整的状态分离出来,因此,它是天然高聚物中结构最难搞清楚的物质[6].1.2　木质素降解相关酶系木质素的降解酶系是非常复杂的体系,目前对它的研究较多,认为最重要的木质素降解酶有3种:木质素过氧化物酶(L ign in p erox idase L i p )、锰过氧化物酶(M anganese p erox idase M np )和漆酶(L accase ).除此之外,还有芳醇氧化酶(A ryl 2alcoho l ox idase AAO )、乙二醛氧化酶(Gyoxal ox idase GLOX )、葡萄糖氧化酶(Guco se 2l 2ox idase )、酚氧化酶、过氧化氢酶等都参与了木质素的降解或对其降解产生一定的影响.1.2.1　L i p 和M np [4,7,8]L i p 和M np 都是带有糖基的胞外血红素蛋白,又称血红素过氧化物酶(H em e Perox idase ).L iP 是一种糖蛋白,由十条长的蛋白质单链和一条短的单链构成;M nP 也是一种糖蛋白,其分子同样由十条长的蛋白质单链和一条短的单链构成(见图2).08中　南　林　学　院　学　报第23卷L i p 的活性中心由一个血红素基组成,另外还有两个起稳定结构作用的Ca 2+.M np 活性中心基本上与L i p 相同,但还有M n 2+的参与(图3).两者的主要区别是:L iP 的碳端是在血红素基的两个丙酸根之间,而M nP 的碳端却与血红素基分开,另外,M nP 有5个二硫键,而L iP 只有4个二硫键,M nP 的前4个二硫键与L i p 的相同,M nP 的第5个二硫键是在蛋白质的碳端,推测它与M n 2+的活性中心有关.图3　L i p 和M nP 的活性中心结构F ig .3　The active cen tral stractureof L ip and M nP(a )L igninase peroxido se L i p (b )M anganese eroxidase M nP图2　M nP 的分子结构F ig .2　M olecular structure of M np1.2.2　漆酶(EC ,1、10、3.2)漆酶是含铜的多酚氧化酶,分漆树漆酶和真菌漆酶两大类,主要来源于生漆和真菌[9].由于漆酶的含糖量较高,难以得到X -衍射构象图,所以它的三维结构尚不清楚,但已证实,漆酶中的铜离子在催化氧化反应中起决定作用,可以催化芳香环支链C Α2C Β键断裂,并能将酚类氧化成醌[10].1.2.3　其它酶类除L iP 、M nP 和L accase 外,还有葡萄糖氧化酶、乙二醛氧化酶、芳醇氧化酶以及过氧化氢酶等也参与了木质素的降解,但到目前为止,人们还不完全清楚每种酶在木质素降解中的具体作用[11].图4　木质素主要代谢途径F ig .4　M ajor pathways i n lign i n m et abolis m1.3　木质素降解的机理一般认为,L iP 、M nP 、L accase 和H 2O 2产生系统构成降解木质素的主要成分.L iP 氧化非酚型化合物,引起C Α2C Β芳香环断裂,L accase 氧化酚型化合物,M nP 既可氧化酚型结构也可氧化非酚型结构.通过L iP 、M nP 、L accase 以及活性氧的产生系统,引起芳香离子自由基的产生,C Α2C Β键的断裂及C Β氧化,芳香环开裂,单甲氧基芳香物氧化,醌、氢醌的形成,这些产物再经不同的代谢途径代谢形成CO 2[1],其途径如图4所示.2　降解木质素的微生物种类及相关酶的分子生物学特性2.1　降解木质素的微生物种类在自然界中,木质素的完全降解是真菌、细菌及相应微生物群落共同作用的结果,其中真菌起着主导作用.根据木材腐朽类型,降解木质素的真菌——木腐菌(w ood 2ro t fungi )可分为白腐菌、褐腐菌和软腐菌3类.白腐菌(W h ite 2ro t fungi )是一种丝状真菌,它首先降解木质纤维素中的木质素,不产生色素,是最主要的木质素降解真菌.目前,研究得较多的白腐菌有:黄孢原毛平革菌[12]P hanerochete ch ry sosp orium 、烟管菌[13]B erkand era ad usta 、变色栓菌[14]T ham etes versicolor 、糙皮侧耳[15]P leu rotus ostrea tus 、D icho m itus squa lens[16]、Cerip orriop sis subver m isp ora[17]等.这些菌多属于担子菌.褐腐菌b row n 2ro t fungi 亦属于担子菌,但它首先降解木质纤维素中的纤维素,并分泌黄褐色的色素使木材黄褐变,然后再缓慢降解木质素.软腐菌(soft 2ro t18第1期陈立祥等:木质素生物降解及其应用研究进展28中　南　林　学　院　学　报第23卷fungi)多为子囊菌和半知菌,它一般只能分解纤维素,木质素则被完整地保留下来,由于后两者它们分解木质素的能力不强或没有,因此,对其研究报道也较少.除此之外,还有一些以放线菌为主的原核生物,如链霉菌属S trep to m y ces、节杆菌属A rth robaeter、小单孢菌属M icro m onosp ora和诺卡氏菌属N oca rd ia等以及细菌中的厌氧梭菌C lostrid ium、假单孢菌属P seud o m onas、不动杆菌属A cinetobacter和芽孢杆菌属B acillus等也能产生木质素降解酶,但这些原核生物所分泌的木质素降解酶都是胞内酶,这就决定了其在木质素降解菌的研究中处于一个相对次要的地位[6].2.2　木质素降解酶类的分子生物学特征自20世纪80年代人们从黄孢原毛平革菌P.ch ry sosp orium中分离出木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶后[14,18],人们对该菌种做了大量的研究工作,目前该菌种已成为研究木质素生物降解的模式真菌.随着DNA 重组技术的发展和应用,对木质素降解酶类的研究进入了一个新的阶段,目前除P.ch ry sosp orium外,人们已 从几十种微生物中克隆出了木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶的编码基因,并在大肠杆菌[19]、酵母[20、21]等异源生物中得到活性表达.2.2.1　基因组研究发现,在P.Ch ry sosp orium菌丝体细胞中,可以随机分散多个细胞核,担孢子则含有2个等同的核,有性孢子的形成可以是同宗配合或异宗配合,P.Ch ry sosp orium基因组大小估计为4.4×107bp,其中20%～30%是线粒体和核糖体DNA,其担孢子呈现染色体长度多态性[6].通过对已克隆的木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的同功酶基因进行DNA序列分析发现,木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶同功酶之间有较高的同源性(见表1).表1　L i p和M nP基因序列的相似性Table1　Genes sequence si m ilar ity am ong L ig and M nP过氧化物酶023456789101112131415161718192021P.c.lipA198.880.670.289.887.690.689.596.084.560.259.161.059.756.358.455.655.938.141.338.3 P.c.lipB280.970.290.087.990.989.896.284.560.259.161.059.756.358.455.655.938.341.638.3 P.c.lipC364.476.880.177.677.679.282.656.154.457.456.455.253.053.453.740.442.040.2 P.c.lipD469.570.970.268.468.978.356.459.162.961.659.662.260.360.836.742.137.5 P.c.lip E581.986.884.688.783.959.158.559.057.255.756.554.054.236.439.937.5 P.c.lip F686.588.486.885.759.459.059.658.655.756.056.458.439.943.939.9 P.c.lipG792.889.883.256.958.358.657.253.355.755.155.336.741.337.5 P.c.lipH889.082.657.758.158.156.952.755.754.255.137.541.338.1 P.c.lip I983.959.959.460.860.256.857.655.655.637.841.638.3 P.c.lipJ1066.567.769.670.865.261.559.659.646.646.644.1 p.r.L PG31157.559.459.757.557.753.956.438.143.141.4B.a.L PO-11258.657.256.057.957.356.434.736.336.0T.v.L PG I1386.173.873.466.668.237.939.236.6 T.v.L PG I I1475.172.264.166.338.440.338.4 T.v.V L G I1565.657.558.936.938.337.2 T.v.L PGV I1667.968.537.839.437.0 T.v.PGV1779.243.048.545.8 T.v.M PG I1840.044.443.8 P.c.M nP-11974.169.3 P.c.M nP-12077.3 P.c.M nP-2210P.c L i p(P.c li pA到P.c.L i pJ)为黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶;P.c M np(P.c.M np-1和P.c.M np-2)为黄孢原毛平革菌锰过氧化物酶;T.v.L PG(T.v L PG I和T.v L PG )为变色栓菌木质素过氧化物酶;B.a.L P-1为烟管菌木质素过氧化物酶;P.r.L PG3为射脉菌木质素过氧化物酶.2.2.2　木质素过氧化物酶基因家族[22]现在已知,至少有10个相近的基因家族对P .ch ry sosp orium 木质素过氧化物酶(L i p )进行编码,定名从li pA 至li pJ ,从其它真菌如T ram etes versicolor 、B jerkand era ad usta 和P h lebia ad usta 中也克隆出了几个L iP 同功酶基因.L iP 基因序列是高度保守的,其氨基酸序列有53.0%～98.9%的相似性,每个L iP 基因编码一个成熟蛋白质产物,此蛋白质产物由22～28个氨基酸残基的引导肽所引导的343～345个氨基酸所组成,成熟蛋白质的分子量为36360～36607,表现分子量38000～43000,推测表现分子量中的6%～13%为糖基部分,L i p 编码区G +C 所占比例大约为60%～65%,而非编码区G +C 大约为44%～49%.P .ch ry sosp orium 的L i p 均含有8个或9个内含子,每个大小为49～78bp ,在L i p 基因的5′端非编码区包含一个TA TA 框(-66～-81bp )和一个CAA T 顺序(-107～-228bp )的调节序列.2.2.3　锰过氧化物酶基因家族[23]和L iP 一样,M nP 同功酶也是由多基因编码的,P .Ch ry sosp orium 的M nP I 编码一个含357个氨基酸的成熟蛋白及一个含21个氨基酸的引导肽.M nP I 的内含子为6个,大小在57～72bp 之间;M nP II 的内含子为7个,大小在50～55bp 之间,M np 5′非编码区包括一个TA TA 单元(-81bp )及3个反向CAA T 单元.2.2.4　L accase 基因家族漆酶也是由一个结构相近的基因家族所编码,目前有许多真菌的L accase 基因已经被克隆和测序,经分析发现,在不同真菌的L accase 基因之间DNA 序列的同源性较低[24].2.2.5　外源性表达及调控木质素降解酶基因的转录和翻译情况比较复杂,如P .Ch ry sosp orium 的L iP 基因转录明显受培养基中碳、氮水平的调节,M nP 的产生有赖于M n 2+的浓度,且M n 2+的调节是在转录水平上进行的,漆酶的表达调控在种间有显著的不同.在异源表达上,总的来说表达水平都不是太高.但最近一个构巢曲霉A sp erg illus n id u lan 的漆酶基因在米曲霉A .ory z ae 上重组成功并有较高活性表达,且该菌株已用于商业生产[25],这可为木质素酶类基因工程的应用提供参考.3　木质素降解在生产实际中的应用木质素是人类可再生的纤维资源之一,使木质素转变为有用的物质,变废为宝,这将对我国的造纸工业、环境保护以及可持续发展等均具有深远的意义.3.1　在造纸工业上的应用[26～28]目前,在造纸工业上通常采取硫酸盐法(以氢氧化钠和硫酸钠使醚键断裂)和亚硫酸盐法(通过磺化反应使木质素变成水溶性物质)来除去木质素,使纤维素从木质素的禁锢中释放出来.但这些方法污染大、能耗高、利用率低.利用使木质素降解的真菌或直接利用木质素降解酶使木质素降解可克服传统工艺的缺点.3.1.1　生物制浆由于白腐真菌和木质素降解酶类能选择分解植物纤维原料中的木质素,因此,在化学制浆前先进行生物预处理,可以降低化学药品的用量及能源消耗.美国农业部林产研究所(FPL )将选出的菌种直接接种到新伐木段,让其在运输和储存过程中发挥作用,这样可使前后阶段的机械制浆的能耗降低11%～27%,并且经过预处理木材造出的纸张撕裂和抗张强度性能均优于对照组.尽管用白腐真菌直接接种木片进行预处理呈现出多种效益,但如何缩短生物处理周期是大规模工厂化生产需要解决的问题.3.1.2　生物漂白白腐真菌或木质素降解酶类直接作用于纸浆中残余木素,使之发生降解溶出,从而可提高纸浆的白度.Fn jita 等人将白腐菌Izu -154用于阔叶树木材硫酸浆的漂白预处理5d ,纸张白度提高了20%左右,Kapp 值下降11.6～12.4,同时可减少漂白剂的用量.38第1期陈立祥等:木质素生物降解及其应用研究进展48中　南　林　学　院　学　报第23卷3.1.3　造纸废水处理白腐真菌对制浆造纸工业废水处理的研究,多集中在含氯漂白废水.林鹿等人对草类、蔗渣等的氧化碱抽提、次氯酸盐漂白(CEH)的废水用白腐真菌处理后发现,白腐菌能有效消除废水毒性,降低COD、BOD、AOX 值及色度.但它同样存在处理时间长等工业化生产所面临的问题.3.2　在环境保护方面的应用研究发现,白腐真菌及漆酶对许多化合物如多环芳烃、DD T、酚类、氯代芳香化合物、染料、农药等含有芳香结构的污染物都有较强的降解能力[29].在国外,P.Ch ry sosp ium已成功用于修复有机氯农药污染的土壤,漆酶用于染料工业污水的处理[30],在处理工业污水方面,漆酶及能产生漆酶的真菌已显示出它特有的作用.3.3　在其它方面的应用木质纤维素中木质素的优先降解是制约纤维素利用的关键,利用木质素降解酶处理农作物废弃的秸秆(全球产量约20亿t以上,我国占5亿多t[6]),对于饲料工业、酒精发酵工业以及生物肥料工业等方面都将具有重要意义.4　结束语木质素的生物降解在许多应用领域有着广阔的前景,但由于一些基础研究如木质素的空间结构、每种木质素酶的作用机理以及木质素酶基因结构及其表达调控等尚未完全研究清楚,所以,离实际应用还有一段距离.正因如此,木质素的生物降解也一直是世界性研究热点和难题.相信在不久的将来,随着蛋白质分离、纯化、空间构象测定技术的发展,随着对木质素酶催化机理认识的加深,以及应用分子生物学技术对木质素降解酶相关基因结构、表达调控机理等深入研究,这些问题将会逐一解决.[参　考　文　献][1]　冀珍芳,石淑兰.木质素的微生物降解[J].广西轻工业,2002,15(1):4-5.[2]　D aniel Cullen.R ecent advances on the mo lecular genetics of lignino lytic fungi[J].J.of B i o techno logy,1997,53:273-289.[3]　R eddy C A.A n overview of the recent advances on the physi o logy and mo lecular bi o logy of lignin peroxidases of P hanerochacetech ry sosp orium[J].J.of B i o techno logy,1993,30:91-107.[4]　M ichael H.Go ld and M argaret A lic.M o lecular bi o logy of the lignin2degrading basidi om ycete P he m erocheete ch ry sosp orium[J].M icrobi o logical R eview 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微生物分解木质素的机制和应用当人们想到微生物，往往会联想到细菌和病毒。

然而，微生物还有另一个十分重要的作用，那就是分解木质素。

木质素是一种非常复杂的有机化合物，它是构成木材主要部分的聚合物。

木材中的木质素影响了木材的颜色、形状和硬度。

由于木质素的结构复杂，其降解也非常困难。

微生物的出现和进化，使得这一难题得到了一定程度的解决。

一、微生物分解木质素的机制1. 溶菌酶的作用溶菌酶是一种水解木质素的酶类，与细菌和真菌都有密切关系。

在存在溶菌酶的微生物中，木质素产生的底物可以通过微生物的代谢途径，转化为有机酸和气体等形式释放出来。

因此，溶菌酶的存在可以促进木质素的生物降解。

2. 氧化酶的作用氧化酶是一类氧化还原酶，可以用于将木质素中的芳香环酚类以及羟丙基、羟甲基等短链糖类转化为各类醛酮。

这些产物是微生物能够利用的底物，从而促进木质素的分解。

3. 木素脱甲基酶的作用木素脱甲基酶是一类针对木素分子中的甲基进行去除的酶。

这类酶主要存在于真菌和细菌中。

经过这种酶的处理，木质素中的芳香环甲基被去掉，从而使木质素更容易分解。

二、微生物分解木质素的应用1. 软木板软木板是以树皮为原料，经过加工处理得到的一种材料。

在制备过程中，木质素被微生物分解，从而使软木更加柔软、耐用。

2. 生物燃料生物燃料是以生物质为原料生产的一种燃料，它可以是来自植物、动物或者微生物的有机废弃物，如纤维素、木质素等。

通过微生物分解木质素，可以产生甲烷、CO2等气体，这些气体可以用于发电和供暖，从而成为一种清洁、可再生的能源。

3. 污染物降解一些化工废弃物和污染物，如苯、甲苯等芳香环化合物，由于分子结构复杂，难以通过传统的化学方法进行降解。

微生物通过分解木质素的作用，可以分解这些污染物，从而提供一种清洁的化学降解方法。

总的来说，微生物分解木质素机制的研究，不仅可以增加对微生物本身生态环境的理解，还可以为人们提供多种有益的工业应用，使得木质素等有机废弃物得到更加有效的利用。

高效木质素降解菌的复合诱变选育摘要:从实验室保存的9株白腐真菌中筛选出1株降解玉米秸秆木质素性能优良的菌株YJ-9-1,在第14天时,其木质素降解率为41.74%｡经ITS-5.8S rDNA序列同源性及系统发育树分析,初步鉴定该菌为变色栓菌(Trametes versicolor)｡对YJ-9-1进行紫外微波复合诱变,获得1株高效木质素降解菌株3-8,并利用其对玉米秸秆中的木质素进行降解｡结果表明,在第14天时,菌株3-8对玉米秸秆木质素的降解率为48.43%,比出发菌株提高了16.03%｡关键词:白腐真菌;木质素降解;复合诱变Screening of High Efficient Lignin-Degrading Strains by Complex Mutagenesis Abstract: One white-rot fungus YJ-9-1 with strong ability of degrading ligin was obtained from 9 strains through solid state fermentation (SSF). After 14 days of SSF, the degrading rate of this strain on lignin was 41.74%. Based on its sequence alignment and phylogenetic analysis, YJ-9-1 was identified as a strain of Trametes versicolor. Using YJ-9-1 as starting strain, a strain 3-8 with high efficient lignin degrading ability was obtained through UV and microwave mutagenesis. Then strain 3-8 was used to degrade lignin in corn straw through SSF. The results showed that its degrading rate on lignin reached 48.43% on the 14th day, higher than 16.03% of YJ-9-1.Key words: white-rot fungus; lignin-degrading; complex mutagenesis生物质是一种可再生并能转化为乙醇､生物柴油等燃料的能源物质,其中木质纤维素作为全球储存量最大的生物质,是最具前景的能源物质之一[1]｡秸秆作为一种农业废弃物,是木质纤维素的重要来源,在世界各地都有着丰富的储量,仅在中国每年就有大约2亿t的秸秆产出,但大部分都被直接焚烧或者丢弃,这不仅浪费资源而且造成环境污染[2]｡木质纤维素主要组分包括纤维素(30%~50%),半纤维素(15%~35%)和木质素(10%~30%)[3]｡由于这些大分子物质的相互缠绕,木质纤维素在自然条件下很难被降解,将它转化为生物质能源则需要经过多步的处理｡首先是前处理,主要去除木质素和半纤维素,目前的处理方法有物理､化学､生物以及综合处理法,其中,生物法由于环境友好､反应温和､成本低廉等优点而备受关注｡生物法中白腐真菌是目前已知的降解木质素性能最好的微生物[4]｡国内外学者已在这方面进行了大量的研究,但筛选出的菌株普遍存在木质素降解率低､降解周期长等问题｡如张杰等[5]筛选出1株秸秆降解白腐真菌P5,15 d后木质素降解率为11.47%;Zhang等[6]筛选出1株竹基质选择性降解菌Perenniporia sp.,木质素降解率只有8.66%,而且发酵时间为4周;杜海萍[7]分离出1株糙皮侧耳菌,木质素降解率仅有16.41%｡从实验室已有的木质素降解菌出发,通过紫外微波复合诱变筛选得到1株木质素降解率较高的白腐真菌“3-8”,在发酵14 d时木质素降解率提高到48.43%,该研究可为生物制浆和饲料等行业提供参考｡1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种来源实验室保存的9株白腐真菌｡1.1.2 玉米秸秆取自成都市双流县,经粉碎过40目筛,备用｡1.1.3 培养基PDA固体培养基:去皮土豆200.0 g,葡萄糖20.0 g,KH2PO4 3.0 g,MgSO4·7H2O 1.5 g,去离子水1 000 mL,琼脂18.0 g｡初筛培养基:PDA固体培养基+0.01%愈创木酚､PDA固体培养基+0.01%苯胺蓝､氯化锰筛选平板(MnCl2·4H2O 0.115 g, 琼脂18.0 g, 去离子水1 000 mL)｡复筛培养基:准确称取玉米秸秆粉5.0 g,装入250 mL的三角瓶,再加入9 mL去离子水｡1.2 研究方法1.2.1 实验室木质素降解菌的筛选不同菌株经PDA固体培养基活化后,用无菌打孔器制成直径为1 cm菌块,接入固态发酵培养基,每瓶接入两个菌块,30 ℃恒温培养14 d后,剥去基质上菌皮,抽滤烘干后测定失重率和木质素含量,计算不同菌株对玉米秸秆木质素的降解率｡1.2.2 紫外微波复合诱变1)诱变程序｡出发菌株→单孢子悬浮液的制备→紫外诱变→初筛→微波诱变→初筛→复筛→稳定性检验｡2)诱变｡单孢子悬浮液的制备:用无菌水洗下斜面培养的孢子于三角瓶中,用玻璃珠充分振荡至孢子均匀分散,制成1×106个/mL的单孢子悬浮液｡紫外诱变致死率曲线的制作:取10 mL浓度为1×106个/mL的单孢子悬浮液于直径为9 cm的平皿内,置于紫外灯下(30 W,距离30 cm)分别照射2､4､6､8 min｡照射结束后,取不同照射时间处理的菌液各0.1 mL, 适当稀释后分别涂布于初筛培养基上,30 ℃培养7 d,计数活菌,然后以照射时间为横坐标, 致死率为纵坐标绘制致死率曲线｡微波诱变致死率曲线的制作:取经紫外诱变筛选出的正突变菌株重新培养长出的孢子,制成1×106个/mL单孢子悬浮液,置于20 mL厌氧管中,每管5 mL,用600 W微波辐射1､2､3 min｡辐射结束后,取不同辐射时间处理的菌液各0.1 mL,适当稀释后分别涂布于初筛培养基上,30 ℃培养7 d,计数活菌,然后以辐射时间为横坐标,致死率为纵坐标绘制致死率曲线｡1.2.3 诱变菌株筛选经过诱变后,从初筛培养基上挑取变色圈直径与菌落直径的比值大及显色圈色泽深的菌落,然后于复筛培养基中进行固态发酵,测定木质素降解率｡1.3 测定方法1.3.1 DNA提取及测序DNA提取方法参考《分子生物学实验指南》[8]｡DNA 提取成功后,以ITS-1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS-4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)为引物进行PCR扩增(反应条件:预变性94 ℃､5.0 min;变性94 ℃､1.0 min,复性55 ℃､1.0 min,延伸72 ℃､1.5 min,35个循环;最终72 ℃延伸10.0 min),回收纯化后的PCR产物并连接到PMD19-T载体上,然后转化入大肠杆菌感受态细胞内培养,经细胞裂解确定目标片段已连接在载体上后,交由华大基因研究中心进行测序｡1.3.2 系统发育树的构建将测序结果提交到美国国立生物技术信息中心(NCBI)GenBank数据库中进行Nucleotide blast比对,选取同源性较高的14株菌株ITS-5.8S rDNA序列用Bioedit软件进行Clustalw比对,用MEGA软件采取邻位相邻法构建系统发育树｡1.3.3 秸秆失重率､木质素降解率的计算及木质素含量的测定木质素降解率=失重率=木质素含量的测定参考文献[9]采用Van Soest方法测定｡2 结果与分析2.1 菌种筛选结果经过14 d的固态发酵,各菌株对玉米秸秆木质素的降解情况见表1｡其中YJ-9-1和YJ-68B-1的木质素降解率超过40.00%,分别为41.74%和40.33%,YJ-9-1最高,且其于秸秆上生长时,长势较好｡因此,综合来看,YJ-9-1是9株菌株中降解木质素性能最优良的菌株,故选取其为目标菌株进行下一步的诱变选育｡2.2 YJ-9-1菌株的ITS-5.8S rDNA序列分析经测序,YJ-9-1的ITS-5.8S rDNA序列片段长度为652 bp,序列提交GenBank进行核酸序列Blast比对｡选取14株同源性较高的菌株进行系统发育树的构建,结果如图1所示｡由图1可知,YJ-9-1与Trametes versicolor T3遗传距离最近,由此初步判定YJ-9-1为变色栓菌(Trametes versicolor)｡2.3 紫外诱变时间的确定结果按照试验方法建立的紫外诱变致死率曲线如图2所示｡一般诱变时间长正突变率较高,同时负突变率也较高｡因此,选择存活率为20%左右的时间即8 min作为后续紫外诱变时间｡将8 min诱变处理的菌液涂布于含愈创木酚的初筛培养基上,表现好的菌株接入含苯胺蓝的初筛培养基以及氯化锰筛选平板中再筛选,于3种初筛平板中都表现好的菌株,最终进入下一步的微波诱变｡初筛培养基中愈创木酚的变色(变红棕色)与漆酶的产生有关,漆酶产生越多颜色越深｡苯胺蓝的脱色与木质素过氧化物酶及锰过氧化物酶的产生有关,木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶越多脱色越快,脱色圈也就越大｡氯化锰的变色(变红棕色)与锰过氧化物酶的产生有关,锰过氧化物酶产生越多颜色越深｡漆酶､木质素过氧化物酶及锰过氧化物酶被公认为是木质素降解的关键酶,白腐真菌就是靠分泌这些酶来降解木质纤维素从而获得生存所需的碳源和能源[10]｡诱变菌在初筛培养基上的表现好坏是通过测定变色圈直径与菌落直径的比值大小及观察变色圈的深浅来判定的｡2批紫外诱变后,在初筛菌株中发现3株菌株的变色圈直径与菌落直径的比值和变色圈色泽均优于出发菌株｡因此,这3株菌进入接下来的微波诱变｡2.4 微波诱变时间的确定结果按照试验方法建立的微波诱变致死率曲线见图2｡选择致死率为80%左右的时间即1 min作为后续微波诱变时间｡紫外诱变选出的3株菌株经过3批微波诱变后初筛,发现其中6株菌株的变色圈直径与菌落直径的比值和变色圈色泽均优于出发菌株(表2);并且,变色圈初筛结果还表明,该6株菌株的变色圈直径/菌落直径的比值明显大于经单一诱变的菌株,且变色圈颜色也比其他突变株更深,因此选择它们进入固态发酵的复筛试验｡复合诱变常常具有明显的协同诱变效果,虽然伴随着致死率的增加(与单一诱变相比),但从中获得某一方面遗传特性大幅度提高的诱变菌株的可能性也大大增加｡从表2中还可看出,3种初筛培养基中几乎所有菌株在氯化锰筛选平板上的生长状况都很差,菌株不仅长得慢,而且产生的变色圈也很小,但是,不同的菌株在氯化锰筛选平板上的表现还是有较为明显的不同,如菌株3-1可以长满整个氯化锰筛选平板,而其他菌株的菌丝圈直径大多不超过5.0 cm｡但是菌株3-1在氯化锰筛选平板上的变色圈却小于菌株3-8｡同类研究中,一般较少使用氯化锰筛选平板,但从此次的试验结果可看出氯化锰筛选平板可以作为木质素降解菌诱变的初筛培养基｡2.5 玉米秸秆固态发酵进行复筛的结果将分离出的6株白腐真菌菌株以玉米秸秆为基质进行复筛｡在30 ℃下培养14 d,复筛结果见表3｡由表3可知,6株菌株中,菌株3-8的木质素降解率最高,14 d达到48.43%,比出发菌株提高了16.03%｡并且在接下来的稳定性试验中(3次重复的固态发酵),其木质素降解率都保持在48.00%左右｡固态发酵全过程中,菌株3-8的菌丝生长均较出发菌株快,这为其高的木质素降解率提供了前提条件,同时也表明,快的菌丝生长速度与高的木质素降解率密切相关｡其他5株菌株虽然在初筛培养基中表现较好,但在复筛时,木质素降解率却没有提高,这从某种程度上说明初筛只是很粗略的筛选,不能正确体现诱变菌的潜力,只有当初筛与复筛结合,才能既避免初筛的不确定性,又免去直接进入复筛的费时费力｡3 结论从实验室保存的白腐真菌中筛选出1株木质素降解率较高的菌株YJ-9-1,在培养14 d时,其木质素降解率为41.74%｡经ITS-5.8S rDNA序列分析,初步鉴定为变色栓菌(Trametes versicolor)｡对YJ-9-1进行紫外-微波复合诱变,根据致死率曲线,紫外诱变选取致死率80%左右的时间8 min,微波诱变选取致死率80%左右的时间1 min,2批紫外诱变后初筛得到3株突变菌株,再将其进行微波诱变,初筛后得到6株突变菌株,然后对它们进行玉米秸秆固态发酵的复筛,得到1株木质素降解率提高16.03%的菌株3-8,14 d的固态发酵后,其木质素降解率达到48.43%;在3次重复的固态发酵试验中,稳定性较好,木质素降解率保持在48.00%左右｡试验结果表明,复合诱变能将单独诱变的效果协同起来,达到更优的诱变效果｡参考文献:[1] SANCHEZ C. 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一株木质素降解菌的筛选鉴定及其在堆肥中的应用尹静;刘悦秋;于峰;蔡建超;刘天月【摘要】为提高农林废弃物堆肥中木质素的降解效率,促进堆肥腐熟,提高堆肥品质,研究筛选了一株高效木质素降解菌株,并应用于猪粪与枯枝落叶混合堆肥.研究结果表明,筛选菌株YZC3对木质素的降解率达到79.2％,可同时产生木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶,其中锰过氧化物酶活性最强,为16.4 U/mL.经形态学和ITS分子鉴定,确定YZC3其为粉红粘帚霉(Clonostachys rosea strain).将其应用于堆肥中,可延长高温持续天数6d和二次发酵天数3d,堆肥结束时T值降为0.59,而对照堆肥为0.86,显著促进了堆肥腐熟.YZC3还有助于提高堆肥产品中腐植酸含量,减少堆肥中全氮的损失,是一种极具应用价值的堆肥菌剂.【期刊名称】《中国土壤与肥料》【年(卷),期】2019(000)003【总页数】7页(P179-185)【关键词】木质素降解菌;筛选;鉴定;堆肥【作者】尹静;刘悦秋;于峰;蔡建超;刘天月【作者单位】北京农学院园林学院,北京 102206;北京农学院园林学院,北京102206;北京农学院园林学院,北京 102206;北京农学院园林学院,北京 102206;北京农学院园林学院,北京 102206【正文语种】中文木质纤维素是地球上分布最广，含量最丰富的可再生高能聚合物，每年再生的木质纤维素折合成能量相当于人类年消耗能量的20倍［1］。

木质素主要存在于木材和秸秆中，是农林产业的主要副产物，每年全世界产量约1 500亿t，是储量巨大的潜在绿色资源［2］。

然而，目前全世界对农林废弃物的利用率却很低，每年因农林废物焚烧、填埋等造成巨大的环境污染和资源浪费［3］。

木质素是一类由5-羟基松柏醇、对香豆醇、芥子醇和松柏醇形成的酚类聚合物［4］，主要包围于管胞、导管和木纤维等纤维束细胞及厚壁细胞外［5］，由于它没有明确的结构，很难直接对其进行转化和利用，但可以通过降解将其转化为酚类化合物等低分子量的化合物，为资源转化和利用提供更多的可能［6］。

XX本科毕业设计（论文）题目：木质素细菌降解酶的分离、筛选与优化学院：专业：学号：学生姓名：指导教师：职称：二O一年月日摘要生物质原料作为地球上数量最大的可再生资源之一，逐渐受到人们的重视。

目前，采用木质素细菌降解酶作为预处理微生物，正成为新的研究方向。

本实验以南京紫金山土壤为原料，通过稀释平板法，固体培养基培养以及试管斜面保种等步骤，筛选得到纯种细菌。

在筛选细菌过程中，挑选部分采用液体培养基培养，得到细菌降解酶，并测其漆酶和锰过氧化物酶的酶活力，结果发现酶活力都不高。

最后通过正交试验优化菌28的产酶条件，发现在pH为3、Cu2+ 浓度为5mol/100mL、Mn2+浓度为1mg/100mL的条件下，细菌产漆酶量最大。

关键字：木质素；稀释分离；酶活；优化AbstractAs one of the largest number of renewable resources on the earth, biological raw material has been paid more and more attention. At present, biological pretreatment used by bacteria lignin degrading enzymes is becoming a new kind of research interest. In this paper, raw material was obtained the soil in the Nanjing Zijin Mountain, and then finally lignin degradation bacterium were isolated. in test tubes which were preserved in refrigerator with suitable centigrade by means like dilution，screening and solid nutrient medium. During the process in screening,we selected some bacteria to be fostered in liquid nutrient medium and measured their laccase enzymes activity and manganese peroxidase activity.The result indicated that both laccase enzymes activity and manganese peroxidase activity were not high .At last, we tried to optimize the requirement that the bacteria No.28 need to produce enzymes by orthogonal test,and discovered that the bacteria could produce the largest quantity of Lac in the condition where the pH was 3,and the consistence of Cu2+was 5mol/100mL,and the consistence of Mn2+was 1mg/100mL.Key words: lignin，isolation，enzymes activity，optimization目录第一章绪论 (1)1.1 本课题的目的、意义 (1)1.2 本课题的研究内容 (1)1.3 文献综述 (1)1.3.1 木质素的生物降解 (1)1.3.2 木质素降解菌 (2)1.3.3 国内外研究概况 (2)1.3.4 木质素降解酶及其作用机理 (3)1.3.5 微生物产木质素降解酶的影响因素 (4)1.3.6 木质素降解酶的应用 (5)第二章实验部分 (5)2.1 实验仪器 (5)2.2 实验试剂及材料 (6)2.3 实验内容与步骤（第一部分） (6)2.3.1 菌种土壤的采集 (6)2.3.2 培养基的制备 (6)2.3.3 细菌的初步纯种分离 (8)2.3.4 细菌的纯种分离 (8)2.3.5 纯种细菌的保种 (8)2.3.6 液体接种 (9)2.4 实验内容与步骤（第二部分） (9)2.4.1 漆酶（Lac）酶活的测定 (9)2.4.2 锰过氧化物酶(Mnp)酶活的测定 (11)2.4.3 木质素提纯 (11)2.4.4 产酶条件的优化 (12)第三章实验数据及分析 (13)3.1 漆酶酶活 (13)3.2 锰过氧化物酶活 (14)3.3 正交试验漆酶酶活 (16)3.4 正交试验锰过氧化物酶活 (18)3.5 数据与分析 (18)3.6结论与展望 (20)参考文献 (21)致谢 (24)第一章绪论1.1 本课题的目的、意义生物质原料作为地球上数量最大的可再生资源之一，逐渐受到人们的重视。