实验八不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳

实验八聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶一、实验目的１学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。

２掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板（及同盘）电泳的操作技术。

３掌握同工酶定义、理化性质的差异，了解过氧化物酶的染色原理。

４掌握过氧化物酶的活性的测定。

二实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂（即共聚体的N,N－甲叉双丙烯酰胺Bis）在加速剂（N,N,N',N'－四甲基乙二胺TEMED）和催化剂（过硫酸胺(NH4)4S2O8 简称AP）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。

（一）聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性１聚合反应聚丙烯酰胺是由Acr和Bis在催化剂（AP）或核黄素（C17H20O6N4）和加速剂（TEMDA）的作用下聚合而成的三维网状结构。

催化剂和加速剂的种类很多，目前常用的有２种催化体系：①AP-TEMED 属化学聚合作用②核黄素－TEMED 属光聚合作用２凝胶孔径的可调性及其相关性质①凝胶性能与总浓度及交联度的关系凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr与Bis之比：a:b<10 脆硬乳白交联度：a:b>100糊状易断②凝胶浓度与孔径的关系T（Acr和Bis总浓度）增加孔径减小移动颗粒穿过网孔阻力增加③凝胶浓度与被分离物分子量的关系分子量增加阻力增加移动速度减慢。

同时还与分子形状及分子电荷有关系。

在操作时，可以选用凝胶。

因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得满意的结果。

３试剂对凝胶聚合的影响水中金属离子或其他成分对凝胶电泳的电泳速度、分离效果等有影响。

（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）原理根据有无浓缩效应可分为：连续系统：电泳体系中由于缓冲液PH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场中主要靠电荷及分子筛效应。

不连续系统：电泳体系中由于缓冲液离子成分、PH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还有浓缩效应。

聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）一、目的要求（1）学习电泳原理和技术（2）学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离蛋白质技术二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。

聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。

具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。

血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳一般可分成12～25个组分。

因此适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果好。

聚丙烯酰胺凝胶作为电泳材料的特性人工合成聚丙烯酰胺凝胶的化学体系的组成及功能：Acr：丙烯酰胺Bis：甲叉双丙烯酰胺AP：过硫酸铵——化学催化剂TEMED：四甲基乙二胺——加速剂SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。

在含有强还原剂的SDS溶液中可形成SDS-蛋白质复合物。

由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。

从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用。

三、实验材料（一）试剂1、30%丙烯酰胺混合液（Acr:Bis 为29:1）称取丙烯酰胺（Acr）29g及甲叉丙烯酰胺（Bis）1.0g，用去离子水溶解并稀释至100ml，贮棕色瓶中于4℃保存，可用一个月。

2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液取1mol/L HCL溶液48ml、三羟甲基甲烷（Tris）36.6g，加双蒸馏水至80ml使其溶解，调pH至8.8，然后用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。

3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液取1mol/L HCL溶液48ml，Tris5.98g，加双蒸馏水至80ml，调pH6.8，用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。

4、Tris-甘氨酸电泳缓冲液称取Tris 6g、甘氨酸28.8g，加蒸馏水850ml，调pH至8.3，加蒸馏水到1000ml，4℃贮存。

分子生物学实验报告实验名称：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳班级：生工xxx姓名：xxx同组人：xxx学号：xxxx日期：xxxxSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1 引言SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是目前分离蛋白质亚基并测定其分子量的常用方法，为检测电泳后凝胶中的蛋白质，一般使用考马斯亮蓝（CBB）染色[1]。

本次实验的目的在于学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质的操作技术。

2 材料和方法2.1实验原理2.1.1 聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理2.1.1.1 性能聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化比较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。

通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在广泛的范围内变动，并且制备凝胶的重复性好。

由于纯度高和不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。

2.1.1.2 制备原理聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成。

聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。

本实验是用化学聚合。

化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵（AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂，最有效的加速剂是N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）。

在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合反应。

叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH时，常会延长聚合时间；分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用；一些金属也能抑制聚合；冷却可以使聚合速度变慢。

通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。

聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统，不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的Ornstein-Davis高pH碱性不连续系统，其浓缩胶丙烯酰胺浓度为4％，pH = 6.8，分离胶的丙烯酰胺浓度为12.5％，pH = 8.8。

分子生物学实验报告实验名称：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳班级：生工xxx姓名：xxx同组人：xxx学号：xxxx日期：xxxxSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1 引言SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是目前分离蛋白质亚基并测定其分子量的常用方法，为检测电泳后凝胶中的蛋白质，一般使用考马斯亮蓝（CBB）染色[1]。

本次实验的目的在于学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质的操作技术。

2 材料和方法2.1实验原理2.1.1 聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理2.1.1.1 性能聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化比较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。

通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在广泛的范围内变动，并且制备凝胶的重复性好。

由于纯度高和不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。

2.1.1.2 制备原理聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成。

聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。

本实验是用化学聚合。

化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵（AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂，最有效的加速剂是N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）。

在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合反应。

叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH时，常会延长聚合时间；分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用；一些金属也能抑制聚合；冷却可以使聚合速度变慢。

通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。

聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统，不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的Ornstein-Davis高pH碱性不连续系统，其浓缩胶丙烯酰胺浓度为4％，pH = 6.8，分离胶的丙烯酰胺浓度为12.5％，pH = 8.8。

聚丙烯酰胺凝胶电泳实验分析在很多地方看到大家都在讨论关于聚丙烯酰胺凝胶电泳的知识。

看了好多观点以后，不如自己做一个实验来分析。

更何况对于聚丙烯酰胺凝胶电泳分析必须要通过实验来验证观点。

下面就是关于聚丙烯酰胺凝胶电泳实验分析：明确实验目的：1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。

2.熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作过程。

3.了解聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点和应用范围。

了解实验原理：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂的作用下，聚合交联而成的含有酰胺基侧链的脂肪族大分子化合物。

聚丙烯酰胺凝胶具有三维网状结构，能起分子筛作用。

用它作电泳支持物，对样品的分离取决于各组分所带电荷的多少及分子大小。

此外，聚丙烯酰胺凝胶电泳还具有浓缩效应，即在电泳开始阶段，由于不连续pH梯度作用，将样品压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。

聚丙烯酰胺凝胶电泳分为垂直平板电泳和圆盘电泳，两者的原理完全相同。

由于垂直板形凝胶具有板薄、易冷却，分辨率高、操作简单、便于比较与扫描等优点，因而为大多数实验室采用。

聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率比纸电泳高得多，能检出10-9～10-12g样品，特别适合于分离和测定蛋白质、核酸等生物大分子化合物。

它除了能对生物大分子物质进行定性、定量分析外，还可用以测定分子量，且是一种较先进的测定分子量的方法。

不连续变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是使用最广泛的凝胶电泳。

不连续是指电泳的pH值不连续（样品浓缩胶缓冲液pH 6.8, 电极缓冲液pH 8.3, 分离胶pH 8.8）、凝胶不连续（一般分成样品浓缩胶和样品分离胶两层）。

变性是指样品蛋白经SDS和巯基乙醇作用后，所有蛋白质都解聚成为其构成亚基，并且都带上负电荷，形状都近似于长椭园棒状。

这种SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与园棒的长度也就是蛋白质的分子量有关。

SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离笵围取决于灌制凝胶时聚丙烯酰胺的浓度和交联度，二者决定凝胶分子筛的孔径大小，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺绝对浓度的函数。

实验名称：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告一、实验目的1. 了解SDS-PAGE实验的原理和方法；2. 掌握SDS-PAGE实验的操作流程；3. 分析不同蛋白质在SDS-PAGE中的分离情况；4. 对实验结果进行解读和总结。

二、实验原理SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种常用的蛋白质分离和分析技术。

其原理是利用SDS将蛋白质变性并赋予等电点，将蛋白质按照分子量大小在凝胶中进行分离。

通过电泳操作，蛋白质会根据其分子量在凝胶中移动，最终形成不同的条带，便于观察和分析。

三、实验步骤1. 准备样品：获取需要分析的蛋白质样品，并进行处理使其可以被SDS-PAGE分离；2. 制备凝胶：根据实验需要，配置聚丙烯酰胺凝胶，并在凝胶板中固定好；3. 样品加载：将处理好的蛋白质样品加载到凝胶槽中；4. 电泳分离：在设定好电压和时间的条件下，进行电泳操作，使蛋白质在凝胶中分离；5. 染色观察：将分离后的蛋白质用染色剂染色，然后观察分离的条带；6. 结果分析：根据实验结果，进行蛋白质的分析和解读。

四、实验材料与仪器1. 样品：蛋白质样品；2. 凝胶：聚丙烯酰胺凝胶；3. 电泳槽：用于进行SDS-PAGE电泳的设备；4. 电源：用于提供电泳操作所需电压的电源设备；5. 染色剂：用于染色观察蛋白质条带的染色剂。

五、实验结果与分析经过SDS-PAGE实验操作，观察到样品中不同蛋白质在凝胶中的分离情况。

根据不同分子量的蛋白质在凝胶中形成了明显的条带，条带的位置和密度反映了样品中蛋白质的分布情况。

通过染色观察和数据分析，可以得出样品中蛋白质的组成和含量。

六、实验结论SDS-PAGE实验是一种重要的蛋白质分析方法，通过实验操作可以对蛋白质样品进行分离和分析，从而了解样品的蛋白质组成和特性。

本次实验结果表明，SDS-PAGE可以有效地对蛋白质样品进行分离，为后续的分析和研究奠定了基础。

不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高的原因
不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高的原因如下：
1. 聚丙烯酰胺凝胶具有均一的孔隙结构，能够将待分离的DNA、RNA或蛋白质分子按大小分离。

这种凝胶的孔隙大小和形状可以通过调整聚合物交联程度、孔隙添加剂以及电场强度等方式进行调节，从而实现高精度和高分辨率的分离。

2. 不连续的凝胶结构可以避免样品分子在运动过程中的扩散和混合，从而使分离更为准确和精确。

与连续凝胶电泳相比，不连续凝胶电泳可以获得更高的分离效率，特别是在分离小分子或高度相似的分子时。

3. 不连续凝胶电泳具有更高的网络稳定性和耐久性，可以长期稳定地运行，从而确保分离结果的重复性和可靠性。

此外，不连续凝胶电泳还可以进行多重分离，即将同一个横向凝胶纵向切成若干块，每块分别进行不同物质的电泳分离，这样一次实验就可以达到多种物质的分离效果。

因此，不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高，可以用于高精度和高分辨率的DNA、RNA或蛋白质分离，是分子生物学、生物化学和医学等领域的重要实验技术。

不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳[实验目的]学习和掌握不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法和测定蛋白质相对分子质量的基本原理和实验技术。

[实验原理]SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的高级结构，强还原剂β-巯基乙醇能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。

当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。

若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

[器材与试剂]一、器材垂直板电泳槽、电泳仪（直流稳压）、电子天平、移液器、烧杯、量筒、离心管、灭菌tip头、大培养皿、漏斗、滤纸、镊子、玻棒、电炉二、试剂1、30%丙烯酰胺贮存液：29g丙烯酰胺和1g N,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于100ml热水中，验证其pH值不大于7.0。

置棕色瓶中，4℃保存。

2、1.5mol/L Tris（pH8.8）溶液3、10% SDS溶液4、10%过硫酸铵：新鲜配制5、TEMED溶液：4℃保存6、1.0 mol/L Tris（pH6.8）溶液7、2×样品溶解液：2%SDS，5%巯基乙醇，10%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01mol/L Tris-HCl （pH8.0）缓冲液。

8、5×Tris-甘氨酸电极缓冲液：每1000ml该溶液中，含15.1g Tris，94g甘氨酸和50ml 10%（W/V）SDS贮存液。

分子生物学实验报告实验名称：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳班级：生工xxx姓名：xxx同组人：xxx学号：xxxx日期：xxxxSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1 引言SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是目前分离蛋白质亚基并测定其分子量的常用方法，为检测电泳后凝胶中的蛋白质，一般使用考马斯亮蓝（CBB）染色[1]。

本次实验的目的在于学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质的操作技术。

2 材料和方法2.1实验原理2.1.1 聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理2.1.1.1 性能聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化比较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。

通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在广泛的范围内变动，并且制备凝胶的重复性好。

由于纯度高和不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。

2.1.1.2 制备原理聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成。

聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。

本实验是用化学聚合。

化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵（AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂，最有效的加速剂是N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）。

在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合反应。

叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH时，常会延长聚合时间；分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用；一些金属也能抑制聚合；冷却可以使聚合速度变慢。

通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。

聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统，不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的Ornstein-Davis高pH碱性不连续系统，其浓缩胶丙烯酰胺浓度为4％，pH = 6.8，分离胶的丙烯酰胺浓度为12.5％，pH = 8.8。