miRNA及其inhibitor转染方法

mirna inhibitor设计方法
设计miRNA抑制剂通常需要考虑以下几个方面的因素，这些因素涉及到miRNA的结构和功能：
1.miRNA序列和结构分析：首先，需要对目标miRNA进行详细的序列和结构分析。

这包括miRNA的碱基组成、稳定性、可能的结合位点等信息。

2.抑制剂设计：抑制miRNA的方法主要有两种，一是通过合成miRNA反义链，使其与目标miRNA发生碱基互补，形成双链结构；二是设计合成小分子化合物，通过与miRNA特定的结合位点相互作用，抑制miRNA的功能。

3.亲和力和特异性：设计的miRNA抑制剂需要具有较高的亲和力，以确保与目标miRNA 的结合强度。

同时，为了减少对非目标miRNA的影响，需要保证抑制剂的特异性。

4.化合物的稳定性：抑制剂需要在体内维持较长时间的稳定性，因此需要考虑化合物的生物稳定性和药代动力学。

5.细胞摄取和递送：要实现miRNA抑制的效果，设计的抑制剂需要能够有效地进入细胞，并在细胞内达到目标miRNA的浓度。

因此，适当的递送系统也是设计过程中需要考虑的因素之一。

6.生物学效果评估：在设计阶段后，需要进行体外和体内的生物学效果评估。

这包括在细胞水平上检测miRNA表达水平的变化，以及在动物模型中评估miRNA抑制剂的生物学效果和安全性。

总体而言，miRNA抑制剂的设计需要结合miRNA的结构和功能特点，利用合理的设计方法确保抑制剂在体内表现出良好的稳定性、特异性和生物学效果。

miRNA产品使用说明RN：R10034.5 产品简介micr ON™ miRNA mimic是miRNA模拟物，化学合成的成熟miRNA双链，即用型；micr OFF™ miRNA inhibitor是miRNA抑制物，化学修饰的成熟miRNA互补单链，即用型；micr ON™ miRNA agomir是特殊化学修饰的miRNA 激动剂，适用于细胞实验、动物实验，即用型；micr OFF™ miRNA antagomir是特殊化学修饰的miRNA 拮抗剂，适用于细胞实验、动物实验，即用型。

运输保存产品以冻干粉的形式，常温运输。

收到产品后，请于-20℃~-80℃保存，冻干粉可以稳定保存一年。

使用前瞬时离心，用RNase-free HO或灭菌ddH2O，配制成20μM储存液，分装保存，避免反复冻融（不超过5次）。

2表1 20μM储存液的配置参考0.25 0.5 1 2 5 20溶解体积(μl) 12.5 25 50 100 250 1000 注：如需进行高内涵筛选试验，可选择miRNA Library。

使用前须知为避免外界因素（包括酶，极端pH或者温度条件等）导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。

实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20℃~-80℃小心保存。

细胞实验方法：为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验的可靠性和可重复性，一般建议：1）转染实验中每个转染样品至少设置3个复孔；2）接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，且细胞在各孔的表面平均分布。

1. 转染浓度miRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。

锐博生物推荐的miRNA mimic初始浓度为50nM，miRNA inhibitor浓度为100nM，客户可根据实验具体情况优化转染浓度，优化的范围建议为10~200nM。

注：miRNA inhibitor往往需要用到较大的用量才能观察到较好的抑制效果，相当于miRNA mimic的几倍用量，这可能与miRNA inhibitor竞争性抑制的作用机制及作用效率有关。

注：1）不同细胞的生长速度不同，接种细胞的数量需依经验而定；2）每孔接种的细胞数量尽量相同，使细胞均匀分布。

b. 悬浮细胞：接种1×105~5×105个细胞至含有500μl完全培养基的24孔板。

2）转染步骤对于每个转染样品，请按以下步骤准备：a. 稀释mimic：用50μl 1X ribo FECT TM CP Buffer（v1）稀释1.25μl 20μM miRNA mimic储存液（v2），轻轻混匀，室温孵育5min。

b. 混合液制备：加入5μl ribo FECT TM CP Reagent（v3），轻轻吹打混匀，室温孵育0～15min。

注：1）请不要振荡，溶液可能会有浑浊，但不会影响转染；2）混合液可室温放置一段时间，但不宜超过24h。

c. 将ribo FECT TM CP混合液加入到443.75μl细胞培养基（v4）中，轻轻混匀。

注：混合液加入原细胞培养基，无需移除或更换。

d. （可选）进行其他必要的特殊处理（如加药处理）。

e. 将培养板置于适当的培养条件下培养24~96h（培养时间与实验目的相关）。

表2 使用ribo FECT TM CP转染miRNA mimic用量参考v1: ribo FECT CP Buffer (1X)； v2: 20μM miRNA mimic储存液； v3: ribo FECT CP Reagent； v4: 细胞培养基注： 1）*：实验示例用量参考。

2）表中数据仅供参考，对于部分细胞类型的转染试剂用量可进一步优化。

3）转染质粒时，转染试剂用量可优化至1μl (24孔板)。

3）效果检测miRNA mimic/inhibitor作用效果往往通过功能方面检测，转染完成后24~72小时均可进行检测，最佳检测时间与细胞类型及研究的miRNA有关。

以下为几种常用的miRNA效果检测方法：a. 使用qPCR，基因芯片，新一代测序等方法检测靶基因mRNA转录水平，甚至全基因表达图谱是否发生相应改变；b. 使用Western Blot，蛋白芯片等方法检测靶基因的蛋白水平是否发生相应改变；c. 检测细胞功能（细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移等）是否发生相应变化；d. 通过靶基因siRNA来确认miRNA mimic/inhibitor的作用；e. 通过与miRNA靶基因双荧光素酶报告载体（锐博生物可提供构建服务）共转来验证miRNA mimic/inhibitor的作用。

miRNA、miRNAmimics和miRNAinhibitor 展开全文
microRNA(miRNA)是真核细胞生物中一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，长度约为22bp。

miRNA首先在细胞核内转录出较长的初级miRNA（primary miRNA 。

pri-miRNA）,然后在在核内有Drosha加工成60-70bp的发夹状RNA，即前体miRNA（miRNA percuser,pre-miRNA）,在Exprotin-5复合物的帮助下被转运出细胞核，在胞质中被Dicer剪切成为成熟miRNA，随即被整合进RNA沉默复合物（RISC）中，与mRNA完全或不完全配对结合来调节基因表达。

miRNA mimics是化学合成的成熟miRNA模拟物。

miRNA agomir是经过特殊化学修饰的miRNA激动剂，转染至细胞后模拟内源性miRNA发挥作用。

miRNA mimics进一步增强內源miRNA的调控作用，降低细胞内蛋白表达量，进行功能获得行（gain-of-function）研究。

实验表明miRNA mimics在细胞和动物实验水平，都可发挥miRNA作用。

miRNA inhibitor是化学修饰的miRNA抑制物，通过特异的靶向抑制某个miRNA分子，可以削弱內源miRNA的金银沉默效应，提高蛋白的表达量，进行功能缺失行（loss-of-function）研究，可以用来筛选miRNA靶位点，筛选调控某一基因表达的miRNA，筛选影响细胞发育过程的miRNA。

mirna inhibitor作用机制Mirna Inhibitor作用机制Mirna Inhibitor是一种新型的RNA分子，它可以通过抑制microRNA（miRNA）的表达来调节基因表达。

miRNA是一类长度约为22个核苷酸的非编码RNA分子，它们通过与靶基因的3'非翻译区（3'UTR）结合来抑制基因表达。

miRNA在许多生物学过程中发挥着重要的调节作用，包括细胞增殖、分化、凋亡、代谢和免疫反应等。

Mirna Inhibitor的作用机制是通过与miRNA结合来抑制miRNA的功能。

Mirna Inhibitor是一种单链RNA分子，它的序列与miRNA 的互补序列相同。

当Mirna Inhibitor与miRNA结合时，它会阻止miRNA与靶基因的3'UTR结合，从而抑制miRNA的功能。

这种抑制作用可以通过多种方式实现，包括竞争性结合、miRNA降解和miRNA转运等。

竞争性结合是Mirna Inhibitor最常见的作用方式。

当Mirna Inhibitor与miRNA结合时，它会与miRNA竞争性地结合到靶基因的3'UTR上，从而阻止miRNA与靶基因的结合。

这种竞争性结合可以有效地抑制miRNA的功能，从而调节基因表达。

另一种作用方式是通过miRNA降解来实现。

当Mirna Inhibitor与miRNA结合时，它可以促进miRNA的降解，从而减少miRNA的表达量。

这种降解作用可以通过RNA酶的介导来实现，例如Dicer和Argonaute等。

最后一种作用方式是通过miRNA转运来实现。

当Mirna Inhibitor 与miRNA结合时，它可以促进miRNA的转运，从而减少miRNA 的表达量。

这种转运作用可以通过RNA结合蛋白的介导来实现，例如Exportin-5和Ran-GTP等。

Mirna Inhibitor是一种新型的RNA分子，它可以通过抑制miRNA 的表达来调节基因表达。

科研(kē yán)中的miRNA研究(yánjiū)方法总结microRNA(miRNA) 是一类(yī lèi)长度在22nt左右(zuǒyòu)的内源非编码小RNA，广泛存在于动物、植物(zhíwù)、病毒等多种有机体中。

1993年，Lee等人在秀丽新小杆线虫(C.elegans)中发现了控制着线虫时序性发育的lin-4。

2000年，Reinhart等发现了另一个具有转录后调节功能的小分子RNA：let-7。

随后的几年时间里，许多研究人员相继发现了这类RNA，并将这些具有时空表达特异性的非编码小分子RNA命名为microRNA(miRNA)。

从长的初级miRNA(pri-miRNA)到形成成熟的单链miRNA到与靶标RNA结合，至少需要四步：首先是由核糖核酸酶ⅢDrosha和DGCR8组成的复合物将初始miRNA 转录本（pri-miRNA）加工成miRNA前体（pre-miRNA）；接着由转运蛋白Exportin-5和Ran GTP酶将miRNA从细胞核转运到细胞质中；第三步是由另一种核糖核酸酶ⅢDrosha将miRNA前体剪切成成熟的miRNA双链，miRNA双链打开，其中一条进入到RNA诱导的沉默RISC复合体（RISC）中，该复合体还包含TarRNA结合蛋白（TRBP）；最终RISC复合体根据miRNA与靶标RNA的互补配对，对靶基因进行剪切，或者翻译抑制。

图 1 miRNA生物学调控过程（摘自文献8）miRNA通过作用于相应靶mRNA，参与细胞增殖、凋亡、分化、代谢、发育、肿瘤转移等多种生物学过程。

预测超过1/3的人类基因都是保守的miRNA靶基因。

近些年，随着科学研究的进展，大量的miRNA已经被鉴定出来，截至目前发现的人的成熟的miRNA有2578条，小鼠的有1908条。

虽然miRNA的数量很多，但大多miRNA的功能并不为人所知。

MicroRNA Inhibitor产品使用手册规格:5nmol*2(对照为2.5nmol*4)纯化方式:HPLC 纯化产品形式：干粉贮存条件：在-20℃或者-80℃保存期：1 年，在-20℃或者-80℃质量控制：PAGE 检测确定产品是准确分子量大小的单链的MicroRNA Inhibitor HPLC 纯化并分析单链的MicroRNA Inhibitor 纯度>95%●注意事项RNA inhibitors 在操作过程，如果有外源的核酸酶存在，RNA inhibitors容易发生降解。

在进行相关试验中，请带手套进行操作，尽量用无RNAase污染的试剂，试管，移液枪和枪头。

收到产品后尽快贮存在–20°C 或–80°C环境中。

●MicroRNA Inhibitor的重悬在最大转速为4,000 X g 的低速条件下离心EP 管，让MicroRNA Inhibitor 聚集在试管的底部。

1.轻轻的打开管盖.2. 5nmol加入DEPC水250 ul,配成20uM的储备液3.柔和的用移液枪吹打储备液5 次4.根据具体用量情况分装，避免多次冻融5.在重新贮存的时候注意密封好EP 管6.贮存在-80°C，以备使用●转染程序转染效率对不同的细胞株和不同的转染试剂是不同的。

我们建议miRNA inhibitor 的终浓度为15-100nM最优化的转染浓度最终还是需要通过试验来确定。

我们发现典型的试验中最佳的浓度范围是15-100nM，但是优化的浓度范围我们设定在1-100nM 之间。

A：转染试剂的推荐量，根据您订购的试剂不同应做适当的调整B：所显示的添加量是miRNA inhibitor 终浓度为30nM 的量。

由于最大miRNA inhibitor 活性的量在不同的细胞类型是有差异的，所以推荐您自行优化。

C 对细胞密度只是推荐值，不同的细胞株有一定的变化，主要看细胞的大小和生长的状况，一般来说我们推荐细胞融合度在30-70％为佳。

下面以Entranster-R4000试剂为例，说一下miRNA转染步骤（24孔板）
1.提前1天细胞种植
贴壁细胞：提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞汇合度（Confluence）在30％左右为宜，转染前全培养基总量为0.45ml。

悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。

如某细胞常规培养的细胞数是6×105，那么就用2×105的细胞进行转染。

2.转染过程
⑴取0.67ug(50pmol)的miRNA，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA
稀释液，终体积为25μl。

注意：无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。

⑵取1ul的Entranster TM-R4000，然后加入24ul无血清稀释液体，充分混匀，制成
Entranster TM-R4000稀释液，终体积为25μl。

室温静置5分钟。

⑶将Entranster TM-R4000稀释液和RNA稀释液充分混合（可用振荡器振荡或用加样
器吹吸10次以上）混合，室温静置15分钟。

转染复合物制备完成。

⑷将50μl转染复合物滴加到有0.45ml全培养基（可含10%血清和抗生素）的细胞
上，前后移动培养皿，混合均匀。

注意：对本试剂，采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。

⑸转染后6小时观察细胞状态，如状态良好可不必更换培养基，继续培养24-96小
时得到结果。

mirna inhibitor作用机制miRNA是一种重要的小分子RNA，它们在许多生物过程中起着调节基因表达的作用。

miRNA通过结合到靶基因mRNA的3'非翻译区域（3'-UTR）来抑制翻译或诱导降解，从而对基因表达进行负性调控。

因此，miRNA在调节细胞分化和生长，细胞周期，凋亡和肿瘤发生中起着重要作用。

miRNA的异常表达被发现在多种疾病中包括癌症，心血管疾病和神经系统疾病中。

miRNA调节的分子途径通常在疾病发生中表现出不同的表达模式，因此将miRNA作为治疗目标成为了一种备受关注的新型治疗策略。

miRNA抑制剂是一种新型的治疗手段，它可以通过抑制被过度表达的miRNA来治疗疾病。

miRNA抑制剂可以分为两种主要类型：miRNA antisense oligonucleotides（AMOs）和miRNA靶向的小分子化合物。

miRNA AMOs是由短链DNA和核苷酸模拟物构成的小分子，在靶标miRNA 5'端启动位点与miRNA互补配对并阻止其与靶mRNA的耦合。

AMO的结合还可以导致miRNA的降解。

miRNA靶向的小分子化合物也是一种重要的miRNA抑制剂。

这些小分子化合物通过与miRNA特定的结构域相互作用来具有选择性地抑制它们的生物活性。

这些小分子化合物在miRNA靶基因表达调节中的各种机制中发挥作用，包括阻止miRNA的成熟和靶mRNA的结合，以及调节miRNA生物合成途径中的信号传递。

miRNA抑制剂作用的主要机制是通过调节miRNA的生物功能。

具体来说，miRNA抑制剂可以促进miRNA的降解，阻止miRNA的成熟和抑制miRNA与靶mRNA的配对。

这些机制都会导致靶mRNA的表达增加，从而影响基因表达模式。

因此，miRNA抑制剂是一种具有潜力的新型治疗策略，可以通过干扰miRNA的调节作用来治疗多种疾病。

随着对miRNA及其抑制剂作用机理的进一步了解，在未来的治疗疾病中将有更广泛的应用潜力。

miRNA 靶基因3’UTR 质粒载体使用说明RN ：R10032.3产品简介miRNA 是一类具有调控功能的非编码小RNA ，主要通过与靶基因mRNA 3’UTR 完全或不完全互补配对而调控靶基因的表达。

pmiR-RB-Report ™载体是专门用来检测miRNA 作用的检测工具，将基因的3’UTR 区克隆至载体海肾荧光素酶基因(hRluc )下游位点，以海肾荧光素酶基因作为报告基因，以萤火虫荧光素酶基因(hLuc )作为内参基因，通过检测海肾荧光素酶活性的相对变化情况来鉴定miRNA 对该基因是否有调控作用。

载体图谱hRluc ：海肾荧光素酶基因，为报告基因； hLuc+：萤火虫荧光素酶基因，为内参基因； 3’UTR Region ：多克隆位点，基因3’UTR 连接位点； Amp r ：氨苄青霉素抗性，用于大肠杆菌筛选。

体积每管含量总含量pmiR-RB-Report™ Species-GeneName~100 ng/μl~50μl ~5μg ~10μg注：质粒可以直接用来实验，甘油菌可以进行质粒扩大提取。

运输保存产品一般以液体的形式常温运输。

收到产品后，请将载体及甘油菌于-20℃以下保存。

质粒可以直接用于实验，甘油菌可直接进行质粒扩大提取。

实验方法图2 pmiR-RB-Report TM 质粒载体使用方法图1 pmiR-RB-Report TM 载体图谱简图细胞转染为了降低由于细胞密度、转染效率、试剂用量等因素导致的孔间差异，保证实验的可靠性和可重复性，一般建议：a.转染实验中每个转染样品至少设置3个复孔；b.接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，并且细胞在各孔的表面平均分布。

1. 细胞类型与转染试剂：由于实验需要同时转染小分子RNA和质粒载体两种物质，因此，细胞类型、细胞状态和转染试剂是决定实验成败的关键因素，建议选择转染效率较高的细胞系进行实验，如293T，Hela，A549，而转染效率较低的细胞系不适合进行本实验的检测。

mmu-miR-125a-5p研究策略Standard 报价Standard 报价2ng 350 RMB 5ng 600 RMBmicr ON™ mmu-miR-125a-5pmimic2ng 300 RMB 5ng 500 RMBmicr OFF™ mmu-miR-125a-5pinhibitor,转染mmu-miR-125a-5p mimic(24孔板为例)1．联系锐博公司合成mmu-miR-125a-5p mimic和mmu-miR-125a-5p inhibitor;2．合成的2ng mmu-miR-125a-5p mimic用1000ul RNase-free water配制成20uM的储存液,分装成5ul每管放-30或-80冻箱冻存(mimic的工作浓度为50nM);3．转染前一天，胰酶消化细胞并计数1X105 c-kit-，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。

细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中;4．对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释1.25ul mmu-miR-125a-5p mimic 存储液;5．对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ无血清培养基稀释1μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。

Lipofectamine 2000稀释后室温5分钟（在30分钟内同稀释的RNA混合。

室温时间过长会降低活性。

）注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。

如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合6．混合稀释的RNA（第4步）和稀释的Lipofectamine 2000（第5步）。

在室温保温20分钟。

注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。

复合物可以在室温保持6小时稳定7．直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀,加入500ul培养基,混匀。

miRNA产品使用说明RN：R10034.5 产品简介micr ON™ miRNA mimic是miRNA模拟物，化学合成的成熟miRNA双链，即用型；micr OFF™ miRNA inhibitor是miRNA抑制物，化学修饰的成熟miRNA互补单链，即用型；micr ON™ miRNA agomir是特殊化学修饰的miRNA 激动剂，适用于细胞实验、动物实验，即用型；micr OFF™ miRNA antagomir是特殊化学修饰的miRNA 拮抗剂，适用于细胞实验、动物实验，即用型。

运输保存产品以冻干粉的形式，常温运输。

收到产品后，请于-20℃~-80℃保存，冻干粉可以稳定保存一年。

使用前瞬时离心，用RNase-free HO或灭菌ddH2O，配制成20μM储存液，分装保存，避免反复冻融（不超过5次）。

2表1 20μM储存液的配置参考0.25 0.5 1 2 5 20溶解体积(μl) 12.5 25 50 100 250 1000 注：如需进行高内涵筛选试验，可选择miRNA Library。

使用前须知为避免外界因素（包括酶，极端pH或者温度条件等）导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。

实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20℃~-80℃小心保存。

细胞实验方法：为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验的可靠性和可重复性，一般建议：1）转染实验中每个转染样品至少设置3个复孔；2）接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，且细胞在各孔的表面平均分布。

1. 转染浓度miRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。

锐博生物推荐的miRNA mimic初始浓度为50nM，miRNA inhibitor浓度为100nM，客户可根据实验具体情况优化转染浓度，优化的范围建议为10~200nM。

注：miRNA inhibitor往往需要用到较大的用量才能观察到较好的抑制效果，相当于miRNA mimic的几倍用量，这可能与miRNA inhibitor竞争性抑制的作用机制及作用效率有关。

进技术，成功开发出国际一流品质miRNA研究工具：micrONTM miRNA agomir和micrOFFTM miRNA antagomir。本产品采
用特殊化学修饰和末端标记技术，增加体内细胞的吸收作用，提高其抵抗RNA酶降解的能力；经高度脱盐处理，降低毒副
作用，使其在动物实验中操作简单，且发挥稳定和高效的作用。
实验方法与结果
6周龄的卵巢切除小鼠连续三天尾静脉注射micrOFFTM antagomir-2861（80 mg/kg体重)，再在第4天、第3周及第6 周收集股骨检测HDAC5蛋白表达水平及骨形成相关指标。
尾静脉注射antagomir-2861（80mg/kg体重）
6周龄OVX小鼠
1天
2天
实验结果：
2天 测心电图
3天 测心电图
4天
……
14天
测心电图
……
测心电图
实验结果：
A

B
图2 经Northern Blot检测，通过尾静脉注射antagomir-16，小鼠的肝、肾、 肺、心脏、骨骼肌、皮肤、肾上腺、卵巢、小肠、结肠、脂肪及骨髓中的 miR-16表达均受到抑制。B：
图3 注射antagomir-328后，小鼠体内miR-328表达水平降低且房颤程度下降，而注射对照（不配对）的 antagomir则无此效果。
工具 miRNA mimic miRNA inhibitor miRNA agomir
miRNA antagomir
miRNA病毒表达载体
表一 miRNA功能研究常用工具比较
功能 模拟高表达miRNA 竞争性抑制miRNA 模拟高表达miRNA
竞争性抑制或 特异性降解内源miRNA
高表达miRNA

m i R N A及其i n h i b i t o r转染方法-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1miRNA及其inhibitor转染方法1 对mimics、mimics control、inhibitor、inhibitor control进行稀释和分装（终浓度为100 nmol/μl）。

（1）Mimics加入250 μl DEPC处理的水；（2）Mimics control加入125 μl DEPC处理的水；（3）inhibitor加入250 μl DEPC处理的水；（4）inhibitor control加入125 μl DEPC处理的水；对以上进行分装：mimics 20 μl每管，mimics control 10 μl每管，inhibitor 20 μl每管，inhibitor control 10 μl每管。

分装后于－80 ℃保存。

2经过调整，细胞状态较好。

晚上铺细胞，4个60 mm培养皿，每皿×105细胞。

做好标记，（1）为mimics（2）为mimics control（3）为inhibitor（4）为inhibitor control。

3 上午八点对昨天晚上的细胞进行转染。

（1）a 用500 μl opti-MEM稀释20 μl mimics，作用5 minb 用500 μl opti-MEM稀释20 μl mimics control，作用5 minc 用500 μl opti-MEM稀释20 μl inhibitor，作用5 mind 用500 μl opti-MEM稀释20 μl inhibitor control，作用5 min（2）a 用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 minb用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 minc 用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 mind 用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 min（3）分别将（1）、（2）对应的a、b、c、d混合，轻轻吹打均匀后室温作用20 min。

HiPerFect转染试剂的使⽤在做miRNA的相关实验中，在验证靶基因⽅⾯，通常是向靶细胞转染miRNA mimics，或者是构建稳定过表达的miRNA的细胞株，然后做WB即可。

我的靶细胞是RAW264.7，但向这种细胞株转染miRNA mimics时，使⽤lipo2000或lipo3000的效率没那么⾼，不太容易做出结果（⽂献中有⼈使⽤的，效果很好，但我实验中总是做不出来）。

后来在QIAGEN官⽹上搜到了⼀个转染试剂，HiPerFect，看介绍这个转染试剂是专门⽤于转染miRNA的。

以下是实验流程，具体实验我还没做，只是翻译了说明书中的内容。

1. 将2.5x10e5个RAW264.7细胞铺在6孔板中，培养基体积为2.3mL，含FBS与双抗。

2. 转染时，将150ng的miRNA稀释到100uL的不含⾎清的培养基中（通常使⽤OPTI-MEN培养基），如果是miRNAinhibitor，剂量增加10倍，使miRNA的终浓度为5nM，这个浓度根据实验⽽定，⽂献中使⽤lipo2000或3000转染miRNA mimcs时的终浓度是20nM-100nM，但QIAGEN的说明书中提到，这个转染试剂的优点在于能在低浓度⽔平上进⾏miRNA的转染。

加⼊12uL的HiPerFect到OPTI-MEM中，混匀。

说明书中还提到，在正式实验前，最好根据⾃⼰实验室的条件与靶细胞，优化⼀下剂量。

miRNA mimics的储备浓度通常是20uM，如果要使终浓度为100nM，那么就要加10uL的储备液。

3. 在常温下孵育5到10minj。

4. 将上述的转染复合物逐滴加到6孔板中，轻轻混匀。

5. 将细胞培养板放到孵箱中，在24到72⼩时后检测基因表达量（我觉得等细胞长到80%密度的时候就⾏），如果细胞数⽬过少，中间记得更换新培养基。

以下是说明书中提供的参考数据（6孔板的⼀个孔）：。

miRNA常用实验方法一、miRNA的检测方法miRNA的realtime-PCR检测方法1、realtime-PCR引物设计miRNA realtime-PCR引物设计方法：1）stem-loop RT引物设计：基于通用的茎环结构，只需要按照不同的miRNA序列修改最末端6个碱基即可。

通用茎环结构序列为：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC 例如设计miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU）的RT引物，只需在通用茎环序列后架上miRNA3’末端的6个碱基的反向互补序列，即GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC ATACAT2）realtime 上游引物设计：miRNA序列除去3’端6个碱基的剩余部分作为上游引物，如miR-1的上游引物为(注意把U改为T)：TGGAATGTAAAGAAGT.检查引物的Tm值（一般参考DNAMAN），如果Tm值较低，则在5’端加GC使Tm值接近60度。

因此miR-1的上游引物可设计为：GCGCTGGAATGTAAAGAAGT，61.4度。

3）下游引物是通用的，序列为GTGCAGGGTCCGAGGT。

4）引物设计好后，需要通过预试验检测引物的特异性。

一般需要做溶解曲线来检测引物的特异性；同时最好将PCR产物进行电泳检测产物是否单一（因产物长度很小，需要3%以上的琼脂糖胶）。

2、miRNA反转录miRNA的反转录与一般基因的反转录过程基本相同。

因为其产物很短，用最普通的逆转录酶即可。

我们一般使用的是TIANGEN的MLV，逆转录体系为：RNA 500ng~2ug5xbuffer 2uldNTP 0.25ulDDT 0.25ulRRI 0.25ulMLV 0.25ulRT primer 0.5ulH2O(RNase free) 补至10ul程序为（PCR仪中通常命名为CTFRT）16度，30min；42度，60min；85度，5min；4度，hold。

miRNA常⽤实验⽅法miRNA常⽤实验⽅法⼀、miRNA的检测⽅法miRNA的realtime-PCR检测⽅法1、realtime-PCR引物设计miRNA realtime-PCR引物设计⽅法：1）stem-loop RT引物设计：基于通⽤的茎环结构，只需要按照不同的miRNA序列修改最末端6个碱基即可。

通⽤茎环结构序列为：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC 例如设计miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU）的RT引物，只需在通⽤茎环序列后架上mi RNA3’末端的6个碱基的反向互补序列，即GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC ATACAT2）realtime 上游引物设计：miRNA序列除去3’端6个碱基的剩余部分作为上游引物，如miR-1的上游引物为(注意把U改为T)：TGGAATGTAAAGAAGT.检查引物的Tm值（⼀般参考DNAMAN），如果Tm值较低，则在5’端加GC使Tm值接近60度。

因此miR-1的上游引物可设计为：GCGCTGGAATGTAAAGAAGT，61.4度。

3）下游引物是通⽤的，序列为GTGCAGGGTCCGAGGT。

4）引物设计好后，需要通过预试验检测引物的特异性。

⼀般需要做溶解曲线来检测引物的特异性；同时最好将PCR产物进⾏电泳检测产物是否单⼀（因产物长度很⼩，需要3%以上的琼脂糖胶）。

2、miRNA反转录miRNA的反转录与⼀般基因的反转录过程基本相同。

因为其产物很短，⽤最普通的逆转录酶即可。

我们⼀般使⽤的是TIANGEN的MLV，逆转录体系为：RNA 500ng~2ug5xbuffer 2uldNTP 0.25ulDDT 0.25ulRRI 0.25ulMLV 0.25ulRT primer 0.5ulH2O(RNase free) 补⾄10ul程序为（PCR仪中通常命名为CTFRT）16度，30min；42度，60min；85度，5min；4度，hold。