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自体吞噬在细胞死亡中的角色

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进行探讨 。 一 、细胞死亡 细胞死亡通常分为“程序性死亡”和“坏死”。传
统意义上的“坏死”用于解释多种细胞死亡现象 ,即 细胞受到不同外界刺激时在死亡过程中产生的不同 生理应答 。1995 年 ,Zakeri 等是这样定义“坏死”的 : “这个过程必须是猛烈的 ,并且能快速地使细胞失去 主要功能 ,并最后使细胞无法保持内部稳定”。坏死 是一个被动过程 。与坏死不同 ,程序性死亡的主要 功能是去除一些已不再需要的“非必需”细胞 ,如生 物体在发育过程的特定阶段会固定的失去一些细 胞 。而且 ,程序性死亡是一个主动过程 ,需要从头 进 行 基 因 转 录 和 表 达 。在 脊 椎 动 物 和 非 脊 椎 动 物的发育过程中 ,程序性死亡是一种非常普遍的 现象 。
4 Jeong D. Long2term culture and transplantation of murine testic2 ular germ cells. J Androl , 2003 ,24 :661～669.
5 Tanaka A , Nagayoshi M , Awata S , et al. Completion of meiosis in human primary spermatocytes through in vitro cocul2 ture with Vero cells. Fertil Steril , 2003 , 79 :795～801.
7 Pellegrini M , Grimaldi P , Rossi P , et al. Developmental ex2 pression of BMP4/ ALK3/ SMAD5 signaling pathway in the mouse testis : a potential role of BMP4 in spermatogonia differentiation. J Cell Sci , 2003 , 116 :3363～3372.
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自体吞噬泡中的内容物和内膜[4] (图 1) 。在整个自 体吞噬过程中 ,细胞质和细胞器都受到破坏 ,最明显 的是线粒体和内质网受损 。虽然自体吞噬并不直接 破坏细胞膜和细胞核 ,但是有证据表明 ,在最初断裂 或消化后 ,细胞膜和细胞核会最终变成溶酶体以消 化和分解自身 。
性死亡在某些昆虫组织的胚胎变态发育过程中是一 种常见的细胞程序性死亡事件 。酵母的自体吞噬突 变体不能形成孢子 ,表明自体吞噬对于发育过程中 的细胞重排非常重要 。
当前 ,人们把细胞程序性死亡主要归纳为三类 : 类型 I 是经典意义上的细胞程序性死亡即凋亡 ;类 型 II 是自体吞噬 ,其特征是通过早期激活溶酶体形 成自体吞噬细胞 ,最终使细胞走向死亡 ;类型 III 是 一种不常见的死亡方式 ,其特征是发生非溶酶体化 裂解 。
国3 家 自 然 科 学 基 金 ( 30270426) 和 北 京 市 自 然 科 学 基 金 (7032026) 资助课题 △通讯作者
2 Yan W , Suominen J , Toppari J . Stem cell factor protects germ cells from apoptosis in vitro. J Cell Sci , 2000 , 113 :161～168.
9 Kanatsu2Shinohara M , Ogonuki N , Inoue K, et al. Long2term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells. Biol Reprod , 2003 ,69 :612～616.
细胞在程序性死亡时所发生的一系列生物事件 和形态变化是由 Kerr 等首先报道的 ,主要特征是 : 细胞质发生凝集并与相邻细胞发生分离 ;核膜附近 的染色体发生早期凝集 (有时像月牙形) ;产生称作 “凋亡小体”(apoptotic bodies) 的细胞碎片 ,并最终被 邻近细胞吞噬 。这种对细胞程序性死亡的定义与凋 亡相同 ,而且目前认为细胞凋亡的特征还包括与核 膜相邻的染色体降解形成长约 200bp 的 DNA 片段 , 然后被邻近的细胞包被并吞噬 。但是另一些研究表 明 ,在细胞程序性死亡过程中存在多种不同的形态 学变化和生化反应 。如在小鼠的胸腺中 ,当 T 细胞 进行负选择时的死亡方式 ;以及在蛾 Manduca Sexta 的变 态 末 期 , 其 节 间 肌 肉 ( intersegmental muscles , ISMs) 的丢失方式 。Lawrence 等在比较这两种细胞 程序性死亡模型时发现 ,它们都需要基因的重新转 录和表达 ,但却属于两种不同的死亡方式 。T 细胞 的死亡方式属于凋亡 ,其特征是细胞膜聚集成小泡 和染色体 DNA 断裂成核小体片段 。而这些特征却 没有出现在 ISMs 中 。相反 ,ISMs 的细胞膜发生了褶 皱 ,核变得致密并保留了高度有序的基因组 DNA 。 对于这一结果的解释有两种 : (1) 凋亡可能包括各种 不同的步骤 ,而 T 细胞和 ISMs 的死亡方式表明了此 通路存在两种末端 ; (2) ISMs 并不通过凋亡 ,而是通 过另一种机制死亡的 。由于在 ISMs 中检测不到任 何一种与凋亡有关的形态或生化变化 ,因此更支持 后一种推断 。Palfia 等利用 quantitative morphology 技 术研 究 并 描 述 了 在 小 鼠 胰 腺 中 由 长 春 花 碱 ( vin2 blastin ,VBL) 诱导的细胞死亡过程 ,提出自体吞噬属 于细胞程序性死亡中的一类 。这种类型的细胞程序
10 Feng LX , Chen Y, Dettin L , et al. Generation and in vitro differentiation of a spermatogonial cell line. Science , 2002 , 297 :392～395.
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3 Clifton RJ , O Donnell L , Robertson DM. Pachytene spermato2 cytes in co2cultre inhibit rat Sertoli cell synthesis of inhibin beta B2subunit and inhibin B but not the inhibin alpha2subunit. J En2 docrinol , 2002 , 172 :565～574.
二 、自体吞噬 自体吞噬过程是一个吞噬自身细胞质蛋白并使 其包被进入囊泡的过程 。主要分为三种类型 :巨型 自体吞噬 (macroautophagy) ,微型自体吞噬 (microau2 tophagy) 和分子伴侣介导的自体吞噬 (chaperon2medi2 ated autophagy) 。其中 ,巨型自体吞噬主要负责降解 细胞内稳定并永久存在的蛋白质 ,产生氨基酸以维 持细胞在缺乏营养时的生存 。通常如没有特别说 明 ,这里术语“自体吞噬”是指巨型自体吞噬 。自体 吞噬的一个显著特征是“自体吞噬泡”( autophagic vacuoles , AVs) 的形成 。自体吞噬是由于氨基酸含 量减少而产生并受到激素的控制 、糖原的促进和胰 岛素的抑制 。通过检测线粒体 、过氧化酶体 、核糖 体 、细胞微粒中的糖原或内质网片段等是否形成 AVs ,可以断定细胞是否发生自体吞噬 。传统的检 测方法是使用亲脂性荧光弱碱 (fluorescent lipophilic weak bases) 如 LysoTracker Red 。最近 ,有一种荧光染 料 monodansylcadaverine (MDC) ,在体内和体外均能 鉴别 AVs ,因此就成为一种 AVs 的特异性标记物验条件下实现 ,因此到目前为止 ,对自体吞噬的机 制还不是很了解 。研究主要集中在酵母及其它重要 的单细胞真核生物 ,而对植物和哺乳动物细胞中的 自体吞噬过程的了解则更少 。尽管对自体吞噬具体 过程的了解还需要大大加强 ,但是人们已经勾勒出 自体吞噬过程的大致轮廓 :细胞质中的线粒体等细 胞器首先被称为“隔离膜”的囊泡所包被 ,这种“隔离 膜”主要来自于内质网和高尔基体[3] ;囊泡最终形成 双层膜结构 ,即自吞噬体 (autophagosome) ,也称之为 初始自体吞噬泡 (initial autophagic vacuoles , AVi) ;自 吞噬体与包内体融合形成中间自体吞噬泡 (interme2 diate autophagic vacuoles , AV i/ d) ; 最终自体吞噬泡 的外膜与溶酶体融合形成降解自体吞噬泡 ( degrad2 ing autophagic vacuoles , AVd) ,由溶酶体内的酶降解
8 Tesarik J , Mendoza C , Greco E. In vitro culture facilitates the selection of healthy spermatids for assisted reproduction. Fertil Steril , 1999 ,72 :809～813.
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自体吞噬在细胞死亡中的角色 3
徐振宇1 ,2 李 强1 李悦欣1 刘 爽1 于常海1 , △
(1 北京大学神经科学研究所 ,北京 100083 ; 2上海交通大学生命科学学院 ,上海 200240)
摘要 一直以来人们认为自主性细胞死亡就是凋亡 。然而 ,最近的研究表明 ,自主性细胞死亡不仅 包括凋亡 ,还包括自体吞噬 。自体吞噬通过与凋亡不同的降解机制 (膜包被降解) 和分子机制 (特定 基因的激活) ,使细胞在某些特殊环境如饥饿 、发育 、分化等条件下自主死亡 。在自主性细胞死亡 中 ,自体吞噬与凋亡是两个既相互独立又紧密相关的过程 。对自体吞噬机制的了解 ,必将为自主性 细胞死亡机制的阐明及其相关疾病的治疗提供新的思路 。 关键词 自体吞噬 ; 自主性细胞死亡 ; 凋亡 中图分类号 R338

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细胞自噬检测的具体步骤及方法

细胞自噬检测的具体步骤及方法

细胞自噬检测的具体步骤及方法一、自噬体介绍自噬（Autophagy），或称自体吞噬，是一个涉及到细胞自身结构通过溶酶体机制而被分解的过程，该过程是一个受到紧密调控的步骤，帮助细胞产物在合成、降解以及接下来的循环中保持一个平衡状态。

细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个扁平的类似“脂质体”样的膜结构，称为Phagophore。

随着Phagophore不断延伸，将胞浆中的细胞器等成分，全部包裹住成为密闭的结构，称为“自噬体（autophagosome）”。

自噬体形成后，可与溶酶体融合，自噬体中的内容物随即被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。

自噬信号通路：二、自噬研究策略和方法正常细胞基础水平自噬活性比较低，对自噬研究通常需要进行人工调节和干预，常用药物有：1、自噬诱导剂a) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激；b) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）；c) Earle's平衡盐溶液：制造饥饿；d) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂；e) Rapamycin：mTOR抑制剂；f) Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂。

2、自噬抑制剂a) 自噬抑制剂3-Methyladenine（3-MA）：(Class III PI3K) hVps34 抑制剂；b) Bafilomycin A1：质子泵抑制剂；c) 溶酶体抑制剂Hydroxychloroquine（羟氯喹）。

3、自噬检测1) 透射电镜；电镜作为自噬检测的金指标。

由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下观察不到自噬体的形成，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。

细胞凋亡、自噬、坏死

细胞凋亡、自噬、坏死


束生命的过程。从形态学上看，首先细胞变圆，随即与周围细胞脱离；细胞失去
微绒毛，胞浆浓缩，内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合，核染色质密度增高，凝
聚在核膜周边；然后核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体聚
集在一起，被反折的细胞膜包围。从外观上看，细胞表面产生了许多泡状或芽状
突起；接着这些突起逐渐分隔，形成单个的凋亡小体(apoptotic body)；最后凋亡
一、细胞凋亡、自噬、坏死概念
细胞死亡是指细胞因受严重损伤而累及胞核时，呈现代谢停止、结构破坏和
功能丧失等不可逆性变化，其一般分为程序性细胞死亡和非程序细胞死亡，细胞
凋亡(apoptosis)和自噬(autophagy)属于前者，细胞坏死(necrosis)属于后者。
细胞凋亡是一个主动的通过调控一系列基因的活化和表达等使细胞自动结
植物）中，为细胞生长代谢提供必要的大分子物质和能量，并清除细胞内过剩或
有缺陷的细胞器。
细胞坏死是一个被动的因极端的物理化学因素或严重的病理性刺激引起的
细胞损伤和死亡。细胞坏死的结局与细胞凋亡类似，坏死过程中细胞膜通透性增
高，致使细胞肿胀，细胞器变形或肿大，染色质随机降解，早期核无明显形态学
变化，最后细胞破裂；另外坏死的细胞膜发生渗漏，导致细胞内容物释放到胞外，
细胞坏死
四、检测方法 细胞凋亡检测方法在之前已经讲过，此处就不列举了。 细胞自噬检测方法： 1.电镜观察：在透射电子显微镜下，可以观察到自噬的特征性变化即自噬泡及自 噬溶酶体形成的全过程．首先在肿胀变形的细胞器周围出现双层膜空泡状结构， 继而包裹待降解物质形成自噬体，随后与溶酶体融合形成自噬溶酶体
被 双 层 膜 结 构 的 变形或肿大
自噬泡包裹，最终
2016年诺贝尔生理学或医学奖自体吞噬的机制解读

2016年诺贝尔生理学或医学奖自体吞噬的机制解读


在机体感染后，自噬能够消灭外来入侵的细菌和病毒，而且自噬对于胚胎发育和细胞分化也很关键，细胞还能够利用自噬来消除损伤的蛋白质和细胞器，这种细胞内部的质量控制机制对于应对老化带来的副作用也发挥着至关重要的作用。
干扰自噬作用或许和老年人患帕金森疾病、2型糖尿病及其它机体障碍直接相关，自噬基因的突变往往也会引发遗传性疾病的发生，干扰自体吞噬过程或许会诱发机体癌症发生，如今研究者需要进行更为深入的研究来开发新型靶向作用自噬作用的疗法来治疗多种类型的疾病。
eating）。
20世纪50年代中期，科学家门观察到了一种新型特殊的细胞区室，名为细胞器，细胞器中含有多种酶类能够消化蛋白质、碳水化合物和脂质；这种特殊的细胞区室被看做是溶酶体，其能够发挥降解细胞组分的重要作用。1974年来自比利时的科学家Christian
de Duve因发现了溶酶体而获得了当类的酵母突变体，同时通过使得细胞饥饿来刺激自体吞噬作用的发生，结果非常惊人！随着时间过去，细胞液泡中慢慢充满了小型的囊泡结构，而且这些囊泡结构并不会被降解；这些囊泡结构就是自噬体，而且研究者的实验证明了在酵母细胞中的确存在自体吞噬过程，尽管该过程非常重要，如今Yoshinori
20世纪60年代，随着科学研究的深入，科学家们又有了新的发现，他们在溶酶体内部有时候能够发现细胞组分甚至是整个细胞器，而细胞似乎有一种策略能够将大型的“货物”运输到溶酶体中；自体吞噬这种概念是20世纪60年代提出来的，当时科学家们首次观察到细胞能够通过将自身内容物裹入到膜结构中来破坏内容物，从而形成袋装的囊泡结构，这种囊泡结构能够被运输到再循环小泡结构中进行降解，这种小泡结构称之为溶酶体，研究这种现象的困难性意味着到现在为止科学家们对此知之甚少，直到20世纪90年代早期研究者Yoshinori
细胞自噬与肺癌关系研究进展

细胞自噬与肺癌关系研究进展

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综述
临床肺科杂志 2011年 6月 第 16卷第 6期
细胞自噬与பைடு நூலகம்癌关系研究进展
刘畅 综述 郝淑玲 于忠和 审校
多细胞生物生命 过程中细胞死亡有程序性和非程序性之 分, 后者即坏死。程序性细 胞死亡 按其发 生机制不 同可以 分 为凋 亡、自 噬 性 细 胞死 亡、P araptos is、细 胞 胀 亡 等 [ 1]。 自 噬 ( au tophagy)现象是一种高度 保守的 细胞行为, 几 乎存在 于所 有的物种, 构成了从简单的单细胞生物、植物到哺乳动物细胞 中广泛存在着的降解 - 再循 环系统 的重要组 成部分, 并 且是 完整细胞器 和大 分子 蛋白 降解 的主 要途 径 [ 2] 。自噬 的失 调 和肿瘤的发 生、发展、转 归关 系密 切 [ 3] 。肺 癌细 胞自 噬性 死 亡可能成为肿瘤治疗的新靶点 。现就细 胞自噬及其与肺癌关 系的研究进展作一综 述。
三、自噬与肺癌
肺癌是发病率、死亡率较高的恶性肿瘤, 在其发生和发 展 过程都有自噬 参 与。为能 更好 的研 究细 胞自 噬与 肺癌 的 关 系, Jerry JJ. [19]等对 小鼠 胚胎 成纤维 细胞 (M EF s)、人 肺癌 细 胞 H460和人脐静脉内皮细胞 ( HUVEC s)进行培养, 并观察 了 某些药物, 如自噬抑制剂 3-甲基腺嘌呤的作用, 为通 过靶向自 噬途径治疗肺癌奠定了基础。
调控细胞自噬的信 号蛋白 有很多, 其中 相对比 较清楚 的 是磷脂酰 肌 醇 ( - 3 ) 激酶 ( phosphatidy linosito l 3-kinase, P I3) 和哺 乳类 动物 雷帕 霉素 靶蛋 白 ( m amm a lian ta rget of rapamyc in, mTOR ) 信号通 路。 P I3K 对 于早 期吞 噬泡 的形 成至 关 重 要, 而 mTOR 则对吞噬泡的形 成及成 熟起抑 制作用 [ 7] 。当 细 胞处于氨 基 酸 饥 饿、营 养 缺 乏 或 生 长 因 子 去 除 时, 细 胞 的 mTOR 就会受到抑制, 从而发生自吞噬。 型 P I3K 可催化 多 肽 P td Ins生成 P td lns( 3) P, 后 者为自 噬体 核化 阶段所 必需 的 脂类物质 [8] 。与 型 P I3K 相反, 型 P I3K 的活化 可诱导 自 噬。 3- 甲 基腺 嘌 呤 ( 3-m ethyladenine, 3-M A ) 是 典 型 的 型 PI3K 抑制 剂, 可阻断自噬体的形成。另外, 渥曼青 霉素 ( wor-t mann in)、LY 294002等对 型 P I3K 也 有抑 制作 用, 但 因还 能 同时抑制 I型 P I3K, 专一性较差 [ 9] 。